【doc】南北方武警战士外周血淋巴细胞热、冷损伤时热应激蛋白70表达的差异

【doc】南北方武警战士外周血淋巴细胞热、冷损伤时热应激蛋白70表达的差异 南北方武警战士外周血淋巴细胞热、冷损伤 时热应激蛋白70表达的差异 ? 114?环境与职业医学2OO4年4月第2l卷第2期JEnvironOccupMed,Apr2OO4Vo1.21No.2 文章编号:1006.3617(2004)02—01144)4中图分类号:Rl13文献标识码:A 南北方武警战士外周血淋巴细胞热,冷损伤时 热应激蛋白70表达的差异 柯磊,皇甫月明,王自正,任爱民,王书奎,肖成峰,邬堂春 【论着】 摘要:[目的]祖籍在宁夏,江苏,广东三个地区的武警士兵外周血淋巴细胞热,冷损伤时热应激蛋白70 (HSP70)表达水平的差异性及其可能的意义.[方法]用流式细胞仪检测淋巴细胞中HSP70表达水平.[结果]不同地区 比较发现,宁夏籍士兵基础和热损伤时(45?,0.5h)HSPT0表达水平分别为(809.93?58.37),(959.23?90.28)荧光道数, 均比广东籍士兵分别为(754.34?60.82),(887.29?72.85)荧光道数显着升高(P<0.05);冷损伤条件下(10~C,lh),三地 区士兵HSPT0表达水平差异未见显着性.[结论]南北方武警战士淋巴细胞基础和热损伤条件下HSPT0表达水平存在 差异性;冷损伤条件下,三地区士兵HSP70表达水平差异无显着性. 关键词:热应激蛋白70;武警战士;不同地区;热,冷损伤 D姐Fe眦ofHS】P,70ExpressionsinLymphocytesofSoldiersfromSouthandNorthChinaIncubatedatLow andIIiTemperature翘Lei,HUANGFUYue—ming,WANGZi—zl~ng,RenAi一,,lg,WANGShu-kui, DC 般,lg,WUTang-chun(InstituteofOccupationalMedicine,Ton~iMedicalCoUege,Huaz~ngScience andTechnologyUniversity,HubeWuhan430030,China) Abs 嘣:[Objective]ToanalyzeHSP70expressiondifferenceinlymphoeytesofsoldierslivedinGuangdong(SouthChina), JiangsuandNingxia(NorthChina).[Molhods]FlowcytometrywasusedfordetectingHST70inperipheralbloodlymphoeytesofthese soldiersafterflreirlymphocyteswereincubatedatdifferenttemperatures:? basalcondition-incubationat37?f0r4h;?hotdamage condition-at37?f0r3.5h,thenat45?for0.5h;?colddamagecondition—at37? f0r3h,thenatIO~Cforlh.[Results]The expressionlevelsofHSPT0inNingxiasoldiersinthebasalandhotdamagecondition(809.93?58.37and959.23?90.28fluorescence channel,respectively)weresignificantlyhigherthanthose(754.34?60.82and887.29? 72.85fluorescencechanne1)(P<0.05)in Guangdongsoldiers.However,theexpressionlevelsofHSP70inlymphoeytesofsoldiersfromthethreeaI-I潞uliderthecolddan'~e conditiondidnotshowsignificantdifferences.[Conclusion]Theresultssuggestthatthereisasignificantdifferenceintheexpression levelsofHSPT0amongsoldiersfromSouthandNorthChinaunderthebasalandhotdamageconditions(P<0.05),butthereisno significantdifferenceunderthecolddamagecondition(P>0.05). KeyWords:heat-shockproteins70;soldiers;variousclimatezones;hotandcolddamage 热应激或休克蛋白(heatstressorshockproteins, HSPs)是生物体细胞在一系列应激因素作用下产生的 具有高度保守性的细胞保护性蛋白质,其中以HSP70 家族最为保守和重要.