采用微型包囊技术研制活性双歧联菌微囊微生态制剂

《广州食品工业科技 ． ：：苎竺堕：苎竺 兰堡堕：堕塑叁 簦 !：!!：兰!!型 ! — _ _ _ _ _ - — — — — _ _ _ _ _ _ - — _ _ _ _ _ - _ - — _ ● - _ _ _ ● - — — — _ _ _ _ _ - — — — — — _ ● _ _ - - — — — — ● _ _ _ _ _ - — — — _ _ _ _ _ _ — — — — ● — _ _ - _ — — — — - — — — — — — — — — — — 一 一 一 文章篇号：1 007—2764"(2003)增：FIJ-O01 2—038 采用微型包囊技术研制活性双歧联茵微囊微生态制剂 杨汝德 肖仔君 陈惠音 (华南理工大学食品与生物工程学院 广州5 1 0641) 摘 要： 针对双歧杆菌活菌制剂在口服时，不耐受强胃酸，活性菌在有氧条件下容易失活，常温下保存期短等存在问题，将微型 包囊技术应用于微生态制剂中，并已研制成活性双歧联菌株耐酸肠溶微囊微生态制剂，获得较理想的效果。本文介绍了双歧联菌株混 合培养．Y-艺条件的优化研究，活性双歧杆菌冻干保护剂和冻干条件的确定，微型包囊复合囊材配方的优化研究，最佳微型包囊方法 的确定及微囊化条件的研究，含活性菌微囊的耐酸肠溶试验，含活性菌微囊的保存稳定I陛试验，50升发酵罐中试结果，以及活性双歧 联菌株微 囊微生态制剂的研制等。 关键词：活性双歧联菌；微型包囊技术；耐酸肠溶微 囊；微生态制剂 随着对双歧杆菌有益于人体健康研究的不断积 累，随着现代人追求健康饮食需求的不断扩大，各种 利用活性双歧杆菌的食品或药物相继推出并 日渐普 及。目前国外已有70种以上的产品问世，其中大多数 为乳制品。在 日本，双歧杆菌制品占总酸乳量的三分 之一。日本健康食品协会将含双歧杆菌的功能食品列 为健康食品，并指明双歧杆菌可用于产妇食品及幼儿 特殊营养食品中。在欧洲，双歧杆菌制品也已成为发 酵乳制品中发展最快的部分。我国从 90年代初开始将 双歧杆菌用于各种健康食品中，如三株口服液、双歧 天宝口服液等，也将双歧冻干菌粉作为生物制品用于 治疗肠道疾病，如培菲康、丽珠肠乐等。 但是，双歧杆菌对营养条件要求高，对氧极为敏 感，对低 pH值耐性差，容易失活。产品在常温下销售 和消费过程中活菌含量迅速下降，如双歧杆菌液体制 剂在几天内活菌数就会下降一个数量级，冻干菌粉在 一 般贮存温度下也只能保存几个月。此外，双歧杆菌 要能够对人体产生有益作用，首先它必需安全通过胃 环境，以大量的存活菌到达肠道并定殖于肠粘膜上。 但由于胃酸的杀菌作用，双歧杆菌的活菌数在此过程 中也会大幅度下降。 微型包囊技术又称微囊化技术，采用该技术制成 的产品具有 良好的功能性质和贮存稳定性，可以解决 传统工艺所不能解决的问题。目前这一技术已开始用 于保护生物活性分子、组织或细胞，以对抗不利的环 境并在贮存期内保持它们的活性。微型包囊技术是生 物制品和功能性食品重点开发的高新技术之一。但将 该技术应用于双歧联菌株活菌制剂的制备，技术难度 较大。 38 针对双歧杆菌活菌制剂在口服时，不耐受强胃酸， 以及活性菌在有氧条件下容易失活，常温下保存期短 等存在问题，华南理工大学食品与生物工程学院己将 微型包囊技术应用于微生态制剂中，并已获得较理想 的成果。所采用的微型包囊技术能有效地保护双歧杆 菌的活性，制成的微囊除含有大量活性菌外，还具有 良好的耐胃酸和肠溶性能，表明微囊中的活性菌能顺 利通过胃酸到达肠道发挥作用。由这种微囊制成的新 型高效微生态制剂，在常温下的货架期可达一年以上。 在国外，日本是世界上最早将微囊化技术应用于 微生态制剂的国家，如 日本森下仁丹公司采用疏水微 胶囊技术研制的 Bifina10号，一次性可把十亿个活菌 安全通过胃酸第一关，直接送进肠道。 在国内，最早开展此项研究工作的是华南理工大 学食品与生物工程学院 (1996年初巳开始)，自 1997 年至今巳在学术刊物和国际会议上发表有关研究论文 l0多篇。采用微型包囊技术制备活性双歧联菌株耐酸 肠溶微囊制剂，属国内首创。所研制成功的新型高效 微生态制剂，口服一次也可把十亿个以上的活性菌安 全通过胃酸送进肠道，实际上也巳达到上述日本森下 仁丹公司的技术指标。 根据广东省科技情报研究所查新报告的结论以及 专家鉴定意见，该项技术成果达国内领先水平。将微 型包囊技术，应用于活性双歧联菌株耐酸肠溶微囊制 剂的制备，具有创新性，国家知识产权局 已于 2001 年 9月，将该专利申请在发明专利公报上公布，并已 进入实质审查程序。 