[doc] 基因沉默技术的研究动态及在畜牧业中的应用

[doc] 基因沉默技术的研究动态及在畜牧业中的应用 基因沉默技术的研究动态及在畜牧业中的 应用 【畜禽生产】 一 蔓糍黼8....?ls81;;08?※?罄誊?g HUBEIJOURNALOFANIMALANDVETERINARYSCIENCES 基因沉默技术的研究动态及在畜牧业中的应用 郑新民,刘中华,周木清.,肖红卫,李莉,乔宪凤,王亚刚,田永祥 (1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所,武汉430064;2.西北农林科技大学,陕西杨凌712100; 3.湖北省武汉市畜牧兽医科学研究所,武汉430086) 摘要:从RNA干扰现象的发现,筛选及基因沉默的发生开始,概述了细胞水平基因沉默的效应,并由细胞水平上过渡 到模型动物试验阶段,在此基础上,着手家畜基因沉默的研究,最后,涉及到基因沉默技术在畜牧业上的应用前景. 关键词:基因;沉默;RNA干扰;畜牧 中图分类号:Q75;Q342文献标识码:A文章编号:1007—273X(2008)06—0016—02 基因沉默是双链核糖核酸(RNA)介导的特异性转录后 的基因失活现象,其本质是RNA干扰(RNAinterference RNAi),它是当前生命科学中的热点领域.2001年和2002年 RNAi研究连续两年入选美国《科学》杂志评定的年度自然科 学十大突破.目前,RNA干扰技术已成为基因功能研究的有 力工具,并在人类疾病模型,基因治疗,新药研发以及畜牧遗 传育种等诸多领域展示了诱人的应用前景. RNAi技术在相对低等的真核生物中,比如锥虫,线虫 和果蝇等,应用最为广泛深入,尤其在线虫,已经实现了全基 因组水平的大规模,高通量的基因沉默研究,成为线虫遗传 学的基础研究工具和应用平台.比较而言,RNAi在哺乳动物 上的进展则曲折得多.早期研究发现,向哺乳动物体内导入 dsRNA,引发强烈的干扰素反应,导致体内信使RNA(mR— NA)的非特异性降解,全面抑制所有蛋白的合成.这从根本 上限制了RNAi在哺乳动物中的应用.幸运的是,新研究发 现导入的双链小RNA(dsRNA)小于30碱基(bp)时,既能特 异性沉默内源基因,又可逃避干扰素反应通路,而当引入 dsRNA长度为21bp时,基因沉默效应最为有效.这使得 RNAi的研究进入了哺乳动物时代 1细胞水平上的基因沉默 哺乳动物中最初的RNAi研究是在细胞水平进行的.即 针对靶基因,并体外合成21bp的双链小干扰RNA (siRNA),转染体外培养的细胞,然后观察细胞代谢及表型 的异常,从而确定靶基因的功能.此方法有两大弊端,一是 dsRNA的合成费用非常昂贵;二是由于哺乳动物缺乏siRNA 的内源扩增机制,因此基因沉默效应是暂时性的.一旦导入 的dsRNA耗尽,基因沉默效应也就随之消失2002年 BrummelKamp等模拟和借鉴RNAi的机制,发明了一种 siRNA表达载体I”.该发现一方面规避了昂贵的dsRNA合 成,使RNAi实验变得更加经济,实现了siRNA的持续表达. 极大的拓宽了RNAi的应用范围.同年,Hasuwa等以及 McCaffrey等应用siRNA干扰载体,成功获得了RNAi小鼠. 在动物个体水平上实现了基因沉默,证明了RNA干扰技术 用于转基因动物研究的可行性】.这,进展具有重大意义. 一 方面,它标志着一种新的转基因动物制备方法的诞生;另 一 方面,与传统基因敲除小鼠的制备相比.应用RNAi制备 转基因动物则无论经济还是技术上都有很大的优势.