大枣多糖的分离和纯化

《食品工业科技》 Science and Technology of Food Industry 1998．No．4 一 l 大枣多糖的分离和纯化 林勤保 高大维 淑娟 扶 雄 林勤保 高大维 于淑娟 扶 雄 (华南理工大学食品与生物工程学院，广州 510641) 摘 要 对大枣的糖分组成、大枣多糖的提取、纯化、纯度鉴定等方面进行了研究。 ，／ ／关键词 兰芝 盟 苎竺 - - 0’-． 、__’-一 ‘l_·一 ，·I_一 ， ● ' 一 一 ， Abstract Sugar component of Chinese red dates，isolation，purificat／i nd purity ide~tifica— tion of polysaccharides from Chinese red dates was studied． Key words Chinese red dates；polysaccharide；isolation；purification 1 前言 大枣是鼠李科 (Rhamnaceae)枣属植物枣树 (Ziziphus Jujuba Mil1)的果实。大枣有极高的营养 价值和很好的医疗保健作用。 多糖为单糖组成的天然高分子化合物，广泛存 在于各种植物、动物和微生物组织中，具有许多重 要的功用。多糖作为药物始于 1943年，六十年代 后，多糖作为广谱免疫促进剂引起了人们极大的兴 趣[2] 八十年代又发现多糖的糖链在分子生物学中 具有决定性 的作用，能控制细胞分裂和分化，调节 细胞的生长和衰老 。 本文对大枣(Zizyphus jujuba dates，又名 Chi— nese red dates)的糖分组成、大枣多糖的提取、纯 化、分级、纯度鉴定、理化分析等方面进行了研究。 2 与方法 2．1 材料与试剂 大枣 临县木枣； 果糖、葡萄糖、蔗糖、95 乙醇、无水乙醇、正丁 醇、三氯乙酸、粉末活性炭、苯酚、浓硫酸、醋酸钾， 均为分析纯试剂； EDAE一纤维素，ED51，Whatman公司。 2．2 仪器与设备 电热恒温水浴锅，医用离心机，真空干燥箱，折 光仪 ，高效液相色谱仪，透析袋，电导率仪 ，凝胶层 析柱 ，自动电子蠕动泵，自动馏分收集器，梯度混合 仪，分光光度计。 2．3 实验方法 2．3．1 大枣提取液的糖分组成分析 高效液相色 谱法。 ·20· 分析柱：Sugar PakI；流动相：高纯水 ；流速： 0．4ml／min；柱温：9O℃；进样量：2otd；进样浓度： 2％。 2．3．2 大枣水溶性多糖的提取[1 去核大枣 一 加水 3：1～lO：1— 5O～100℃水浴浸提 0．5～6h，一 离心分离一 清液保 留，残渣用水反 复提取 ，共三次一 合并提取液一 8O℃水浴浓缩 — 一 浓缩提取液加 3～5倍 95％乙醇沉淀多糖—一 离心分离，除去乙醇，得粗多糖一 粗多糖用水溶 解，再用 95％乙醇反复沉淀三次一 无水乙醇洗涤 沉淀多糖三次—一低温真空干燥—一大枣粗多糖。 2．3．3 脱脂 粗多糖中的脂肪采用索氏抽提法脱 除。 2．3．4 脱蛋白 三氯乙酸一正丁醇法[6 ]。按多糖 水溶液的体积，加入 1：1体积的 5％三氯乙酸一 正丁醇液，摇匀 ，在分液漏斗中静置分层后 ，分出下 层清液，除去上层正丁醇层及中层杂蛋白。下层清 液用 2NNaOH中和至中性。 2．3．5 脱色 活性炭脱色[7 ]。脱蛋白后多糖水溶 液调 pH4．O～6．0，加粉末活性炭 1％(对多糖干物 质)，于 8O℃保温 30min，然后过滤。 2．3．6 分级 DEAE纤维素法[9]。将 DEAE纤维 素用 0．5N醋酸钾处理成醋酸盐形式，装柱并用蒸 馏水平衡好。