活性乳酸菌乳饮品对免疫调节功能的影响

《广州食品工业科技》 “益生菌、益生元与健康”研讨会论文集 Vo1．19．增刊(总 77) 文章篇号：1 007—2764(2003)增刊-o009—030 活性乳酸菌乳饮品对免疫调节功能的影响 陈壁锋 黄俊明 黄建康 李文立 (广东省疾病预防控制中心 广州 510300) 摘 要 ：为探讨活性乳酸茵乳饮品对小鼠免疫系统功能的影响 ，将该饮品按 6．67 ～ 26．66ml／k Bw(2．5倍浓缩液 )剂量给 小鼠灌胃 30天后，分别检侧脾淋巴细胞增殖转化功能 (MTT法)，迟发型变态反应性，血清溶血素滴度，碳廓清能力及自然杀伤细 胞 (NK )杀伤活性。结果明该乳饮品可明显提高小鼠脾淋巴细胞增殖转化能力，溶血素血清滴度有统计学意义的增加，变态反 应性增强，碳廓清能力增强。而 NK细胞杀伤活性增加不明显，各组间无统计学意义的差异。提示该活性乳酸菌乳饮品具有增强机 体免疫功能的作用。 关键词：乳酸菌；免疫调节；小鼠脾淋巴细胞 乳酸杆菌、双歧杆菌等益生菌类 巳广泛应用于食 品工业中，目前认为这些细菌不仅对人体建康没有任 何危害，而且对人体具有保健作用，能够改善宿主肠 道内微生物的平衡，促进肠道消化吸收，提高免疫力 功能。为了评价益力多牌活性乳酸菌乳饮品对人体免 疫功能的保健作用，本研究从细胞免疫、体液免疫、 非特异性免疫方面选择部分指标进行动物试验，结果 报告如下。 1 材料与方法 1．1 样品及剂量 益力多牌活性乳酸菌乳饮品由广州益力多乳品有 限公司提供，每lOOmi含lO0亿 埒曛籽 Lactobacillus easelshirota)。推荐日服量为每天 20Oral，按 60公斤成 人计为 3．333ml／kg b．W ，本试验采用生产厂家提供的 市售品2．5倍浓缩液，折算后每日推荐量为 1．333ml／kg b．w。设对照组和低、中、高三个剂量组，剂量分别为 0、6．67、l3．33、26．66 ml／kgb．W的2．5倍浓缩液，各 剂量组所需浓度均用纯净水稀释样品配成，每天按 30ml／kg b．W量灌胃动物给予受试物。 1．2 动物 SPF级昆明种小白鼠，6．8周龄 (体重：雌性 18—22g)，由第一军医大学医用动物场提供 (动物合格 证号：2002A029)。动物实验室为 SPF级 ，合格证 粤检证号 2003C008。室温 22±2℃；湿度 50．8O％。 r．3 试验方’7去l 1 动物在实验室条件下检疫一周后，每个实验均为 随机将 48只小鼠分成四组，每组 l2只，时间为 30d。 1．3．1 脾淋巴细胞转化试验 (MTT法) 脾细胞悬液制备：无菌取脾，置于盛有适量无菌 Hanks液的小平皿中，用钳子轻轻将脾撕碎，制成单 个细胞悬液。经 200目筛网过滤，Hanks液洗 3次， 然后将细胞悬浮于2ml的RPMI 1640完全培养液中， 用台酚兰染色计数活细胞数 (应在 95％以上)，调整 细胞浓度为 2×l0。个／ml。 淋巴细胞增值反应：将细胞悬液分两孔加入 24 孔培养板中，每孔 lml，一孔加 50 lConA 液 (相当 于 5lag／m1)，另一孔作为对照，置 5％ CO2、37℃中 培养 72 h。培养结束前 4h，每孔吸去上清液 0．7 ml， 加入 0．7 ml无血清 RPMI 1640培养液，同时加入 MTT (5mg／m1)50 la l ／孑L，继续培养 4h。培养结束后， 每孔加入 lml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶溶 解，分加于 96孔培养板中，作 3个孔的平行样，以 570rim波长测定光密度值。 1．3．2 迟发型变态反应试验 (足跖厚度增加法) 实验结束前第4d用 2％(v／v)绵羊红细胞腹腔注射 0．2ml致敏动物，4d后测定左后足跖部厚度，接着于 该处皮下注射 20％(V／v)绵羊红细胞 20 l，注射后 24h 测定左后足跖部厚度，得足跖部厚度前后差值。 1．3-3 血清溶血素滴度测定 (血凝法) 实验结束前的第4d每只鼠腹腔注射2％的绵羊红 细胞 0．2ml，4d后摘除眼球采血，分离血清备用。凝 集反应：用生理盐水将血清倍比稀释于微量反应板内， 各 5O 1，加入 0．5％的绵羊红细胞 50 1，混匀，装 入湿润方盒内盖好，置于 37℃温箱 3h后，观察抗体 凝 集 反 应 程 度 ，计 算 抗 体 积 数 f抗 体 积 数 = S~+2S2+3S3⋯⋯+nS ，l、2、3⋯⋯n代表对倍稀释的 指数，S代表凝集程度的级别1。 