尤其 RNAi动物表现的基因沉默效应在表型上与相应基因敲除动 物具有一致性.最近,siRNA干扰载体的设计又有了新的进 展,Kasim等人将loxP序列插入siRNA载体的环状结构区 利用Cre—loxP重组系统实现了siRNA的诱导性表达[41,另外 的一些学者将能够被强力霉素或蜕皮素激活的特殊转录因 子与RNA聚合酶?启动子整和在一起,构建了可诱导的 siRNA表达载体,使人们能够按意愿控制siRNA的表达与 否,将基于载体的RNAi提高到了一个新的水平,也使得条 件型基因沉默小鼠的构建成为可Hu[5]. 2小动物上的基因沉默 基因沉默小鼠的成功制备,证明RNAi技术能够在动物 个体水平上实现基因沉默日.就研究基因功能而言.基因沉默 小鼠在很大程度上可以取代传统基因敲除技术,而就技术路 线和遗传效应而言,基因沉默小鼠还具有传统基因敲除所无 法具备的独特优势.第一,从技术角度考虑,制备基因敲除个 体涉及打靶载体构建,ES细胞培养,同源重组,生殖系嵌合 体制备等多项高难度的关键技术环节;而基因沉默小鼠利用 新兴的RNAi技术制造特定基因的失活,技术新,步骤少,实 验周期短,技术难度小,成本低.第二,从遗传学角度考虑.传 统基因敲除一般只能失活个体两个等位基因中的一个,相当 于隐性突变,往往需进一步繁育生成突变纯合鼠才能观察到 表型效应;而基因沉默通过靶mRNA的抑制和降解制造功 能缺失,相当于显性突变,因此可以省略传代纯合步骤,直接 在杂合子中观察靶基因功能缺失的表型效应,从而显着加快 实验进程.因此,基因沉默技术有望成为适应后基因组时代 需求的,新型的,经济快捷的哺乳动物个体水平基因功能研 究平台,基因沉默小鼠制备技术的研究和提高意义重大. 收稿日期:2008—04—18 基金项目:国家自然科学基金项目(30671495) 作者简介:郑新民(1960一),男,陕西华县人,研究员,硕士,主要从事动物生物技术研究工作,(~)027—87380647(电子信箱)anbit20@hotmailmm: 通信作者:田永祥,副研究员,(电话)O27—87380647(电子信箱)anbit20@163m. 2008年第6期 ; 6 l’ 《湖北畜牧兽医》月刊邮发代号38-352 HUBEIJ0URNALOFANIMALANDVETERINARYSCIENCES 基因沉默小鼠技术体系主要包括基因沉默载体的构建, 转基因动物制备及基因沉默效应的评估3个主要技术环节, 其中以siRNA干扰载体的设计和构建最为关键.目前应用 最广泛的干扰载体是基于茎环发夹结构的干扰载体,早期研 究认为茎部长度为21bp的发夹结构与细胞内源的siRNA 结构最为相近,基因沉默效应也最高,最近却有研究发现,茎 部长度为27bD或29bp时,引发的基因沉默效应可能显着增 加,甚至百倍于传统的21bp茎环结构.小鼠基因沉默技术 目前存在的主要问题有两个:第一,人们目前对21bp,27bp 及29bp发夹沉默效应相对优劣的理解都只是基于细胞水平 的研究,缺乏动物个体水平的验证;第二,人们对siRNA干 扰载体在基因沉默小鼠中的整合位点,拷贝数,以及在不同 组织中的表达情况和沉默效应,以及可能产生的副效应的认 识几乎空白.缺乏基础性的数据和资料.通过建立小鼠基因 沉默技术体系,为小鼠个体水平的RNAi研究提供基础性数 据和资料,为家畜个体水平的基因功能研究提供有力的技术 平台.也将为基因沉默技术在猪育种中的未来应用打下基 础.同时添补基因沉默数据和资料的空白. 3家畜上的基因沉默 基因沉默技术还可作为一项新技术应用于畜牧业的遗 传育种领域,尤其是猪的育种.第一,猪育种研究中,应用 RNA干扰的基因沉默技术可以促进生长,提高肉质.