2型糖尿病小鼠骨骼肌细胞葡萄糖转运因子4转位变化的研究

[文章编号 ] 1000- 4718( 2007) 04- 0818- 02 [收稿日期 ] 2005- 08- 31 [修回日期 ] 2005- 11- 13 * [基金项目 ] 辽宁省教育厅基金资助项目 ( No. 2004D196) E- ma i:l w df8lm@ 163. com 2型糖尿病小鼠骨骼肌细胞葡萄糖转运 因子 4转位变化的研究* 王涤非1, 蔡东梅 1, 蒋丽娟 1, 邱忠霞 1, 林 杰 1, 张 锦 2 (中国医科大学附属第一医院 1老年病教研室, 2内分泌科,辽宁 沈阳 110001) [摘 要 ] 目的: 探讨 2型糖尿病小鼠的骨骼肌细胞的葡萄糖转运因子 4( GLUT4 )转位变化。方法: 6- 8周 龄的雌性 C57BL /6J小鼠随机分成对照组和 2型糖尿病组, 每组各 12只。对照组小鼠给予正常鼠膳食 16周。 2型 糖尿病组给予高脂高糖膳食 16周。用超速蔗糖梯度离心方法分离细胞内膜和外膜的匀浆,用W estern b lo tting方法 检测两组大鼠骨骼肌细胞内、外膜 GLUT4的蛋白水平。结果: 两组的内、外膜 GLUT4蛋白总量相近,经胰岛素刺激 后, 2型糖尿病小鼠骨骼肌细胞 GLUT4从内膜向外膜转位少于对照组。结论: 在非肥胖 2型糖尿病鼠,是胰岛素刺 激的骨骼肌细胞 GLUT4的转位下降,而不是 GLUT4数量的下降,导致了 GLUT4的下调,这种下调可能是导致 2型 糖尿病骨骼肌胰岛素抵抗的分子机制之一。 [关键词 ] 糖尿病, 非胰岛素依赖型; 小鼠; 肌, 骨骼; 葡萄糖转运因子 4 [ KEYWORDS] D iabe tes me llitus, non- insu lin- dependent; M ice; M usc le, ske leta ;l G lucose transpo rter- 4 [中图分类号 ] R363 [文献标识码 ] A 2型糖尿病人胰岛素刺激后的肌肉葡萄糖利用下降主要 是由于糖摄取和储存功能下降, 而骨骼肌葡萄糖转运体 4 ( g lucose transporter- 4, GLUT4)从细胞内膜向外膜转位是胰 岛素刺激下摄取葡萄糖的主要限速步骤。Garvey等 [1]发现 在 2型糖尿病和肥胖个体出现的葡萄糖转运率下降是由于 脂肪细胞 GLUT4数量下降的结果, De rsen等 [ 2]的研究却显 示, 在正常人、肥胖及糖尿病个体的骨骼肌细胞 GLUT4的 mRNA的表达和蛋白质水平是相似的。我们应用 2型糖尿病 C57BL /6J小鼠模型,检测小鼠骨骼肌细胞 GLUT4在细胞内、 外膜上的蛋白表达和转位变化, 探讨 2型糖尿病的骨骼肌葡 萄糖利用下降的原因。 材 料 和 方 法 1 动物模型的复制 6- 8周龄的雌性 C57BL /6 J小鼠, 购于中国医科大学实 验动物部。对照组和 2型糖尿病组各 12只。对照组小鼠给 予正常鼠膳食 (含 4%脂肪、24%蛋白、41 5%粗纤维 ) 16周。 2型糖尿病组给予高脂高糖膳食 16周, 其中 58% 为脂肪, 355 g /kg (主要为动物油 ) , 碳水化合物 366 g /kg (主要为蔗 糖 )。眶窦取血,测定血糖、血清胰岛素和血浆脂蛋白水平。 计算胰岛素敏感指数 ( insu lin- sensitiv ity index, ISI): l n 1 / ( F ins@ FBG )。 2 骨骼肌束的制备 术前所有小鼠禁食 14 h, 应用苯巴比妥 ( 50 m g /kg BW, ip)麻醉后,立即手术剥离开前腿骨骼肌, 钳夹、切除全部骨骼 肌活组织, 放于用氧饱和的 K rebs- H ense le it缓冲液中。然后 从肌肉活组织块中挑出 6条 30 - 40 mg的肌肉丝 ( m usc le strips)。每个标本取 3条肌肉丝孵育于包含 1% BSA 和 51 0 mm o l/L g lucose的 K rebs- H ense le it缓冲液中 30 m in, 另 外 3条肌肉丝于含有 1% BSA和 510 mmo l/L g lucose的 K rebs - H ensele it缓冲液中孵育 30 m in后立即转入含胰岛素浓度 为 10- 7的 K rebs- H ense le it缓冲液中 ,孵育 30 m in。 3 细胞内外膜匀浆的分离 将孵 育 后 的 肌 肉 丝 浸 入 含 250 mmo l/L sucro se、 50 mm o l/L T r is、01 2 mm o l/L EDTA的 0 e 溶液中, 剪碎, 匀 浆, 在 4 e , 以 9 000 r /m in离心 10 m in。保留上清,取沉淀, 再匀浆、离心,反复 3次。全部上清在 4 e 以 190 000 @ g超 离心 1 h。