将纯化好的多糖液浓缩至 2 ～5 ， 以 10ml上柱，先用蒸馏水洗脱，流速 1．2ml／min， 用苯酚一硫酸法检测，至无糖流出。再以 O～0．4N 醋酸钾溶液 500m1分段洗脱或梯度洗脱。每管收集 4ml。按出峰收集组分 ，分别浓缩、透析、干燥。 2．3．7 纯度鉴定 凝胶层析法[4]。G一75葡聚糖凝 维普资讯 http://www.cqvip.com 胶装填于(1．6×100cm 的层析柱中，装填 高度为 95cm，用高纯水按恒定流速 60ml／h平衡。以浓度 5 的多糖水溶液 }Oml上柱，高纯 水洗脱 ，流速 60ml／h，流出液每四分钟一管分部收集，苯酚一硫酸 比色法测定含糖量。以洗脱体积为横坐标，吸光度 为纵坐标作图。监测出峰的分布情况。 2．3．8 糖分检测法 苯酚一硫酸法[4]。 3 结果与讨论 3．1 大枣多糖的提取可用 80~C，6h+3h+3h三 次浸提 ，水料比为每次浸提 3：1～10：1，浸提中 大枣应适度破碎，并不时搅拌，提取液干物可达到 枣肉干物的 77 左右。大枣提取液的糖分组成比 例，经高效液相色谱仪分析，结果见表 1。 表 1 大枣提取液的糖分组成比例 3．2 在 DEAE纤维素柱上，对大枣多糖先用蒸馏 水 洗脱至 无糖分 检 出，得大 枣 中性多 糖，再用 CH。COOK进行梯度洗脱 ，得大枣酸性多糖 ，洗脱 曲线如图 1。 图 1 用DEAE纤维素分级得到的大枣多糖级分 将两个级分分别收集，透析后干燥，分别命名 为JDP—N和 JDP—A。 3．3 常压凝胶层析纯度鉴定结果 大枣中性多糖和酸性多糖分别经 G一75葡聚 糖凝胶柱层析分离，都只得到一个单一组分，出峰 情况见图 2、图 3。 3．4 大枣中性多糖为白色粉末，吸湿性很强，酸性 多糖为浅黄色粉末。大枣多糖在 10～120"C范围内 无明显的吸热或放热现象，热稳定性很好。 4 结语 大枣多糖是大枣中重要的生物活性物质，经第 一 军医大学药理研究室的检测，大枣多糖具有明显 的抗补体活性和促进淋巴细胞增殖作用，对提高机 图2 大枣中性多糖纯度鉴定 I-Ube num ber 图 3 大枣酸性多糖纯度鉴定 体免疫力具有重要的作用。随着进一步深入研究的 进行 ，大枣作为药物和保健食品的机理逐步得到揭 示，大枣多糖将越来越引起人们的注意。 参考文献 1 友田正司，邹建华译 ．生药中的生物活性多糖(6) 国外医学 ．中医中药分册，1991，13(3)：18～20。 2 方积年 ．多糖的研究现状 ．药学学报，1986，21 (12)：944～ 950 3 方一苇 ．具有药理活性多糖的研究现况 ．分析 化学，1994，22(9)：955～960 4 张惟杰主编 ．糖复合物生化研究技术 ．杭州： 浙江大学出版社，1994 5’方积年 ．多糖的分离纯化及其纯度鉴别与分子 量测定 ．药学通报，1984，19(10)：46~49 6 吴梧桐，余品华，夏尔宁等 ．银耳孢子多糖 TF— A，TF—B，TF—c的分离纯化及组成单糖的鉴定 ． 生物化学与生物物理学报，1984，16(4)：393~398 7 吴梧桐 ，陈琼华 ，徐碧如等 ．银耳孢子单糖的分 离与分析 ．真菌学报，1982，1(2)119～124 8 张力田 ．淀粉糖 ．北京：轻工业出版社 ，1981： 1 95～ 234 9 Tomoda M asashi and Uno Ma ayo．Plant Mu— cilages 1：Isolation and property of a Mucous polysacchride．Chem．Pharm．Bul1．，1971，10(6)： 1214～ 1217 ·21· 维普资讯 http://www.cqvip.com