已有的 研究表明.猪的生长发育过程是一系列正调控基因和负调控 基因共同作用的结果,这一普遍规律同样适用于与育种密切 相关的重要经济性状.如生长速度受生长激素基因的正调节 和生长抑制素基因的负调节,肌肉的发育与组成受胰岛素样 生长因子正调节和肌细胞生长抑制素基因的负调节,脂肪组 织的发育亦然.因此,育种实践中可以根据育种的需要,利用 基因沉默技术,一方面抑制生长和肌肉的负调控,另一方面 加强脂肪组织发育的负调控,从而达到促进生长.提高瘦肉 率的目的.不仅如此,哺乳动物功能基因组的进展和中国一 丹麦家猪基因组计划的顺利实施,必将大大深化对家猪生长 机理的认识,并探明肌肉一脂肪组织调控的精细机制.这将 在不影响肌间脂肪组织发育的前提下,利用基因沉默技术特 异性抑制背部脂肪的沉积(背膘厚),从而达到提高肉质的目 的.第二,猪育种研究中,基于RNA干扰的基因沉默技术可 用于抗病育种,即针对危害大,传播力强的猪病毒性传染病, 如猪瘟,猪繁殖呼吸综合征等,利用基因沉默技术设计特异 性的沉默载体来抑制病毒关键蛋白的转录.干扰病毒的复制 和组装,从而达到抗病目的.第三,就育种的路线来说.基于 RNA干扰的基因沉默技术就有可能成为未来转基因猪育种 的关键过渡环节.在国家的重视下,我国的转基因猪研究已 经取得了突破性的进展,积累了雄厚的技术储备.我国早在 20世纪80年代末就建立了成熟的猪显微注射转基因技术. 最近又成功构建了体细胞克隆猪,从而能采用体细胞打靶一 核移植路线进行转基因育种.然而,目前的猪转基因育种仍 有两个难题,一是现有转基因技术的不完善,二是难于选择 合适的育种靶基因.家猪基因组计划的顺利实施.进一步深 化对家猪基因功能以及基因间相互作用的理解.并在不久的 将来提供大量候选基因作为转基因育种的靶基因,因此预计 靶基因选择的困难是暂时性的.目前最重要的是大力解决技 术上的困难,即转基因技术的不完善问题转基因技术的不 完善突出表现在两个方面:一是已有的转基因猪育种实践证 明.外源促生长基因的过表达往往会干扰猪正常的生长发育 过程,因此基于内源基因的调控要优于基于外源基因的调 控,小鼠基因沉默技术正好提供了内源基因调控的理想技术 平台.然而目前的小鼠基因沉默技术还主要依赖于原核注射 法,缺陷在于转基因的随机串联整合容易产生副效应,不利 于稳定育种.体细胞打靶一核移植路线,虽然解决了转基因 的定点和单拷贝整合问题,但体细胞打靶一克隆的难度和低 效性却是一个瓶颈.鉴于基因沉默的综合效应只能在动物水 平进行评价,因此,基因沉默育种的成功突破可能需要筛选 和尝试数个备选基因,这个过程不适合采用体细胞打靶一核 移植路线.理想的是在猪转基因育种研究中将RNA干 扰技术,原核注射法和体细胞打靶一核移植路线有机结合起 来,即首先利用原核注射路线制备基因沉默的转基因猪,进 行育种靶基因的初步筛选,对胜出的靶基因则采用体细胞打 靶一核移植路线作为最终育种路线. 4基因沉默(干扰)技术的应用前景 RNAi领域之所以具有如此强大的生命力,有两个关键: 一 是RNAi是真核生物普遍存在的保守的生命机制,执行多 种重要的生理功能;二是RNAi在基因功能,疾病模型,遗传 育种等多个领域有巨大的应用潜力.目前,哺乳动物RNAi 研究虽然取得了引人瞩目的成就.但作为一种全新的领域和 技术,预计还有巨大的上升空间.未来的哺乳动物RNAi研 究将呈现以下四方面的趋势:?在细胞水平,RNAi的基因功 能研究将和基因芯片技术有机结合,向大规模,高通量的基 因组水平发展.在这方面,国内外有关学者已经进行了大胆 的尝试f8].?