当机体细胞遭受高温中暑,缺 血,缺氧,毒物,细菌病毒等各种理化以及生物因素刺 激作用下,HSP70合成显着增加,其作为分子伴侣参与 肽链的折叠和装配,以及作为蛋白水解酶参与体内 基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:30371204) 作者简介:柯磊(1977一),男,医学硕士,助教,研究方向:热应激蛋白与 分子毒理 通讯作者:乌堂春教授,E—mail:wut@mails.tjmu.edu.ell 作者单位:1.华中科技大学同济医学院职业医学研究所,湖北武汉 430030;2.武警南京医院,江苏南京210006;3.南京医科大学 附属南京第一医院放免中心,江苏南京210006 受损蛋白的清除和降解,对细胞损伤发挥保护作 用l,.最近,对生活在不同气候环境下的沙漠鱼类 研究发现HSPs的基础水平和应激表达水平存在一定 的地域差异性l_3'4;肖成峰等也发现我国不同地理气 候条件下生活的人群在基础和热应激条件下HSP70 表达存在着一定的差异性l5J.但是在热,冷损伤时,不 同地理气候条件下生活的人群HSP70表达是否存在 着一定的差异,国内外未见报道.我国幅员辽阔,地理 气候类型多种多样,武警战士需要在各种极端气候条 件下进行高强度的野#lqJII练,高温中暑或冻伤时有发 生.因此,本研究采用流式细胞仪检测了宁夏,江苏, 三个不同地区40名武警战士外周血淋巴细胞中 HSP?0在基础水平,热,冷损伤时的表达水平,并初 步探讨了其可能的生物学意义. 环境与职业医学2004年4月第2l卷第2期JEnvironOccupMed,Apt2OO4Vo1.21No.2?115? 1对象与方法 1.1主要试剂及仪器 淋巴细胞分离液(上海试剂二厂),TritonX100 (Sigma公司),兔抗人HSP70(华中科技大学同济医学 院职业医学研究所研制),异硫氰酸荧光素(vrrc)标记 羊抗兔tgg(北京中山生物试剂公司),流式细胞仪(美 国BD公司). 1.2研究对象 采样地点在南京市,共40名来自宁夏,江苏,广东 三地区的健康男性武警战士,志愿接受研究.其中原 生活与祖籍宁夏的战士12名,原生活与祖籍江苏的战 士14名,原生活与祖籍广东的战士14名.人选条件: 年龄18,20岁,身体健康,均未发现明显器质性或功 能性病变,心理状况良好.三代都在同一地区居住,在 南京同批入伍,入伍时间不超过1年2个月. 1.3样本收集 清晨静脉采血,每人8ml,肝素抗凝.同时填写相 关调查表,内容主要包括年龄,入伍时间,居住史,家族 居住史和既往病史等项目.并从文献[7]获得宁夏,江 苏,广东三地区常年气象资料. 三地区气象条件:三地区年平均气温由北向南逐 步递增,其气候区带分别为暖温带季风性森林草原气 候(宁夏),中温带大陆性荒漠草原气候(江苏),南亚热 带季风雨林气候(广东).三地区年平均气温分别约 为:9.1?,15.3?,21.8~C. 1.4淋巴细胞分离,分组及处理 按文献[7]报道的梯度离心法分离淋巴细胞,每个 样本的淋巴细胞都均分为3组,培养于RPMI1640培 养液中,其中含10%胎牛血清,100U/ml青霉素,100 /ml链霉素,培养条件为含5%co2的潮湿环境, 37?培养16h后,于次日进行热,冷损伤处理.具体 分组如下:?基础组:将淋巴细胞在37?培养4h;? 热损伤组:将淋巴细胞在37~C培养3.5h,然后于45? 水浴受热损伤O.5h;?冷损伤组:将淋巴细胞在37~C 培养3h,然后于10%水浴冷损伤1h.设立基础组,是 为了检测样本细胞HSP70的基础表达水平(即细胞处 于37~C人体基础体温时的表达水平).上述各不同组 在处理完毕后于37?条件下再恢复性培养4h,然后 离心收获细胞,用4%多聚甲醛0.3ml悬浮固定[. 1.5流式细胞仪检测HSP70 按文献报道的方法检测HSP7ff8J.基本步骤如 下:取上述经4%多聚甲醛固定的细胞经600g离心4 min,0.5mlPBS一1%BSA[含l%(质量/体积)牛血清白 蛋白的PBS,pH7.4]清洗淋巴细胞1次,离心;细胞沉 淀悬浮于300按l:500稀释的兔抗人HSP70中[用 PBS1%BSA稀释,其中含0.02%(体积/体积)的Triton X一100],37?温孵30min;PBS一1%BSA清洗1次,重悬 于300t_tl稀释度为1:100的F1TC标记羊抗兔IgG中 (PBS一1%BSA稀释,含0.02%TritonX一100),37?