1 双歧联菌株混合培养工艺条件的优化研究 维普资讯 http://www.cqvip.com 《广州食品工业科技》 “益生菌、益生元与健康”研讨会论文集 Vo1．19．增刊 (总 77) 所采用的菌种为 A：短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、B：两歧双歧杆菌 (Bifidobacterium bifidum)、 C：青春双歧杆菌 (Bifidobacterium adolescentis)、D． 婴儿双歧杆菌 (Bifidobacterium infantis)，四种双歧 杆菌均采用浓度梯度法进行较长时问的耐酸耐氧驯 化，最终选育获得比出发菌株对低 pH和氧敏感性较 低的优良菌株作为试验用菌。 双歧杆菌活菌制剂根据其所使用菌种数的不同， 可分为单菌株制剂和联菌株制剂。联菌株制剂更适应 于不同年龄段的人食用，因为婴儿双歧和短双歧杆菌 只在婴幼儿和儿童的肠道内存在并占优势，而成年人 的肠道内则以青春双歧和两歧双歧杆菌为主。 双歧联菌株混合培养工艺条件的优化重点放在两 方面的研究：一是筛选高效生长促进因子，进行优化 组合后添加于培养基中，考察其对双歧杆菌的促生作 用。经选定的组合型高效促生因子主要包括大豆酶法 水解液、酵母抽提液、牛肝浸出液和低聚果糖等；二 是采用正交试验法分别对培养基和培养条件进行优 化，包括对碳源、氮源、无机盐类、还原剂、起始 pH、 培养温度和时间、混合气通入形式等进行优化。 此外，为了使上述菌株在混合培养中生长较均衡， 根据各菌株生长速度的快慢，还适当控制其接种量和 接种时间的不同。经混合培养工艺条件的优化研究， 使发酵培养液在对数期后期 (16--18h)，活菌数达 l0m 个 ／ml以上，最高曾达 2．8×10Ⅲ个 ／ml。 2 活性双歧杆菌冻千保护剂和冻千条件的确定 双歧杆菌在不加保护剂的条件下冻干，存活率极 低。必须筛选高效活菌冻干保护剂，才能最大限度保 存其活性。经试验，表明海藻糖是最佳的活菌冻干保 护剂，但来源有限且价格高，宜少用。研究结果采用 组合多种冻干保护剂的方法。具体做法是：经离心收 集的湿菌体，先添加少量海藻糖，置厌氧低温条件下 作用 lh，使渗入细胞，再加入适量的其它六种保护剂， 混匀后于．70~C速冻 30rain，再移至冷冻真空干燥机冻 干约 2天。按上述优化的冻干保护剂和确定的冻干条 件，冻干粉活菌数高达 10¨ ~,-／g以上，最高达 4xlO¨ -l~／g。 3 微型包囊复合囊材配方的优化研究 用于双歧冻干菌粉微型包囊的复合囊材包括肠溶 性材料和辅料。本研究详细比较了ESM．1、ESM-2和 ESM-3三种肠溶材料的各种性能，从溶解性、呈雾性、 呈膜性、耐酸性、肠溶性和安全性等诸方面考察的结 果，最终选取了ESM-2作为肠溶性囊材，最佳浓度确 定为 10％。 辅料的添加是为了改善囊液和囊膜的特性，主要 是提高囊液的分散性，增加囊膜的塑性以及减小囊膜 的渗透性等。添加的主要辅料包括 DEP和 MSE。各 种成分的最适添加量均采用正交试验确定。 4 最佳微型包囊方法的确定及微囊化条件的研究 微型包囊方法很多，可分为物理法、化学法和物 化法，而各大方法又可细分为多种方法，但对于微生 物细胞，国外文献曾报道的有界面聚合法、相分离凝 聚法和挤压法等。由于活性双歧杆菌比普通微生物细 胞更为 “娇气”，作为囊心物质不比一般药物或活性 蛋白质那么稳定，在一般的微囊化条件下很容易失去 活性，这就给微型包囊技术增加了很大的困难。经过 采用多种微型包囊方法的比较试验，最后选定了采用 流化床微型包囊法。 微型包囊操作条件包括无菌空气的压力、流量、 分布、温度、湿度、物料处理量、流化状态等。控制 的最佳微囊化操作条件为：无菌空气压力 2~3kg／cm 、 流化床空气流量 10---12 m ／h、热空气温度 40---50℃、 空气湿度为 RH 50 ～70 。 成品微囊呈近球形颗粒，不粘连，颗粒大小多数 在 60---100目，微囊的活菌数高达 5x109／g)以上，最 高达 10Ⅲ~i"／g。 5 含活性菌微囊的耐酸肠溶试验 双歧杆菌的最大缺点是不耐氧不耐酸，在较大的 酸性条件下很容易失活。据报导，口服冻干菌粉，在 胃中的存活率仅为百万分之一左右，存活率极低。采 用微型包囊的 目的，一方面是隔绝氧气，延长活菌存 活期，另一方面是保护活性菌免受胃酸的杀害而顺利 进入肠道发挥作用。故必须对活性微囊进行耐酸肠溶 的考察试验。 将上述制备的微囊和未经包囊的冻干菌粉在人工胃液 (pH2．0，37~C，搅拌)中处理 2h，结果冻干菌粉的存活 率极低，不到千万分之二。