在动物个体水平,以RNAi为基础的动物转基因 技术将得到快速发展.?在医学领域,RNAi介导的基因治疗 和新药研发将逐步从基础研究向临床应用转移.?在畜牧领 域,以RNAi为基础的基因沉默技术作为一种家畜育种手段 将发挥很大的作用.作为家畜的模式动物——小鼠的基因沉 默是所有工作的前期探索,国家自然科学基金资助项目”应 用RNA干扰技术制备EGFP基因沉默小鼠的研究”正是以 绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,以建立,提高以及完善动 物个体基因沉默技术为目标,重点是对不同沉默载体在动物 个体水平的表现进行系统的评估和优化.为家畜的基因沉默 奠定坚实的基础,以促进家畜沉默技术的尽快发展.推广应 用于畜牧业现代化生产中. 参考文献: [1]BRUMMELKAMPTR,BERNARDSR,AGAMIR.ASystem forSt~leExpressionofShortInterferingRNAsinMammalian Cells[J].Science,2002,296:550—552. [2]HASUWAH,KASEDAK,EINARSDOTFIRT,eta1.Small InterferingRNAandGeneSileninginTransgenicMiceand Rats[J].FEBSLetters,2002,532:227—230. [3]MCCAFFREYAP,MEUSEL,PHAMTT,RNAInterference inAdultMice[J].Nature(London),2002,418:38—39. [4]KASIMV,MIYAGISHIM,TAIRAK.ControlofsiRNAEx— pressionUsingtheCre-loxPRecombinationSystem[J1.Nu— cleicAcidsResearch,2004,32:66. [5]GUPTAS,SCHOERRA,EGANJE,eta1.Inducible,Re— versible,andStableRNAInterferenceinMammalianCeils[J]. Proc.Nat1.Acad.Sci.U.S.A,2004,101:1927—32. 2008年第6期 【奶业科技】 .蕊?i辨?潍#iiililil鼗;蓊l;#瓣?黼瓣S HUBEIJOURNALOFANIMALANDVETERINARYSCIENCES 犊牛腹泻的病因分析与对策 武华玉.梅书棋,黄京书,冯政 (湖北省农业科学院畜牧兽医研究所,武汉430064) 中图分类号:$858.236.4文献标识码:A文章编号:1007—273X(2008)06—0018一O1 腹泻是犊牛死亡的最常见病因,良好的饲养管理可以有 效的防止犊牛腹泻的发生.腹泻一般分为营养性腹泻和传染 性腹泻两种,而营养不平衡使犊牛更容易患传染性疾病. 1临床症状 腹泻是指粪便中含有过量的水分(比正常犊牛高5,1O 倍),粪便为黄色或白色,还可能带有黏膜和血液,随着病情 的发展会出现厌食,食欲差,粪便稀薄,呈水样,脱水(眼睛塌 陷,毛发粗糙,皮肤无弹性),怕冷,起立迟缓,瘫痪等症状[1】. 2病因分析 初乳质量差,饲喂过迟或饲喂量过少都会造成犊牛的免 疫力低下;犊牛栏卫生条件差,通风不良,空 气污浊造成环境中致病微生物过量;应激, 难产,长途运输等因素_2I3】. 3早期诊断 犊牛的食欲一般比较旺盛,若饲养员在 饲喂时发现犊牛食欲减退,鼻镜干燥,鼻孔 流浓涕,体温升高等症状,可以采取预防措 施,有助于犊牛迅速恢复. 