测定巨细胞病毒特异性抗体亲和指数的诊断价值

测定巨细胞病毒特异性抗体亲和指数的诊断价值 作者:牛向兰 林浦 李欣 谷学英 马旭 【摘要】 目的 以快速、简便的人巨细胞病毒特异性抗体亲和指数(CMV-IgG AI)检测方法作为有效的诊断工具～用于区分孕妇CMV原发感染与非原发感染。方法以的间接ELISA方法～8.0 mol/L尿素作为温和蛋白变性剂～用标准曲线方法定量测定标本中的CMV-IgG含量。 结果共检测218例标本～其中187例为CMV既往感染标本～31例为继发或再感染、可疑原发感染和原发感染标本。以抗体亲和指数<35.0 %作为阳性判断标准～此时方法的灵敏度为75.0 %～特异度为91.4 %～可用度为67.2 %。既往感染、继发或再感染、可疑原发感染、原发感染4组的平均AI值分别是(61.42〒25.69) %,(70.38 〒21.88) %, (66.73〒23.62) %,(29.78〒25.93) %,原发感染组与其它3组非原发感染比较～差异有统计学意义(P<0.01))。结论以8.0 mol/L尿素作为温和蛋白变性剂～用标准曲线方法定量测定标本中CMV-IgG含量适用于检测巨细胞病毒IgG抗体亲和指数(CMV-IgG AI)～认为CMV-IgM联合CMV-IgG AI检测是区分原发与非原发感染的血清学方法之一。 【关键词】 巨细胞病毒;亲和指数;IgG抗体;原发感染;酶联免疫吸附试验 【Abstract】 Objective To establish a rapid, easy and simple method for determination of CMV-IgG AI to serve as effective diagnostic tool to distinguish primary CMV infection from non-primary infection in pregnant women. Methods The measurement of CMV-IgG AI is accomplished by standard indirect ELISA method using 8 mol/L urea as a mild protein denaturing agent and the amount of CMV-IgG in the specimen was measured quantitatively using a standard curve method. Results Of the 218 samples, 187 were from women with past CMV infection and 31 from those with secondary infection or re-infection, suspicious primary infection and primary infection. When the CMV-IgG AI less than 35.0 % was defined as positive, the sensitivity was 75.0 %, the specificity was 91.4 %, and availability was 67.2 %. The mean AI in the samples from women with past infection , secondary infection or re-infection, suspicious primary infection and primary infection was( 61.42〒25.69)%, (70.38〒21.88)%, ( 66.73〒23.62)%, (29.78〒25.93)%, respectively. There is a statistical difference between the primary and non-primary CMV infection (P<0.01). Conclusion The amount of CMV-IgG in the specimen quantitatively measured by a standard curve with 8 m urea solution as a mild protein denaturing agent, was found to be suitable for determination CMV-IgG AI. At present the combination of CMV-IgG AI and CMV-IgM assay seem to be one of the best serological tests for differentiating primary CMV infection from non-primary CMV infection. 【Key words】 Cytomegalovirus; Avidity index; IgG antibody, primary infection; Enzyme-linked immunosorbent assay( ELISA) 人巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)是可以引发宫内感染 最常见的病毒之一～对胎儿危害极大～可引发胎儿多种病变或畸形 [1]～在活产儿中感染率为0.2 %，2.0 %左右～是风疹的2倍[2]。 先天性CMV感染也是引起先天智力低下的主要原因之一～仅次于唐氏 综合征[3]～在先天性耳聋中也有近1/2是由先天性CMV感染引起的 [4]。尽管已知继发、再感染和原发感染均可造成对胎儿的危害～但 是无论从其危害的程度～还是发生危害的频率来看～原发感染都是最 主要的。因此正确、及时的区分孕妇CMV感染类型～在预防和减少具 有严重出生缺陷的先天性CMV感染儿方面具有重要意义。 CMV-IgM阳性为活动性感染的～单一CMV-IgM阳性并不能 区分继发感染、再感染或原发感染[5]～而且CMV-IgM目前尚无统一 的国际标准～一般是根据各自实验室的标准进行判断。在孕早期检测CMV-IgG抗体亲和指数(avidity index～AI)是区分CMV原发感染与继发感染的新方法[6，9]。本文对31例检测为CMV-IgM阳性的标本进行CMV-IgG AI检测～并以187例CMV-IgG阳性～同时CMV-IgM阴性的CMV既往感染标本作为对照进行了尝试性研究～结果报道如下。 