利用固定化细胞技术提高红曲色素发酵色价的研究

，f 一e f i 《食品工业科技》 Scle n c e and Te chnology of Food Industry ． } 利用固定化细胞技术 提高红曲色素发酵色价的研究 博 亮 高孔荣 (华南理工大学轻工食。 学院，广州510641) 摘 要 本文通过自由细胞发酵及固定化细胞发酵生产红曲色素 比较，证实了固定化细胞发酵比 自由细胞发酵对产色更有效 并证明了产物抑制在发酵中的重要作用．通过解臆产物抑制后，固定化细 胞发酵E巴自由细胞发酵产色可提高76％。 关键词 固定化细胞 发酵 产物抑制 红曲色素 ABSTRACT 食司 考 Pigment production by the Mo11a$cu s strain MF1 07 was studied by comparillg ftee cel1 fermentatio11 cOIII"5e with immobi1ized fermenta— tion COUrse．The results showed that Product repres sion is very im— portant and immobilized fermentation is more effective than free cell fermentation．After product repression being detached，pigmentation in immobilized fermentation is improved more than 76％ than in free cell fermentatlon． Key W ords：1mmobilized Cell， Fermentation， P roduct Repre ssionj Mona$cus Pigment 红曲霉色素的发酵在很早阱前是进行浅盘固态发酵 其生产效率低，劳动强度大，品质难以控制。 进行大规模工业化生产的方向肯定是需要进行液态深层发酵 (Chiu et al，1993)．但深层液态发酵目 前仍没有成功地进行稳定而大规模的工业化生产的重要原因之一是发酵色价偏低．生产成本高，商业上 难仨工顺利推广。Lia等 (19T3)证实课层液态红益色素发酵色价比固态发酵要低，只有固态发酵的10％ 左右。为了将固态红曲色素蚵发酵色价高及液态深层发酵的易于大规模工业化生产，品质易于控制．成 本低，生产周期短等优点结合起来，我们对液态红曲色素发酵的细胞进行固定化，探讨了通过细胞固定 化发酵提高红曲色素发酵色价的可能性． 1与方法 1．1菌种 菌种采用我校食品生化研究室 自行分离、诱变、筛选而得到的红曲色素高产菌株MF1o7。 1．2培养基及培养条件 1．2．1麦芽汁琼脂斜面培养基-葡萄糖 1 ，酵母膏0．3 ．麦芽汁粉0．2％．蛋白胨9．3 ，琼 脂 2 ，PH6．0．灭菌，接种后30。C黑暗中培养 6天。 1．2．2种子培养基及种子堵养。葡萄糖 1 ．酵母膏9．3 ．麦芽汁粉0．2 ．蛋白胨9．3 ．PH 6．9，每50oralS．角瓶装75mi培养基，0．1×10。MPa灭苗30rain．再用1Oml含0．0％NaC1的无菌承从麦 芽汁琼脂斜面堵养基上洗下红曲霹孢子。然后在每瓶种子培养基中按种2 ml的孢子悬浮液 (孢 子浓 度 维普资讯 http://www.cqvip.com 镜榆为2×1 0‘／m1)。存3o’C下1 Bor／min回转摇目芒上避光培养36h． 1。2．3发酵培养基。大米粉5％，KNO。0。1 5 ，NH．NO，o．1 MSG (谷氨酸单钠盐)o．8，毒 KH。PO．0．3 ，K HPO．o．3％ ，MgSO．·7 H O0．8 ．KC10。05％ ，FeSO··7 H 01 oppm ， ZnSO··7IftO10ppm，MnSO‘·H sO3 ppfn，PH5．5．5ooml的三角瓶中装培养基75ml，0．1×】o‘ MPa灭菌3Omin。 1．2．4自由细胞液体发酵。将每瓶发酵培养基中接种 5皿1种子培养基，在3o,C下1 B0r／min回转摇 床上避光堵养。 1．2。5固定化细胞液体发酵；在无菌条件下先将 1 (W／w)的藻朊酸15mi接种 5m1的种 子培 养基。然后将接种藻朊酸的腔溶液缓慢漓加到80ml4 (W／W)CaCI z溶液中，并不断搅 拌 。经 过 1 h后，完成腔粒形赢。埙析掉CaCI=溶液将寝粒例八含发酵培养基的三角摇瓶中。在30‘C下1 S0r／rain 回转摇柬上避光培养。 1．3分析方法 1．3．1自由细胞液体发酵色价的测定。 取2 ml播匀的发酵液．用2 dOm175 的乙醇溶液30’C保温浸出8 h后滤纸过滤．