4疾病预防 小肠中停留较长时间以便被充分吸收,配置盐溶液加热至温 热后喂给小牛,电解质溶液中的糖分可有可无,糖有助于电 解质的吸收但加剧小肠内发酵:此外,糖被吸收后还能为小 牛提供能量,口服液是一种电解质,糖,盐,矿物质,凝胶(果 胶,树胶)的混合物,口服液中的果胶和树胶有助于牛奶缓慢 通过小肠,促进消化吸收,果胶和树胶还可以在炎症和损伤 的小肠细胞上形成保护膜,对小肠起到保护作用嘲. 一 旦诊断出腹泻,必须将犊牛圈在温暖和干燥的地方, 少量多次按稍低于正常饲喂量给犊牛喂牛奶,使犊牛处于饥 饿状态愿意接受口服液,并补给口服液.口服液的酸碱度影 对刚出生的犊牛,可以尽早投服预防剂量的抗生素药 物,对于防治该病的发生具有一定的效果;加强妊娠母牛和 犊牛的饲养管理,对妊娠后期母牛要供应充足的蛋白质和维 生素饲料,注意牛舍干燥和清洁卫生;母牛临产时用温肥皂 水洗去乳房周围污物,再用淡盐水洗净擦干,坚持对牛舍,牛 栏,牛床,运动场和环境用5%福尔马林彻底消毒,做好通风 与保温工作,改善畜舍环境,防止犊牛受潮和寒风侵袭.不饮 脏水,以减少病原菌的入侵机会;对新生犊牛应及时饲喂初 乳,增强犊体抗病能力.一旦犊牛发病应加强护理,立即隔 离治疗. 5腹泻治疗 5.1口服补液 口H~-}b液是一种主要的治疗方法,其原理是使盐和水在 响1:3服液的效果,碱性1:3服液可干扰牛奶在 真胃中的正常消化.所以应在饲喂后34h 补给,酸性口服液有助于蛋白质的消化,在 饲喂后15,20min就可补给. 5.2抗菌素治疗及静脉补液 最好通过药敏试验,选出敏感药物后. 再行给药,临床上常选用下列药物治疗该 病:?寄生虫性腹泻犊牛可用左旋咪唑,丙 硫苯咪唑或阿维菌素片按5-8mg/kg体重内服.每日两次.连 服3d.?口服痢特灵,按3mg/kg体重,每日3次,连服3d.? 肌肉注射氯霉素,按0.01-0.03g/kg体重,每天注射3次,连 注3d.?口服5~10g次酸铋或50,100g陶土或10,20g活性 炭. 参考文献: [1]蒙旭辉.犊牛腹泻防治初探[J].新疆农垦科技,2006(5):40. [2]兰世杰,陈志明,崔忠久.新生犊牛腹泻病及其防治叽.畜牧兽医 科技信息,2007(8):5O. [3]蔡世垄,张瑛.犊牛腹泻的原因与防治[J].黄牛杂志,20o4(2): 75. [4]陈真强.犊牛腹泻的病因及防治措施探讨叭.现代畜牧兽医, 2005(1):8 [5]李秉鸿.两种电解液治疗小牛的腹泻脱水叫.畜牧兽医科技信 息,2002,4(2):31. 收稿日期:2008—04—11 作者简介:L~(1980一),男,山东临沂人,助理研究员,主要从事家畜抗 病育种工作,(电话)027—87987618(电子信箱)huayl..d@163.c0m. [6]KIMDH,BEHLKEMA,ROSESD,eta1.SyntheticdsRNA DicerSubstratesEnhanceRNAiPotencyandEfficacy~J].Nat. Biotechno1.,2005,23:222—226.7. [7]SIOLASD,LERNERC,BURCHARDJ,eta1.SyntheticshRNA asPotentRNAiTriggers[J1.Nat.Biotechno1.,2005,23:227— 2008年第6期 231. [8]CHENM,ZHANGL,ZHANGH,eta1.AUniversalPlasmid LibraryEncodingAllPermutationsofSmallInterferingRNA [J].PNAS,2005,102:2356—2361. 奶业科技