而囊衣较厚的微囊A，在 人工胃液中处理 2h后，存活率仍高达 60％。 微囊 B 由于包囊衣较薄，或有的包得不够均匀，故偏低些， 但实际存活的菌数仍在同一数量级 (3x10 -~／g)，意味 着每口服 1 g微囊，大约有十亿个以上的活菌可安全 通过胃酸进入肠道。 上述微囊同时用人工肠液 (pH6．8，37"C，搅拌)处 理，结果微囊 B在‘20min内崩解完全，崩解率为 95 39 维普资讯 http://www.cqvip.com 《广州食~-r,ll,科技》 · “益生菌、益生元与健康”研讨会论文集 Vo1．10．增刊 (总 77) ％；而微囊A因囊衣厚，崩解时问则持续到约30min。 发酵液于管式高速离心机离心收集菌体，三批分 可见不宜一味追求微囊在人工胃液中的高存活率，而 别获得湿菌体为 25 、28 和 32 ，加入复合活菌 忽视微囊的肠溶性能和时间，这样反而影响微囊的质 保护剂后，直接于冻干机冷冻干燥约2 d，三批得冻干 量又浪费囊材。 菌块分别为 2．1kg、2．3l(g和2．6kg。 在中试时采用经改进后的囊材，制成的微囊在人工 肠液中的崩解时间仅为 10rain，肠溶性更佳，超过预 期指标 (30min)。 16 含活性菌微囊的保存稳定性试验 按常规加速试验法，若将产品置 37---40℃、相对 湿度 75％条件下放置 3个月后，所测得的考察项 目指 标仍在所要求的范围内，则此产品可暂定有效期为2 年。珠海丽珠集团规定，将丽珠肠乐硬胶囊在恒温 37 ℃、相对湿度 60-65％条件下储存 3个月，若存活率 在 10％以上，则相当于在室温下可储存 1年以上。参 照丽珠肠乐的指标，将样品置 37℃，内盛饱和 NaCl 溶液的密闭容器中 (相对湿度约 70％)，对上述微囊 进行保存稳定性考察。经 37℃、RH70％的常规加速 试验和常温留样观察，结果表明含活性菌微囊的常温 保存期在 1年以上，存活菌数在 10 +／g以上，超出 预期 目标 (常温 l 个月，活菌数 l0 个／g以上)。 7 501_和 1OOL发酵罐中试结果 在实验室研究的基础上，先后在 50L发酵罐 (连 续三批)和 l00L发酵罐 (连续二批)进行发酵中试， 均取得满意的结果。现以50L发酵罐中试为例说明其 工艺过程： A．种子培养基：采用 NPNL培养基 (略) B．发酵培养基组成：葡萄糖、牛肉膏．胰蛋白胨、 大豆酶解液、酵母抽提液、牛肝浸出液、低聚果糖、 磷酸氢二钾、氯化钠等。 C．发酵条件控制：培养基起始 pH7．2~7．4，接种 后 pH6．5~6．8。二级种子分别于 38℃培养 16h后接入 发酵罐，接种量 10％，发酵温度 37～38~C，发酵时间 1 18h，发酵过程缓慢通入混合气体 (氮气、二氧化 碳、氢气)，维持罐压 0．1 kg／crfl 以上。 8 活性奴歧联菌株微囊微生态制剂的研制 上述三批冻干菌块分别磨成细粉后，先于包衣锅 中以40％低聚果糖液喷雾造粒，热风干燥。以菌粉颗 粒为囊心材，采用流化床徵型包囊技术进行包囊。控 制条件为；菌粒 (囊心)量 200~300g，无菌空气压力 3---4 kg／cm0，热空气温度 40--45℃，空气流量：流化床 为 1．o~l。2 m ／min，囊衣液流量 50ml／h，包囊时间约 1 h，制成60~100目的活性双歧联菌株微囊。 上述三批中试制备的微囊，各取等量混合后，经 广州军区总医院药学部检测，活菌数约为 8×l 个儋， 在人工胃液中处理2 h不崩解，活菌数约为 5x109个 ／g，存活率为 60％以上；在人工肠液中崩解时间仅为 19rain以下，耐酸肠溶性能良好。 上述制备的微胶囊可进一步制成各种新型高效的 微生态制剂 (功能性食品或生物制品)，例如分别取等 量的上述三批中试微胶囊，均匀与其它辅料混合后， 可压制成乳片剂。乳片剂经广州市卫生防疫站进行安 全性毒理学评价和卫生指标检测，结果证明其安全性 好，卫生指标符合要求。 参 考 文 献 l 许燕滨等．双歧杆菌微胶囊热稳定性研究．广东工业大学学 报，200 1，l 8(41)：86,--89 2 吴彩云，杨汝德．新型高效微生态制品的研制．微生物学杂 志，2002，22(5)：32-33 3 杨汝德等．双歧联菌株微胶囊的制备条件(英)．华南理工大 学学报，2001，29(10)：6,--9 4 张丽君等．双歧联菌株微胶囊制剂的改进．中国微生态学 杂志，2001，l3(4)：21O~2l2 5 Chick，H．S．Shin，Z．Ustuno1．2001．