糖原合成酶激酶3β活性调节机制的分子动力学模拟

第 18卷 1期 2012年 3月 天 津医科大学学报 Journal of Tianjin Medical University V01．18．No．1 Mar．2012 文章编号 1006—8147(2012)01—0001—03 糖原合成酶激酶 3I3活性调节机制的分子动力学模拟 胡鳞方 ，刘梦源 ，董卫莉 ’，徐为人 ，王树青 ’，王润玲 ’ (1．天津医科大学药学院，天津市临床药物关键技术重点实验室，天津 300070；2．天津药物研究院，天津市新 药与发现重点实验室，天津 300193) 摘要 目的：探讨研究糖原合成酶激酶(GSK一3B)的活性调节机制。方法：利用 Desmond 9．0软件对 GSK一3B一轴素复合物和 GSK一3B—FRATtide复合物进行分子动力学模拟研究。结果：与GSK一313一轴素复合物相比，在GSK一3B—FRATfide复合物中， Lys205同Glu211、Asn213之 间的氢键作用消失，Lys205与 Glu211不能形成稳定的盐键 ；FRATtide的 Arg219与 GSK一3B的 Asp264。GSK一313的Gly259与Arg220之间能形成稳定的氢键。此外，Phe67和 Phe93显示出位置的偏移。这些都将导致 GSK一 3B活性环的构象变化进而抑制 GSK一3B的催化活性。结论：GSK一3B的活性调节是通过改变其活化环构象来实现的。 关键词 糖原合成酶激酶 一3B；Wnt信号通路；轴素；FRATtide；分子动力学模拟 中图分类号 R91 文献码 A Molecular dynamics simulation of activity regulation mechanism in glycogen synthase kinase 313 HU Lin-fang ，LIU Meng-yuan ，DONG Wei-li ，XU Wei-ren2,WANG Shu-qing ，WANG Run—ling (1．College of Pharmacy，Tianjin Medical University，Tianjin Key Laboratory Oil Technologies Enabling Development of Clinical Therapeu— tics and Diagnostics，Tianjin 300070，China；2．Tianjin Institute of Pharmaceutical Research，Tianjin Key Laboratory of Molecular Design and Drug Discovery，Tianjin 300193，China) Abstract Objective：To study the regulative mechanism of glycogen synthase kinase一3p(GSK一3p)activity．Methods：GSK一3p—Axin complex and GSK一3p—FRATtide complex were modeled by molecular dynamics(MD)simulations using Desmond 9．0 software．Results： In GSK-3IB-FRATtide complex，the hydrogen bonds between Lys205 and Glu211，Asn213 were disappeared，the salt bridge between Lys205 and Glu21 1 were disappeared．Besides，Arg219 of FRATtide and Asp264 of GSK-313，Gly259 and Arg220 of GSK一3B could form hydrogen bonds．Furtherm ore，Phe67 and Phe93 exhibited positional shifts．All of these would lead to the eonform ational changes of the activation loop of GSK-313，which would inhibit GSK-313 catalytic activity by FRATtide．Conclusion：GSK-3~regulates its catalytic activity by changing the conform ation of the activation loop． Key words glycogen synthase kinase-313；Wnt signaling pathway；axin；FRATtide；molecular dynamics simulation 糖原合成酶激酶一3(glycogen synthase kinase一3， GSK一3)是一种多功能丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，在 真核细胞中广泛分布。GSK一3除了能够磷酸化糖原 合成酶(glycogen synthase，GS)并使其失活外，还参 与生物体内多种细胞功能活动的调节[1l。GSK一3主 要有 GSK一3ct和 GSK一3B两种亚型，其中GSK一313 在细胞内多种信号转导通路中发挥着重要作用[21。 