再用10m175 乙 醇 溶液洗涤滤渣两次，将憾液以75 乙醇溶液稀释至合适的倍数，对于发酵过程申嚣加活性碳处理的发酵 液则将滤渣包八滤纸申，在索氏抽提器中用75 乙醇进行回流提取色素，直至回流完全为止，苒将凰流 }茛用7 5 乙醇稀释至合适倍数。然后将稀释液在410nm处分别进行比色，再将比色值乘以总稀释倍数． 分剐得至 黄色素及红色素的量 (单位U／皿I)。总色素的量为黄色素及红色素量之和。 1．3。2固定化细胞发酵色价的测定 均匀取20ml固定化的发酵液 (含固定化胶粒)憾羝过 滤 ，将 胶粒 (台滤渣)溶解在4％ (W／W)Na zHPO,溶液申．再将溶解的肢粒与滤液混合，然后加八75 乙醇溶液30‘C保温浸出8 h后滤纸过滤，再用10m115 乙醇溶液洗涤滤渣两次，将滤液以75 乙醇溶液 稀释至合适的倍数，对于活性碳处理的发酵液，色素提取方法同1．3．1。之后再 以1．3．1所述的方法测定硅 计算固定化细胞发酵液色价 (W／m1)。但计算稀释倍数时，娶将发酵体积减去胶粒的体积为计算。 1．4主要仪器设备 INFORS AG CH--41 03 BOTTMINGEN摇 (日本产)。 HANNAPHepl酸度计 (意大利产)。 培养箱 灭菌锅，天平、721分光光壹计及其它常规实验仪器等。 2结果与分析 2．1自由细胞发酵与固定化细胞发酵色价的比较 在两种发酵中，每隔12h取一次样，将测定结果刊 1。 裹 1 自由细胞发尊与臣定化细胞发尊产色的比较 (色价单位t v／m r) l2 24 38 48 8O 72 84 98 1O8 120 132 244 自 由 黄色素 3．9 B．B T．0 10．4 23．2 30．6 45．4 54．4 8B．3 93．3 94．3 85。5 细 胞 红色素 4．2 7．0 8．5 10．5 24．6 37。4 51．3 81．5 97．4 107．8 115．2 118．1 发 酵 总色素 8。1 13。6 15．5 20．g 47．8 68．0 96。7 135．9 18 3．7 201．1 209。5 203。6 固 定 黄色素 1。4 2．1 2．6 4．8 l1．6 l5．3 l?。l 22。7 28．2 30．2 31．1 28。3 细 胞 红色素 1．3 2．2 2．7 5．3 12．3 1B．5 19。2 27．8 30．4 32．8 34。6 36．1 发 酵 总色素 2．7 4．3 5．3 10．1 23．g 31。8 36．3 47．5 58．B 63．0 85．T 64．4 由上表可以看出，固定化细胞发酵所产色素比自由细胞发酵所产生的色素要低，发酵至l 32h时，固 定化细胞发酵所产色素只有自由细胞发酵产色的 31．4 4 维普资讯 http://www.cqvip.com 2．2 添加活性碱对自由细胞发酵的影响 自由细胞皇酵中，舔)】i1 2％均活性碳， i不添加淆性碳相比较，其结果剐表 2 寝 2 瀑加活性碳与香对自由细胞发尊的膨 (色价单位 u／m1) — ＼ 、 分 、 12 24 36 48 6 0 72 84 06 1OB 120 1 32 144 耒添加活 黄色素 3．9 6．6 7．O 1O．4 23．2 3D．6 45．4 54．1 88．3 93．3 94．3 85．5 性碳的自 由细胞发 红色素 4．2 ．0 8．5 1O．3 24．6 37．4 51．3 8I．5 97．4 I ．8 115．2 11B．1 酵过程 总色素 B．1 13．6 15．5 20．7 47．8 68．0 0B．7 135．9 183．7 201．1 209．5 203．6 霾哿雷酱 黄色素 4．0 5．9 7．7 0．8 26．4 33．O 44．O 84．5 83．1 90．6 97．4 90．5 细胞发酵 红色素 3．3 5．5 9．O 0．2 21,6 34．3 47．5 72．7 9 ．4 115．2 104．9“3．2 过程 总色豢 7．3 11．4 18．7 19．0 48．0 67．3 91．5 137．2 180．5 205．8 202．3 2 03．7 由上表可 以看出，添加活性碳与否对发酵过程产色的影响并不大，可 以认为在 自由细胞发酵过程中 添加活性碳与否并不影响发酵产色。 2．3添加活性碳对固定化细胞发酵过程的影响 在固定化细胞细胞发酵申，在发酵液申舔加2 的活性碳，将与柬添加活性碳的固定化细胞发酵过 程相 比较．将结果列表 3。 裹 5 瀑加活性碳与否对圈定化细臆发尊的群确 (色价单位t u／m r) ＼ 舸 分 类 ＼ 12 24 35 48 8O 72 B4 95 1咐 129 132 】44 、 、 桌添加活 黄色素 1．4 2．1 2．6 4．