取沉淀铺于 25%、30%、35% 的蔗糖梯度上, 4 e 以 150 000 @g超离心 16 h, 于 35% 蔗糖层上得到细胞内膜 悬浊液, 25%蔗糖层上得到细胞外膜悬浊液。 4 W estern blotting检测细胞内、外膜的 GLUT4蛋白水平 各取细胞内膜和外膜 50Lg, 用 10% SDS - PAGE电泳, 电转移法将蛋白转至硝酸纤维素膜上,封闭后加入 GLUT4多 克隆抗体孵育过夜。洗膜液洗涤 3次后, 加入 HRP标记的Ⅱ 抗, 室温反应 2 h, 再洗涤 3次后用增强化学发光法显像曝 光。激光密度扫描仪测定相对吸光度值。 5 统计学处理 数据以均数 ?标准差 ( x¸ ? s )表示, 组间差异采用 t检验 及 µ2检验。 结 果 1 动物模型的复制与检测 16周后 2型糖尿病组空腹血糖 ( FBG )、基础胰岛素 ( F ins)、总胆固醇 ( CHOL )、甘油三脂胆固醇 ( TG )明显高于对 照组 (P < 01 05及 P < 0101) , ISI明显低于对照组 (P < 0105 ), 体重 ( BW )和高密度脂蛋白胆固醇 (HDL )与对照组比较无明 显差异, 见表 1。 #818# 中国病理生理杂志 Ch inese Journa l o f Pathophysio logy 2007, 23( 4): 818- 819 表 1 两组小鼠模型的体重、空腹血糖、基础胰岛素、胰岛素敏感指数及血脂比较 Tab 1 Comparison of body w e ight, fasting b lood g lucose, fasting insu lin, insulin - sensitiv ity index and blood lipid between two groups ( x¸ ? s. n= 12) G roup BW ( g) FBG ( mmo l/L) F ins(mU /L ) ISI CHOL ( mm o l/L ) HDL ( mm o l/L ) TG ( mm o l/L ) Control 20. 2 ? 1. 1 5. 1 ? 1. 8 10. 8 ? 4. 0 - 4. 01 2. 04 ? 0. 15 0. 97 ? 0. 08 0. 57 ? 0. 07 Type 2 DM 20. 5 ? 1. 3 7. 3 ? 2. 7* 14. 3 ? 4. 9** - 4. 65* 2. 34 ? 0. 16** 0. 91 ? 0. 12 0. 69 ? 0. 21* * P < 01 05, * * P < 01 01 vs contro l g roup. 2 胰岛素刺激对对照组和 2型糖尿病组小鼠骨骼肌细胞内、 外膜 GLUT4蛋白表达的影响 基础状态下, 2型糖尿病组内外膜总 GLUT4量比对照组 稍低, 两组对比没有显著差异 (P > 01 05)。经胰岛素刺激后, 对照组外膜 GLUT4含量明显升高 (P < 0101), 增加至原来的 11 60倍,内膜 GLUT4下降到原来的 55% , 胰岛素刺激后, 2型 糖尿病组外膜 GLUT4含量增加到原来的 11 29倍 (P < 0105) , 内膜 GLUT4下降到了原来的 57%。2型糖尿病组从细胞内 膜向外膜转位的 GLUT4数量明显低于对照组从细胞内膜向 外膜转位的 GLUT4数量 (P < 0105) ,见图 1。 F ig 1 E ffect o f insu lin on GLUT4 transduction o f ske leta lm usc le ce lls in contro l and type 2 diabetes groups. D: d iabetes group; C: contro l group; I: intracellular m em branes; P: plasma m em branes. ( - ): w ithout insu lin stim ulating; ( + ) : w ith insulin stimu la ting. 图 1 胰岛素刺激对对照组和 2型糖尿病组骨骼肌细胞 GLUT4转位的影响 讨 论 骨骼肌是全身葡萄糖代谢的主要场所, 在基础状态和高 胰岛素刺激下分别占全身葡萄糖利用的 20% 和 70% - 85%。 在基础状态下, GLUT4多位于细胞内的细胞器上, 小泡中储存 90%以上 GLUT4,少部分位于细胞膜上。在胰岛素刺激或运动 刺激下,脂肪细胞和骨骼肌细胞中的 GLUT4会从细胞内转位 至细胞膜上, 以快速摄取细胞外的葡萄糖,保持血糖平衡。 既往研究表明: 2型糖尿病和肥胖的脂肪组织存在 GLUT4的合成减少伴葡萄糖摄取的下降 [ 1]。而本研究结果 显示, 非肥胖 2型糖尿病组与对照组内外膜总 GLUT4量相 近, 但 2型糖尿病组从细胞内膜向外膜转位的 GLUT4数量明 显低于对照组从细胞内膜向外膜转位的 GLUT4数量, 即 2型 糖尿病抑制了胰岛素刺激的细胞内膜 GLUT4向细胞外膜的 转位。