对象与方法 一、对象 1.标本来源:深圳市宝安区计生专科医院和妇幼保健院2005年3月至2007年3月收集的187例18，35岁育龄妇女有CMV既往感染史标本～ CMV-IgG阳性同时CMV-IgM阴性。40例近期原发、继发或再感染标本分别收集于北京市中日友好医院、北京市第一传染病医院、北京大学第三医院和北京市友谊医院检验科～初筛CMV-IgM为阳性～收集后统一再用Sorin公司CMV-IgG和IgM检测试剂盒检测～结果有31例CMV-IgM和CMV-IgG均为阳性～此31例血清作为近期原发、继发或再感染的标本。 二、方法 1.CMV-IgG AI的测定方法:用已标定的不同含量的CMV-IgG 标准血清作为标准品～加入已被纯化的CMV抗原的聚苯乙烯板孔内作标准曲线。血清标本均作1?101稀释～每例标本作平行2孔～37 ?孵育60 mins后甩去标本液～1孔用PBST洗5次～另1孔用PBST洗1次后～再用8.0 mol/L尿素洗3次～每次间隔3 min～最后再用PBST洗1次～然后于所有孔内加入1?6 000的辣根过氧化物酶标记的兔抗人-IgG结合物(丹麦 DAKO生产)～每孔100 (l～37 ?孵育60 min～甩去孔内液体再次用PBST洗5次扣干～于每孔内加入底物显色～室温静臵30 min后用2.0 mol/L H2SO4终止反应～于酶标仪上用450 nm测定各孔吸光度(optical density,OD)值～通过标准曲线计算出每孔标本之CMV-IgG含量。 2.材料和仪器:CMV-IgG和IgM检测试剂盒(意大利Sorin公司生产)检测～CMV-IgG AI检测试剂盒由“出生缺陷干预研究”课组研制;尿素sigma公司生产～购自北京欣经科生物技术公司;美国Bio-Rad 550型酶联免疫仪。 3.AI值的计算:AI=尿素洗涤孔内标本之CMV-IgG含量(IU/ml)/PBST洗涤孔内标本之CMV-IgG含量(IU/ml)〓100 % 4.CMV-IgM诊断标准:CMV-IgM OD值与临界值(Cut-off)的比值<1.00为阴性～1.00，1.10为可疑～比值在1.11，1.50之间为弱阳性～1.51，3.00为阳性～3.01，6.00为强阳性～6.00以上极强 阳性。 5.感染时间诊断:根据CMV-IgG和CMV-IgM检测结果诊断。CMV-IgM阴性且CMV-IgG阳性标本为既往感染组～CMV-IgG阳性且CMV-IgM弱阳性标本为继发或再感染标本～CMV-IgG阳性且CMV-IgM阳性标本为可疑原发感染～CMV-IgG阳性且CMV-IgM强阳性或极强阳性标本作为原发感染。 6.统计学处理:采用SPSS 10.0软件～两组间比较采用t检验。 结 果 一.检测CMV-IgG含量的标准曲线 标本品(补充品)浓度与OD值相关系数γ= 0.989～见图1。 图1 CMV-IgG含量测定标准曲线 二、CMV-IgG AI值比较 既往感染组与原发感染组比较～差异有统计学意义(P<0.01)～既往感染组与其它2组比较～差异无统计学意义(P>0.05);继发或再感染组与可疑原发感染组比较～差异无统计学意义(P>0.05)～继发或再感染组与原发感染组比较～差异有统计 学意义(P<0.01);可疑原发感染组与原发感染组比较～差异有统计学意义(P<0.01)～见1。表1 4组CMV感染标本CMV-IgG AI测定结果 三、检测CMV-IgG AI作为原发与非原发CMV感染的灵敏度和特异度 随着灵敏度的增高而特异度下降～以灵敏度和特异度均为50.0 %时可用度为0计算不同判断标准时的可用度～当以35.0 %作为判断标准时该方法的可用度为67.2 %～而当用30.0 %作为判断标准时该方法的可用度为64.9 %～二者比较～差异无统计学意义(P>0.05)～35.0 %作为判断标准较好～灵敏度为75.0 %～特异度为91.4 %～见表2。表2 不同判断标准下CMV-IgG AI检测方法的灵敏度和特异度比较 讨 论 孕妇CMV感染可引发宫内感染～导致胎儿多种严重损伤～引发婴儿智力迟钝～是影响中国出生人口素质的主要因素之一。CMV感染途径复杂不易控制～到目前为止尚无可实际应用的有效疫苗进行预防和有效的药物治疗～而且孕期感染对胎儿的损伤是不可逆的～出生后治疗意义不大。因此～积极预防和减少先天性CMV感染儿的降生对提 高中国出生人口素质具有重要意义。 尽管孕妇CMV继发或再发感染以及原发感染都可能伤及胎儿～但是无论从胎儿感染率及胎儿伤害程度来看～原发感染都要比继发或再感染严重的多[10]。因此～在孕期正确诊断孕妇原发感染是预防先天性CMV感染儿降生最重要的措施。 随着分子生物学技术的飞速发展～近年来有不少新的诊断方法用于CMV感染的诊断～如CMV短时培养快速诊断技术、抗原血症检测CMV pp65抗原、CMV病毒核酸检测、CMV mRNA检测等[11～12]～尽管这些方法在诊断CMV活动性感染方面比检测CMV-IgM更有优越性～但仍不能从活动性CMV感染中区别是原发感染还是继发或再感染～而在CMV活动性感染诊断基础上～通过检测CMV-IgG AI则是区分原发与非原发感染的最好方法之一[5，8]～而且方法简便～易于在各级医院或计生部门推广应用。 在IgG AI检测中～常规是应用尿素洗涤孔OD值与PBST洗涤孔OD比值进行AI计算～但有学者发现这种常规方法虽然有简便的优点～但结果不够确定～因为AI的变化取决于检测每孔标本中的IgG抗体总量。Jenum等[13]采用终点法测定AI～但方法较麻烦～需要将待测标本作成不同的稀释度进行检测。Prince等[14]采用标准曲线定量测定方法～效果优于OD值计算～本文研究也证实了这点。 尽管在CMV活动性感染的基础上检测CMV-IgG AI是一种简便、 有效的区分原发与非原发感染的有效方法～但是Lazzatto等[15]发 现通过IgG-AI检测对某些原发感染也有漏诊～因此有学者建议最好 将IgG-AI与CMV中和抗体进行联合检测[16]～效果更好。Sipewa等 [17]发现检测CMV-IgG AI排除新近原发感染的能力为84.0 %～若与 中和抗体(抗CMVgB抗体)联合检测其排除新近原发感染能力提高到 94.0 %。 本文由于CMV原发感染血清标本收集困难～仅有8例～数量较 少～因此～文中所得结论仅供参考～当待扩大样本测定证实后方可用 于临床实践。 【参考文献】 1Revello M G, Gerna G. 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