维普资讯 http://www.cqvip.com 《广州食品工业科技》 “益生菌、益生元与健康”研讨会论文 !：!!：．塑型 璺 1．3．4 小鼠碳廓清试验 末次给药后在每鼠尾静脉注射 0．1 ml／l 0g．b．w 的 印度墨汁(1：4稀释)，立即计时，间隔 2、10min分别 从内眦静脉丛取血 20 u l，加入 2ml Na2CO3溶液中， 用 721分光光度计于 600nm 波长处测 OD 值，用 Na2C03溶液做空白对照，同时处死小鼠，取肝、脾 脏称重，计算吞噬指数【吞噬指数 a=体重／(肝重+脾 重) K“ ，K=(1gODt-lgOD2)／(t2-tO，t2-tt代表两次取 血时间之差，lgOD--lgOD2代表两次血样测得光密度 对数值之差1。 1．3．5 NK 细胞活性测定 (LDH法) 脾细胞悬液的制备与脾淋巴细胞转化试验相同。 NK细胞活性检测：取浓度为 1X10 个／ml的 YAC．1靶 细胞和脾细胞悬液 (效应细胞)各 100 u l(效靶比 50： 1)，加入 U型 96孔培养板；靶细胞 自然释放孔加靶 细胞和培养液各 100 u l，靶细胞最大释放孔加靶细胞 和 1％NP40各 100 u l；上述各项均设三个复孔，于 37 ℃、5％C02培养箱中培养 4h，然后将 96孔培养板以 1500 r／min离心 5min，每孔吸取上清 100 u l置平底 96 孔培养板中，同时加入 LDH基质液 100u l，反应3min， 每孔加入 Imol／L HCL30 u l，在酶联仪 490nm处测定 光密度值。 1．4 数据处理 用 SPSS 1 0．0软件包进行方差。 2 益力多牌活性乳酸菌乳饮品的实验结果 2．1 对小鼠脾脏重量和胸腺重量的影响 结果如表 1所示。各剂量组的脏器 ／体重比值与 对照组比较差异均无统计学意义，表明益力多牌活性 乳酸菌乳饮品对小鼠的脾脏重量和胸腺重量无明显影 响。 表 I对小鼠胸腺、脾脏重量的影响 (N=I2， ±S) 注：剂量为2．5倍浓缩液，表 2，3、4、5、6下同 2．2 对小鼠的迟发型变态反应的影响 结果如表 2所示。中、高剂量组足跖增厚值与对 照组比较，差异有显著性意义，表明该项试验结果为 阳性。 表 2对小鼠迟发型变态反应的影响 ( ±S) 2_3 对 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验的影响 如表 3。各剂量组光密度差值升高，高剂量组与对 照组 比较，差异有非常显著性意义，表明益力多牌活 性乳酸菌乳饮品的脾淋巴细胞转化试验结果为阳性。 表 3 对小鼠脾淋 巴细胞转化的影响 ( ±S) 2．4 对受试动物血清溶血素抗体滴度的影响 结果见表 4。各剂量组的抗体积数高于对照组， 中、高剂量组与对照组比较差异有显著性意义。表明 益力多牌活性乳酸菌乳饮品对受试动物血清溶血素抗 体滴度检测结果为阳性。 表 4 对小鼠血清溶血素抗体滴度的影响( ±S) 2．5 对小鼠碳廓清吞噬功能的影响 表 5对小鼠碳廓清吞噬功能的影响( ±S) 删 剂量 bml／kg b． 碳廓清吞噬撒 与 ㈦ ．w (只) ⋯ (与对照组比) 结果如表 5。中、高剂量组吞噬指数与对照组比 3l 维普资讯 http://www.cqvip.com 《广州食品工业科技》 “益生菌、益生元与健康”研讨会论文集 Vo1．19．增刊(总 77) 较，差异有统计学显著性意义。表明益力多牌活性乳 NK胞活性，增强小鼠脾细胞产生 IL--2的能力p 。同 酸菌乳饮品的碳廓清吞噬试验为阳性结果。 时由乳酸菌发酵过程产生的非细菌功能成份也具有免 2．6 对受试动物 NK细胞活性影响 疫刺激作用【6J。本实验观察到，每天给予 6．67、13．33、 结果见表 6。各剂量组的 NK 细胞活性与对照组 26．66 ml／kg b．w 2．5倍浓缩的益力多牌活性乳酸菌乳 比较，差异均无统计学的意义。 饮品，即相当于市售品 l6．67、33．33、66．66 ml／kg b．w 表6 对小鼠NK细胞活性反应的影响( ±S) 30天，可提高绵羊红细胞诱导的小鼠迟发型变态反应 表示：转换值=Sin (NK细胞活性“ ) 能力，增加足跖厚度；使 ConA诱导的小鼠脾淋巴细 剂量 动物数 P值 组别 Nl(细胞活性％ 转换值· ml／kgb．