Growth and Acid ProductionbyLacticAcidBacteriaandBifidobacteriaGrowth in Skim Milk Containing Honey．JOURNAL OF FOOD SCIENCE 66：478~48 l 6 M．N．Oliveir~ etc．2002． Man ufacture ofFermented La ctic Beverages Containing hobiotic Cultures．JOURNAL OF FOOD SCIENCE．67：233 34 l (下转第 35页) 维普资讯 http://www.cqvip.com 《广州食品工业科技》 “益生菌、益生元与健康”研讨会论文集 voI．19．增刊(总 77) Yan Jiwen，Lai W eidong，Zhu Haiming，Song M andancHuang Jicheng,Dai Changfang (Center for Disease Control and Prevention ofGuangdong province，Guangzhou,510300) Abstract：Aim To studythe regulativefunction ofthelivingpreparation ofBifidobaeterium on mouse intestinal florain vivo．Methods 40 BALB／C mice(male，18~22g)were randomly divided into 4 groups，3 experimental groups and I control group．These 3 experimental groups were fed differentdose ofthelivingpreparationofBifidobacterium bygavagefor 7 days．Fecesofmiceweredetermined before an d attheend Ofthe experiment．Results Th e results showed that the reproduction of Bifidobacterium an d Lactobacillus significantly increased with the increasing of Bifidobacterium dose．Comparing with be fore treatment,numbers of enterococcus in 3 experimen tal groups haven ’t obviously chan ged atthe en d ofexperimen t,but numbers ofEnterobacter obviously increased．Andthe increasing range ofEnterobacterwas lowerthan those of Bifidobacterium and Lactobacillus ．Conclusions：Th e living preparation of Bifidobacterium could regu late the intestinal flora, reproduce Bifidobacterium and lactobacillus，and inhibit spoilage bacteria． Keywords：Bifidobacterium；intestinalflora；livingpreparation (上接第 40 页) M icro—ecological Agent of the Viable Associated Bifidobacterium Prepared with M icro—encapsulation Technology Yang Rude，Xiao Zijun，Chen Huiyin (College ofFood&Bio-engineering，South China Univ．ofTech．，Guangzhou，5 1 0640) Abstract：Th ere ale some problems．