研究表明，人类多种疾病如 2型糖尿病、阿尔茨海 默病、肿瘤、神经退行性疾病和炎症等疾病的发生 发展都与 GSK一3B活性异常调节相关[3]。目前 GSK一 3B的研发已成为新药开发热点，而且已经发现了多 基金项目 国家自然科学基金资助项目(20972112)。教育部博士点 基金资助项目(20091202110010)。天津市自然科学基金重点资助 项目(09JCZDJC21600) 作者简介 胡鳞方(1987一)。女。硕士在读，研究方向：计算机辅助药物 设计合成及活性测定 ；通信作者：王润玲 。E—mail：wangrunling@tij— mu．edu．cno 个有效的GSK一3B抑制剂，但大多为非选择ATP竞 争性抑制剂 。本研究中，笔者使用分子动力学模 拟方法研究 GSK一3B的活性调节机制 ，为 GSK一313 选择性抑制剂的设计提供一定的理论参考。 1 材料与方法 1．1 原始结构的准备 从 RCSB蛋 白质数据库中 获取GSK一3B一轴素(PDB编号：109U)和 GSK一313一 FRATtide(PDB编号：1GNG)的晶体结构。 1．2 模拟方法 分子动力学模拟过程使用 Desmond 9．0软件对两个复合物进行加氢操作 ，水分子使 用简单点电荷模式(SPC)。体系中加入抗衡离子中 和平衡蛋白质所带电荷，然后加入0．15 mol／L氯化 钠模拟体内水的渗透压环境。使用Desmond 9．0缺省 设置程序实现体系能量最小化和体系弛豫过程。短 程静电相互作用阈值为 9A，利用 Particle Mesh E— wald(PME)方法计算长程静电作用，使用 SHAKE键 长限制算法限制所有的共价键。在 NPT系综中周期 2 天津医科大学学报 第18卷 边界条件下进行分子动力学模拟。温度耦合方法是 Nose—Hoover，模拟温度为 300 K，压力为 1 atm。模拟 积分步长设置为 2 fs。经过 2 HS的平衡后，进行 10 ns的正式分子动力学模拟。 2 结果 为了能够直观清晰地观察到 GSK一3B复合物 中GSK一3B的催化区域和活性区域关键残基的变 化，获取了分子动力学模拟 10 ns后的GSK一3B一轴 素复合物和 GSK一3B—FRATtide复合物轨迹图 (图 1)。ATP结 合 1：3袋催 化 区域 主要 包括 Lys85， Asp133，Vail35，Thr138和 Gln185等；活性区域(活 化环)由带正电的Arg96，Arg180和 Lys205及正调 节因子Tyr216组成。 2．1 GSK一3B残基骨架c仅的波动情况 为了观察 轴素和 FRATtide对 GSK一313残基骨架运动的影响， 计算了 GSK一3p一轴素复合物和 GSK一3p—FRATtide 复合物中 GSK一313残基骨架 Ccx的均方根涨落值 (RMSF)(图 2)。在 GSK一3B一轴素中，各个残基 RMSF值基本在 2A左右浮动：在 GSK一3B—FRAT— tide中，大部分残基的 RMSF在 2A左右浮动 ，但 198—222残基 RMSF值较大。 2．2 关键原子对距 离图变化情况 由于 Arg96、 Arg180和 Lys205是 GSK一3B活化环的关键残基 ， 三者维持正常的相对位置是GSK一3B活性所必需， 因此测定了Arg96中氮原子 NH1和 Argl80中氮原 子 NH2问的距离(图3a)以及 Glu211的OE2原子与 Lys205的 Nz原子之间距离 (图3b)随时间变化情 况。GSK一3B—Axin中Arg96的 NH1原子与 Arg180 的 NH2原子间距离平均值为 5．2A，而 GSK一3B— FRATtide中平均值为9．3A。GSK一3p一轴素中Glu21 1 的 OE2原子与 Lys205的Nz原子之间距离平均值 为4．6A，而GSK一3B—FRATtide中平均值为9．3A。 2-3 氢键概率 为了研究两个复合物中 GSK一313 重要残基问的相互作用 ，统计了 Lys205一Glu21 1、 Lys205一Asn213、Gly259一Arg220、Asp264一 Arg395 (轴素)和 Asp264与 Arg219(FRATtide)问形成氢键 的概率，见表 1。 表 1 GSK一3B一轴素和 GSK-3[I-FRATtide的氢键概率统计 Tab 1 Hydrogen bond occupancy in GSK一3B—Axin and GSK- 313-FRATtide 2．4 GSK一3p残基侧链二面角变化情况 侧链二 面角分布图(图4)能反映出残基侧链的运动变化情 况，也能作为残基发生位移变化的一个佐证。由图 可见 ，两个复合物中残基 Arg96分布情况相似，而 Arg1 80、Phe93和Phe67的分布则各不相同。 C 1 1 量 。 一 一 1 8O 20 60 0 60 2O 80 l8 O—l20—60 0 60 l20 l8 Chi一1 f 1 1 u — 一 1 0 一 ◆ 一 12O一60 60 l20 l ◆． ◆ 【⋯ ■ ·◆ ■ a、C、e,g分别表示 GSK一313一轴素的 Arg96、Arg180、Phe93和 Phe67侧链二面角分布图；b，d，f，h分别表示 GSK一313一FRATtide的 Arg96、Arg180、Phe93和 Phe67侧链二面角分布图 圈 4 GSK一3B残基二面角分布图 Fig 4 Distribution of side-chain dihedral angle for residues of GSK-313 3 讨论 由图 2可见 ，GSK一3B—FRATtide中残基 198— 222的RMSF值比其余残基明显升高，了轴素 和 FRATtide对 GSK一3B残基骨架运动的影响不同， FRATtide使这些残基产生了较大幅度的波动。