w (只) (与对照组比) 胞转化率升高；可使受试动物血清溶血素抗体滴度明 显增加；可增强小鼠单核一 巨噬细胞吞噬功能。结果 表明，益力多牌活性乳酸菌乳饮品具有增强免疫力功 能作用。 3 讨论 2 近年来，随着微生态学研究的不断发展，越来越 多的实验证明有益细菌对人体健康的重要作用。在人 3 的肠道中生存着 100种以上的细菌，形成了肠道内菌 丛，这些细菌以某种方式与营养吸收、物质代谢、感 4 染性疾病、肠道免疫、炎症等相关。因此，为改善肠 道内微生物的平衡，可对宿主投予有益的活菌制剂， 达到防病保健的 目的。乳酸菌作为一类食品级的对人 体健康有益的菌群，其提高机体免疫功能等重要作用 巳得到较为充分的肯定【2 。有研究资料表明，乳酸菌 6 的细胞壁肽聚糖和胞外多糖能促进体外脾淋巴细胞的 增殖活化，提高巨噬细胸吞噬异物的能力，增加体外 参 考 文 献 卫生部卫生监督司．保健食品功能学评价程序和检验方法． 卫监发『l996]第 38号 顾瑞霞．伊明．乳酸菌抗肿瘤特性的研究进展．中国微生态 杂志，1999，l1(4)：253 程 波 财 ，魏 华 ．乳 酸 菌 与 肠 粘 膜 免 疫 ．中 国微 生态 杂 志，2001，13(5)：302 张洪泉，顾瑞霞，许爱华，等．五株活菌型乳酸对荷瘤小 鼠的 免疫调节作用．药物生物技术，l 996，3(2)：l 0 l 顾笑梅，王富生，孔健，等．乳酸菌 Z222产胞外多糖(EPSI)对 免 疫 细 胞 功 能 的 影 响 ．中 华 微 生 物 学 和 免 疫 学 杂 志，2003，23(6)：442 伊冰．酸奶的免疫作用．国外医学卫生学分册，2001，28(2)： l1 1 Effects of active Lactobacilli M ilky Beverage on Enhancing the Immune System Function in M ouse Chert Bifeng，Huang Junming,Huang Jiankang，Li W enli (Center for Disease Control and Prevention ofGuangdong Province，Guangzhou，5 10300) Abstract：To explore the effects of active Lactobacilli milky beverage on mouse immune system，doses of 6．67~26．66 ml／kg BW(2．5 times concentratedliquid)were adopted tofeedmicefor30 daystest．Afteradministration，mouse spleenlymphocytoliferativefunction(Mrr method)，sertlm antihemolysin test,delayed type hypersensitivity(DTH)，carbon clearance test and natural killer(NK)cell function were investigated．The results showed thatthismilkybeverage can significantlyincreasethespleenlym phocytesproliferationfunctionas wellas the serum antihem olysin．Both delayed allergyandcarbonbloodclearancefunctionwere more increasedinthebe verage-treated groupsthan thatof the controlgroup．Andno apparentdifferencesofNK cell functionwere observed be tween all groups．In all，the results suggestthatthis active Lactobacillimilkybeveragehasabilityofenhancingtheimmune system functionofthebody． Keywords： Lactobacillus；immune modulation；mouse spleen lym phocyte 32 维普资讯 http://www.cqvip.com