孵育 30min;最后1ndPBS—BSA清洗,0.5nd冰冷PBS悬浮, 上机检测.同时,分别用不含一抗(兔抗人~vTo)和 二抗(F1TC标记羊抗兔IgG)的PBS一1%BSA代替一,二 抗做阴性对照.波长525nnl,计数5000个细胞. 1.6结果统计处理 处理结果用SPSS10.01软件进行t检验,样本含 量不等的单因素方差分析(One—WayANOVA检验). 2结果 2.1士兵基本情况 由表1可见,各地区士兵平均年龄和在当地居住 时间差异没有显着性(P>0.05).其直系亲三代(本 人,父母和祖父母)均居住同一地点. 表1不同居住地区士兵基本情况 Fable1Generalconditionsofsubjectsinthreeprovinces 2.2不同居住地士兵淋巴细胞在基础,热和冷损伤时 的HSP70水平 由表2可见,宁夏籍士兵基础和热损伤时HSP70 表达水平均比广东籍士兵升高(P<O.05);冷损伤时, 三地区士兵HSP70表达水平未见差异. 表2不同居住地士兵淋巴细胞在不同处理条件下的 KS-It/0表达水平(荧光强度.?s) "Fable2Basal,heat-injuryandcold-injuryHSPT0levelsoflyr叩}l0cyte8 ns~bjectsfromthreeprovinces(Ineanfluorescenceintensity.?le蛐?SD) 原 Re 居 sid 住 en 地 ce—I_高嚣BasalHeat.injuryCold-injury 宁夏(Ning,,ia)809.93?58.37959.23?9o.28830.67?69.45 江苏(Jiangsu)766.37?53.59894.48?64.52810.61?51.66 广东(Guangdong)754.34?60.82887.29?72.85800.92?72.50 [注]*,#:One-WayANOVA检验两两比较:P<O.05 2.3士兵淋巴细胞在基础,热损伤时HSPT0表达水平 由图1可见,同一地区士兵不同个体间在基础体 温和热应激时具有差异性;本图也表明同一地区士兵 热损伤时(45~C,O.5h)HSP70表达水平均比其基础体 温时的表达增加,t检验结果,P<0.05. ? ll6?环境与职业医学20O4年4月第2l卷第2期JEnvironOceupMed,Apt-2004Vo1.21No.2 菲 耋 薰耋 薹薹 图1士兵淋巴细胞基础体温,热损伤时I][SP70表达水平分布图 Figure1Distributionofbasal,heat-injuryHSP70levelsoflymphocytes insubjectsfromthreeprovinces 2.4士兵淋巴细胞在基础,冷损伤时HSPT0表达水平 由图2可见,同一地区士兵冷损伤时(10'12,1h) HSP70表达水平与其基础体温时的表达相比无显着增 加(P>0.05),但是同一地区的个体间在冷应激时, HSP70表达水平仍有较大的差异. 翕 羞 广东?T苏宁复 GuangdongJiangsuNingxia 图2士兵淋巴细胞基础体温,冷损伤时I-[SPT0表达水平分布图 Figure2Distributionofbasal,cold-injuryHSP70levelsoflymphocytes insubjectsfromthreeprovinces 3讨论 近年来,许多研究发现认为:liSPs参与机体热,冷 耐受反应的形成,其中以HSP70家族最为重要.肖成 峰等曾对我国不同地理气候地区士兵在热应激条件下 (41?)HsP70表达水平的差异性进行了研究,提示这 种地域差异是存在的,并且可能和不同地域士兵的热 耐受能力有一定的关联【5J. 本实验主要研究了我国不同地理气候地区士兵外 周血淋巴细胞在热(45~C)和冷(10~C)损伤条件下,其 HSP70表达水平的差异性.研究发现:?基础温度条 件下HSP70表达水平,三地士兵有差异,其中广东地 区士兵HSP70基础表达水平显着低于宁夏地区士兵 水平(P<0.05),这与肖成峰等的研究结果相符l5]. ?热损伤条件下HSP70表达水平,三地士兵也有差 异,其中同样是广东地区士兵HSP70表达水平显着低 于宁夏地区士兵水平(P<0.05).Moseley认为,HSP70 不仅是一种保护性蛋白,同时应激后其表达水平的增 加幅度与细胞耐损伤能力有关,因而HSP70从另一个 角度而言也是一种损伤的标志物【9].面对同样的热损 伤温度,由于广东籍士兵的热耐受能力强于宁夏籍士 兵[5_,所以广东籍士兵外周血淋巴细胞损伤程度也会 较宁夏籍士兵轻.这可能就是热损伤时,广东籍士兵 HSP70表达水平显着地比宁夏籍士兵低的原因之一. 