赵光义蹂躏小周后的一幅画

首都师范大学生命科学学院实验报告课程名称植物生理实验实验时间2010331成绩姓名唐倪文班级_3学号1090800032实验目硝酸还原酶活性的测定一、实验原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于NO使之还原为NO。NQ-+NADH+H+—NO2-+NAD++H2O产生的NO可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。因此，测定反应液中NO含量的增加即明酶活性的大小。NO含量的测定----磺胺法NO2-与磺胺和-萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物，用比色法在520nm下读取光密度值。二、实验用品：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗仪器和用具：722型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液枪，tip头(两种规格：1000卩I，200卩I)三、实验步骤分别配制反应液于小烧杯中0.1M磷酸缓冲液5ml+蒸馏水5ml0.1M磷酸缓冲液5ml+0.2MKNQ5mlNO2-的获得称取新鲜叶片0.5g共四份,剪成小片，分别置于小烧杯内的反应液中。在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部，溶液即可渗入组织内取代其中的空气，内部产生的NO可渗透到外部溶液中。将小烧杯转到30T温箱，使其不见光，保温20min。用5卩g/mlNaNO2母液配制梯度溶液5、4、3、2、1、0.5、0.1、0卩g/ml。吸取不同浓度的NaNOml于试管中，加入磺胺试剂2ml及a-萘胺试剂2ml，混合均匀，在60C水浴中保温20min,于比色杯中，在520nm下进行比色，读取光密度，然后做出光密度一浓度曲线，以光密度为纵坐标，NaN染度为横坐标。具体步骤及结果如下表和下图所示。试剂管号12345678NaNO母液(ml)00.020.10.20.40.60.81.0蒸馏水（ml）10.980.90.80.60.40.201%磺胺(ml)2222222：20.2%a-萘胺(ml)22222222每管亚硝酸氮含量（卩g）00.10.51.02.03.04.05.0每管NaNO浓度（卩g/ml）00.10.51.02.03.04.05.0光密度00.0150.0520.1040.2020.3020.3960.4930.665o.ao.10光密股値-亚晞睚钠浓度....01.02.0£04.05,0业硝釀钠議度6.0y=0,0994KRa二0.9996*光密度值—线性胱密庫值;标准曲线:5.吸取反应液各1ml于试管中加入磺胺和-萘胺各2ml,60C水浴20min,生成粉红色化合物.用比色法在520nm下读取光密度值，从标准曲线上查得NO的含量,结果如下表。小麦幼苗兀全培养液缺N培养液KNOHOKNOHO小麦鲜重（g）0.510.510.490.48光密度0.1780.1760.0650.039亚硝酸钠浓度（卩g/ml）1.7911.7710.6540.392亚硝态氮含量（卩g）1.7911.7710.6540.392酶活性105.39104.1840.0424.50计算酶活性,以每小时每克鲜重所产生的NO微克数表示(NQ-/h.g)x(pg)xV1(ml)V2(ml)样品中醸活性=NOrpgFwg-^hO样品鲜童(g)X酶反应时间(h)公式中：工一从标准曲线查出反虫液中亚硝态氮总量(hr)归一提取酶时加入的缓冲液体积51)V2—K反应时加入的酶液体积(till)完全培养液，KNQ酶活性=[(1.791/1)*10]/[0.51*(20/60)]=105.39完全培养液，H20酶活性=[(1.771/1)*10]/[0.51*(20/60)]=104.18缺N培养液，KNO酶活性=[(0.654/1)*10]/[0.49*(20/60)]=40.04缺N培养液，H2O酶活性=[(0.392/1)*10]/[0.48*(20/60)]=24.50将结果填入上表。四、实验结果分析在完全培养液和缺N培养液中，加KNO普遍都要比加H20的酶活性高，说明KNO为酶促反应提供了底物，让酶促反应进行彻底。在完全培养液和缺N培养液中，加KNO相互比较，加H0的相互比较，完全培养液的酶活性都要高，说明N诱导了硝酸还原酶，使之活性增大。五、思考题1.依据原理，测硝酸还原酶活性的实质是以什么物质的含量来表示的？哪一步影响NO2-的浸出量？答：①实质是以亚硝酸根（NO-）的含量来表示的。因为NO可以从组织内渗到外界溶液中并积累，因此测定反应溶液中NO的含量的增加，即表明酶活性的大小。②真空泵抽气影响NO的浸出量。因为反复抽气放气，溶液可渗入叶组织取代叶片空气，叶片便沉于溶液底部，酶促反应可以相对完全的进行。2.为什么做两组溶液，一组培养液中加入H0和一组培养液中加入KNO的作用是?答：①培养时做完全培养和缺N培养是因为硝酸还原酶是诱导酶。②实验时一组加KNO一组加HH0是因为KNO为酶促反应提供底物，让反应得以彻底进行。实验前要使材料经一定时间光照，其作用是?答：让材料进行一段时间光合作用，积累有机物小烧杯置于30C，不见光保温的原因是？答：酶促反应在暗反应下进行，以防光照下叶绿体形成还原型铁氧还蛋白，促使亚硝酸镁把NO还原成NH。暗反应下反应可阻止NO-的继续反应。第一次30min和第二次20min的作用是？答①阻止NQ的继续反应②让NO和磺胺，a-萘胺反应充分，显色完全。显色反应的速度与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色，同时也影响灵敏度。