此外 残基 198—222位于 GSK一3B活化环(200—226)中， 因此可以推测 FRATtide可能是通过影响活化环进 而影响 GSK一3B活性的调节。 3．1 GSK一313活化环中关键残基的作用 与其它 MAP激 酶 (mitogen—activated protein kinase)如 CDK2、ERK2和 p38 不同，GSK一3B的活化环上没 有可磷酸化的丝氨酸或苏氨酸，只能通过活性口袋 的3个关键残基Arg96、Argl80和Lys205中多余的 正电荷与预磷酸化底物中的磷酸根通过静电作用 胃 印。础 啪 第 1期 胡鳞方，等．糖原合成酶激酶 3 t3活性调节机制的分子动力学模拟 3 结合构成活性构象『81。其中Arg96的作用至关重要， 已有实验表明，当 Arg96突变为 Ala或 Lys时， GSK一313活性消失 砌。此外，Arg96、Argl80和Lys205 三者维持正常的相对位置是 GSK一313产生活性的必 要条件。由图3a可见，GSK一3B—FRATtide中Arg96 和 Arg1 80之间相距太远无法形成氢键，从而导致 GSK一313无法产生活性构象。此外，GSK一3B一轴素和 GSK一3B—FRATtide中 Arg96和 Arg1 80的侧链二面 角分布图见图4a、4b、4c、4d。两个复合物中Arg96 分布差异不大，而 Arg180侧链二面角分布差异大， 推 测可能 是 由于 GSK一313一FRATtide复合物 中 Arg180侧链的偏转导致 Arg96和 Arg180间失去正 常的相对位置，无法形成活性构象 ，从而抑制 GSK一 3B的活性。 3．2 GSK一3B活化环的氢键和盐键作用体 系 通 过图 la与 1b的比较发现 ，GSK一3B一轴素中 GSK一 3p的活化环较 GSK一3p—FRATtide有所上提。复合 物中重要残基形成氢键概率的统计情况见表 1。 GSK一313一轴素中Lys205与 Glu21 1形成氢键的概率 为 28．3％ ，Lys205与 Asn213形 成 氢 键 的 概 率 38．1％；而 GSK一313一FRATtide中 Lys205、Glu211、 Asn213三者间没有氢键形成。可能正是这种氢键作 用使GSK一3p一轴素中GSK一3p的活化环上提，有利 于底物进入底物结合沟与GSK一313结合。此外，图 3b显示 Glu211的 OE2原子与 Lys205的 NZ原子 之间距离：GSK一313一轴素复合物中距离平均值为 4．6A，而GSK一313一FRATtide复合物中距离平均值为 9．3A。这说明了 GSK一313一轴素的 Glu21 1与 Lys205 间可以形成盐键。而 GSK一313一FRATtide中二者则 无法形成。因此，由于缺乏氢键和盐键作用，GSK一 3B—FRATtide中GSK一313的活化环无法上提，影响 底物与GSK一3B结合而抑制催化活性。 由表1可知GSK一3B一轴素中Gly259与Arg220 无法形成氢键，但GSK一3B—FRATtide中Gly259与 Arg220形成氢键的概率为 98．O％，这一作用会下拉 活化环。此外，Asp264与轴素的Arg395形成氢键的 概率为 34．5％，但 Asp264与 FRATtide Arg219形成 氢键的概率为 49％，FRATtide的这一氢键作用强于 轴素，加之 Gly259与Arg220间的氢键作用会产生 一 种连动作用下拉活化环，阻碍活化环的提升，抑 制 GSK一3B的活性。 3．3 GSK一313活化环周围残基的影响 Phe93位于 底物结合沟的上方，Phe93侧链二面角分布图如图 4e、4f所示。该图显示 Phe93的苯环侧链发生了偏 转。GSK一313一轴素中Phe93的苯环平行于底物结合 沟，有利于底物进人与 GSK一3p结合。而 GSK一3p— FRATtide中Phe93的苯环垂直于底物结合沟，对底 物进入结合造成空间位阻作用。 富含甘氨酸的G—loop位于ATP结合袋附近， Phe67是 G—loop上的保守残基 ，其侧链二面角分布 图见图4 4h。此图表明 Phe67的苯环侧链发生了 偏转。GSK一313一轴素中Phe67苯环伸向G—loop内部 并平行于 G—loop，而 GSK一3B—FRATtide中G—loop 上提，Phe67伸出G—loop外，其苯环垂直于 G—loop， 掩盖住了ATP，从而阻碍磷酸转移过程 ，抑制 GSK一 3B活性。 总之，FRATtide通过多种途径主要影响 GSK一 3B活化环使其无法形成活性构象，进而抑制GSK一 3B活性。本文使用 Schrodinger Suite 2009作为计算 机辅助设计软件对 GSK一3B复合物进行了分子动 力学模拟，研究探讨了GSK一3B活性调节机制，希 望能为进一步 GSK一38选择性抑制剂的筛选提供 一 定的理论依据和参考。 (本文图 1~3见封三 ) 参考文献： [1] 毛伟峰，李佳，袁崇刚．多功能的蛋白：糖原合成酶激酶一3[J1．生 命科学，2005，17(1)：45 [2] Martinez A，Castro A，Miguel M．Glycogen 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