提示在非肥胖 2型糖尿病鼠骨骼肌细胞, 是胰岛素刺 激的 GLUT4的转位下降,而不是 GLUT4数量的下降, 导致了 GLUT4的下降调节。结合以前关于不同胰岛素靶组织 GLUT4的 mRNA 表达及蛋白水平的研究 [ 3] , 我们认为: GLUT4存在着不同组织的特异性调节, 即在 2型糖尿病的脂 肪组织中 GLUT4总量的下降调节,而在骨骼肌中则不然。 本研究显示, 在基础状态下, 2型糖尿病组内膜 GLUT4 蛋白含量与对照组相近, 胰岛素作用后骨骼肌细胞内膜中 GLUT4减少量在 2型糖尿病组和对照组相近,分别为 57%和 55%。而外膜中增加数量只有对照组的 51% ,表明在 GLUT4 的转位过程中数量发生了减少, M a ier等 [4]发现, 3T3- L1脂 肪细胞在胰岛素长期作用下细胞内 GLUT4含量下降 40% , 且短期胰岛素促进的转位能力也下降,而细胞内 GLUT4减少 和转位缺陷都是因为 GLUT4的定位错误导致从细胞储存小 泡的选择性丢失。Dornbrow ski等 [ 5]研究也表明 GLUT4在从 内膜向外膜转位的过程中发生了丢失。可能原因是糖尿病 的影响使 GLUT4的分布主要从储存小泡转到高密度膜, 从而 导致胰岛素刺激的 GLUT4向细胞外膜的转位减少,这种亚细 胞分布异常是转位缺陷的原因之一。 研究表明, 胰岛素对 GLUT4转位的调节与多种因素有 关。它的调节受控于胰岛素信号转导系统, 许多影响胰岛素 信号的因素如胰岛素受体底物 1、磷脂酰肌醇 3激酶变化都 能改变胰岛素诱导的 GLUT4转位 [ 6]。高血糖、高胰岛素甚至 高血脂也引起 GLUT4转导障碍,近来有一种理论认为糖尿病 的 GLUT4的转运功能下降与骨骼肌肌动蛋白丝重组有关。 [参 考 文 献 ] [ 1] GarveyWT, M a ianu L, H uecksteadt TP, e t a.l P retrans- lationa l suppression o f a g lucose transpo rter prote in causes insu lin res istance in adipocytes from patient w ith non- in- sulin dependen t diabetes m e llitus and obesity [ J]. J C lin Invest, 1991, 87( 3) : 1072- 1081. [ 2] Dersen O, Bak JP, Andersen PH, et a .l Ev idence against alte red expression o f GLUT1 o rGLUT4 in skeleta lm usc le o f patientsw ith obesitye rN IDDM [ J]. D iabe tes, 1990, 39 ( 7): 865- 870. [ 3] Scha lin- Jantti C, Yk i- Jarv inen H, Ko rany i L, et a .l Effect of insu lin on GLUT4 mRNA and prote in concentra- tion in ske le tal m uscle of pa tients w ith N IDDM and the ir first- degree relatives[ J]. D iabetolog ia, 1994, 37 ( 4 ): 401- 407. [ 4] M aierVH, Gou ld GW. Long term insu lin trea tm ent o f 3T3 - L I ad ipocy tes results in m is- tsrge ting of GLUT4: im- p lication for insu lin stimu lated g lucose transport[ J]. D ia- beto logy, 2000, 43( 10) : 1273- 1281. [ 5] Dornbrow sk i L, Den is G, M a rette A. STZ - d iabetes is assoc ia ted w ith a m ajor depletion o f GLUT4 in transverso - tubu les and intrace llular membrane o f rat ske leta lm us- cle[ J]. D iabet M ed, 1997, 47 ( Supp lⅠ ) : 141A - 145A. [ 6] 王涤非, 邱忠霞, 张 锦,等. 北方汉族 2型糖尿病人 胰岛素受体底物 1基因多态性的研究 [ J] . 中国病理 生理杂志, 2005, 21( 4) : 793- 796. #819#