8 11．6 15．3 17．1 22．7 28．2 3O．2 31．1 28．3 性碳固定 红色素 1 ． 3 2．2 2．7 5．3 12．3 16．5 19．2 24．8 3O．4 32．8 34．6 36．1 化细胞发 酵过程 总色素 2．7 4．3 5．3 10．1 23．9 31．8 36．3 47．5 58．6 63．0 85．7 61．4 黜麓 黄色素 5．0 7．4 12．O 15．7 41．4 61．5 78．O 113．2 150．9 157．7 171．2 153．8 细胞 发酵 红色素 4．7 10．O 12．3 2C．8 44．6 56．8 96．1 124．0 188．T 182．2 107．6 204．4 过程 总色 素 0．7 17．4 24．3 36．5 86．O 118．3 172．1 237．2 319．6 339．9 388．B 358．2 由上表可以看出，漾加活性碳后，极大地提高了固定化细胞发酵的色价，与表 l中自由细胞发酵相 比较．发酵舔加活性碳的固定化细胞发酵比自由细胞发酵要高得多，在发酵至 1 32h相比 ．总色价提高 了7 6 ，由此表可见．舔加活性碳蚵固定化细胞发酵体系比自由细胞发酵体系对色价提高有利。 5讨谵 本文所研究的固定化细胞发酵体系在发酵中观察，细胞在发酵中良好地固定在藻阮酸钙胶粒中．固 定化效果较好。固定化的目的是模仿固态发酵中菌丝体停留在大米粒内部。将发酵完成后的胶粒切开后 观察，发现菌丝体及产色主要集中在胶粒的外层。柬添加活性碳的固定化细胞发酵体系产色要比 自由细胞 低，应该是细胞固定化后，营养物质及氧的传递速率都受到一定的抑制。而且所产色素集中在胶粒内，也可 能造成了产物抑制 (Mak et a1，1990)，之后由于验证了霹加活性碳对自由细胞发酵并无影 响 ，但 是，添加了活性碳的固定化细胞发酵产色得到了极大地提高。而且显著高于自由细胞发酵，这说明产物 (色素)抑制是极其重要的。通过添加活性碳解除产物抑制后，极大地提高发酵色价，说明固定化细胞 发酵比自由细胞发酵具有明显的优势。达可能是由于在固定化培养中，能给细胞提供某种支架，防止由 于剪切力的作用而切断菌丝体，增加了发酵细胞密度所致。 李文结果对红曲色素连续化液体发酵提高发酵色价提供了一种良好的途径． (下转第12页) 维普资讯 http://www.cqvip.com ojS 毫0¨．5 禁 0-4 替 0 ．35 0．3 0 1 2 3 4 5 6 时简∞ 图7还 剂Vc、异Vc、Na SO a对吸光度影啊 430 450 4，o 490 510 530 光渡长(n呻 图9 不同P 值条件下光波长与色素吸光度曲线 0．6 n55 霎菘 035 0．3 0 1 2 3 4 5 6 加热时闻0O 图8不同金属离子条件下加热时间T对色素吸光度曲线 2． 色素随PH值的变化规律 从图9可见，在PHI~5的范围内，该 色 素 的 红色暧收峰 (505rim)随PH值升高而 逐 渐下 降， PH5时完全消失．据文献报道(‘]，只有花 色 甙 类 色素随PH改变会出现这种变化，这是由于PH改变 导致花色素分子结构也相应发生变化。此变化进一 步说明黄刺玫色素属花青素．至于属于花青素中哪 一 种配糖体殛结构组成如何．尚有待于 进 一 步研 究． 5小 结 缘上所述，黄刺玫色素属花青素，该色素的热 稳定性，光稳定性，耐还原性，耐氧化性均较差， 铁离子会影响色素的结构，而铜、钙，镁等离子对色素无影响．从开发利用的角度考虑，必须进一步研 究如何提高该色素的稳定性，这样才能使黄刺玫色素成为可利用的商品进八市场． 参考文献 1刘天慰．太原植物志第一卷．北京；学术书刊出版社，1990·493 2张云峰．太原植被．北京；中国科学技术出版社，Iggl·52 3王常青，李宁等．中国公共卫生学报，1994~13【5)-320~321 4 K·R马卡姆著．黄酮类化台物结构鉴定技术．北京-科学出版社，lg76t 7g~120 ●自 蛐 蚺 抽 曲 曲 曲 埔 曲 抽 抽 棚 旃 曲 抽 ●湘 (上接第15页) 参考文献 l Chiu S W Poon YK ．1893．Brief article submerged production of M onascus pigments， Mycolo~ia，85 (2) J 214~ 218 2 Lin C．1973．Isolation and culture conditions of MOflaSCUS spp．for the production of pi~ment in a submerg,ed 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