For example，the viable Bifidobacterium agents have been deactivated when taken orally or passed through the stomach；the shelf life is short when they have been kept in the normal temperature ． In order to settle these problems， we have developed the micro- ecological agent ofthe viable associated Bifidobacterium ． which endured the high stomach acidity and got some good effect．In this paper,we introduce the study on the optimization with stimulated culture of the viable a~sociated Bifidobacterium，the confirm ability ofthe cryoprotectant and conditions f0r the freeze-dried．the study on the optimization ofthe form ula of the micro-encapsulation complex wall materials．the confirm ability of the optimization of micro-encapsulation and the study on the condition of micro-encapsulation，the experiment of endured the high stomach acidity and the conservative stabilization．the result of 501 ferm ent,the development ofthe micro-ecological agent ofthe viable associated Bifidobacterium ． Key words：viable associated Bifidobacterium；micro-encapsulation technology；endured the high stomach acidity micro．capsule； micro-ecological agent (上接第49页) Study on Processing Technology of Puerariae Radix Yoghurt Zhang Yan，Wei Zheneheng，Wang Zhijian，Chi Jianwei (Agro-biotech．Research Institute，Guangdong Academy ofAgricultural Sciences，Key Laboratory of Functional Food，Ministry ofAgriculture，Guangzhou，5 1 0640) Abstract：Preliminary investigation on processing technology ofpuerariae radix yoghurt with nutritional and healthy functions was reported·The results showed that good quality and white puerariae radix juice could be produced by using O．05％Vc+0．I％CA as coIor protecting agent·Good quality and tasteful puerariae radix yoghurt could be obtained by adopting following conditions：raw materiaI ratio ofpuerariae radixjuice and fresh milk 3：7，fermentation agent of I：1 mixture of ．bulgaricus and St ．thermophilus inocu1ation of 3％ ，sucrose 8％ ，fermentation temperature 42"(2 ． ferm entationtime 5h． ‘ Key words：puerariae radix；yoghurt；fermentation；processing technology 35 维普资讯 http://www.cqvip.com