同时,国外对热带和北方沙漠鱼类的研究发现:在很热 条件下,热带鱼类的存活率明显高于寒冷地区的沙漠 鱼类.热带鱼HSP70存在多种亚型,各亚型轻度表达 即可产生较强的热耐受;而沙漠鱼类HSP70亚型种类 比较单一,应激后表达水平很高,但是其热耐受水平仍 然有限【3].这也提示我们,尽管广东籍士兵HSP70表 达水平显着地比宁夏籍士兵低,是否广东籍士兵 HSP70存在着更多的亚型,尚有待于进一步研究.? 冷损伤条件下HSP70表达水平,各地区士兵之间并没 有显着性的不同,这可能是因为面对冷环境,很早以来 人们就已经有了很多有效的防御措施.这使得即使是 不同地理环境条件下居住的人们所受冷应激的时间和 方式几乎相同,因而对冷耐受的能力也是几乎相等的. 或者,这也可能提示了:在人体内冷,热应激反应剂量. 效应关系有所不同.因为,国外有学者[10]曾对深海鱼 类研究发现:相对于热应激反应而言,冷应激反应模式 在时间和种属上是有很大变异性的.今后,对于不同 地域士兵冷损伤条件下HSP70表达多态性的研究也 许可以更好地回答这个问题. 分析我国不同地区武警战士外周血淋巴细胞热, 冷损伤条件下HSP70表达的差异性具有重要的意义, 有助于我们可以更好地认识HSP70的生物学功能. 热损伤时淋巴细胞HSP70表达水平的差异也许可以 用来评价士兵的热耐受能力,利于尽早发现和预防高 温中暑的发生;同时,也提示我们:相对于严寒条件下 军事训练中冷损伤预防而言,高温中暑的防范更需要 从士兵地域来源不同上加以考虑,采取与之相适应的 预防措施来符合不同地域士兵的不同基础生理条件. 参考文献: l1]MorimotoRI,TissieresA,GeorgopoulosC.PTandpe~tivesonthe biologyofheatshockproteinsandmoleculardlap[A].In:The biologyofheatshockproteinsandmoleculardlajpe瑚鹳[M].NewYork: ColdSpringnl1.1~orLaboratoryPress,Coldspri.gnl1.1~orNY,1994.1-30. 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(下转第130页) ? 130?环境与职业医学20O4年4月第21卷第2期 JEnvironOceupMed,Apr20O4Vo1.21No?2 被抑制.其活性的改变对于中毒的状况和治疗预后有 很重要的作用.血清乙酰胆碱酯酶活性的测定方法已 经成熟,因此确立一种检测血清中羧酸酯酶活性的方 法成为当务之急. 目前国内有关羧酸酯酶的文献大多是农药对蚊虫 的杀伤效果和杀虫机制的研究J.人的血清羧酸酯酶 活性的测定方法虽有报道,但介绍不够详细_4f.有的 文献介绍的方法需要特殊的仪器,例如采用速率法测 定活性时需要一种具有连续计数的自动显数的高档分 光光度计l7J,这对大多数国内的实验室而言是不切实 际的.本文详细介绍了一种测定羧酸酯酶活性的分光 光度法,适于国内普及和应用. 用分光光度法测定羧酸酯酶的活性,酶活性与吸 光度值呈良好的线性关系.批内的RSD在0.8%, 1.4%之间;批间的RSD在4.9%,7.2%之间;加入不 同量的酶(25%,50%,75%),比较实测值和理论值的 差异,误差百分比分别是5.17%,5.31%,1.82%;同一 样本重复测定,RSD为8.23%,所有都达到现场实用 的要求.本方法平均批内精密度RSD为1.09%,批间 的RSD为6.14%,可见批间精密度变异大于批内精密 度变异,表明溶液试剂的批次不同可以带来误差.因 此,应尽量运用同一批溶液试剂测定同批样本,并且不 同批次的实验应绘制各自的曲线.在重复性实验 中,相对标准偏差范围较大,可能与血清反复冻融影响 了酶活性有关.因此,样品最好分装成小量,用后丢 弃,不要反复冻融和重复使用. 本方法关键在于要控制好反应时间,温度,尤其是 温度.如果温度变化1?,反应速度将变化10%左右. 其优点在于,血清用量少,反应时间短,使用普通分光 光度计就可以测定酶活性.并且由于设置了对照,用 含有丙酮的PBS调零,对于轻度溶血的样本仍旧能够 读取吸光度值,确实达到了快速,简便,经济,准确测定 羧酸酯酶活性的目的,适于实验室研究和现场人群筛 杏 参考文献: [1]TetsuoS,M"asakiyoH.Themammalianearboxyleat~:frommoleculesto functions[J].AnnuRevPharmacolToxicol,1998,38:257—288. 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