凝结芽孢杆菌芽孢形成液体培养基的研究
杭州食品科技 2003年第 4期 总第 71期 · 5 ·
摘要:本文对一株具有疗效作用的同型乳酸发酵菌——凝结芽孢杆菌 TO.33的产芽孢培养基
进行了研究。该菌徕在普通液体培养基中通常不形成芽孢。而在所设计的一种含Mnz (50ppm)
的液体培养基中,可产生 7.5×10 C兀J/rnl以上的芽孢(活菌计数),占总菌效的 52--58%。
关键词 :凝结芽孢杆菌 芽孢形成
引 言
本院微生物教研室采用Kitahara& Suzuki培养基⋯1。从脱脂奶粉中分离到一株同型乳酸
发酵的凝结芽孢杆菌 T...
杭州食品科技 2003年第 4期 总第 71期 · 5 ·
摘要:本文对一株具有疗效作用的同型乳酸发酵菌——凝结芽孢杆菌 TO.33的产芽孢培养基
进行了研究。该菌徕在普通液体培养基中通常不形成芽孢。而在所设计的一种含Mnz (50ppm)
的液体培养基中,可产生 7.5×10 C兀J/rnl以上的芽孢(活菌计数),占总菌效的 52--58%。
关键词 :凝结芽孢杆菌 芽孢形成
引 言
本院微生物教研室采用Kitahara& Suzuki培养基⋯1。从脱脂奶粉中分离到一株同型乳酸
发酵的凝结芽孢杆菌 TQ33。将该菌的芽孢作为活性因子,经小范围人体服用试验表明,它对
常见的肠道疾病如:慢性结肠炎、腹泻及便秘等均有明显的疗效。与普通乳酸菌相比,TQ33
的优势在于能形成耐热性和耐酸性较强的芽孢,因而适于向需经加热的食品中添加,并且。其
芽孢作为活性因子耐受胃酸顺利到达肠道并定植存活的能力也较强。
虽然 TQ33在多种固体培养基上形成芽孢良好,但在普通液体培养基中却不能形成芽孢。
由于固体培养的局限性必将妨碍其扩大生产及其实际应用,因此,寻找适于TQ33的液体培养
产芽孢条件。对奠定该菌制剂的工业化生产具有一定现实意义。
材料与方法
1.菌种
凝结芽孢杆菌TQ33(Bacillus Coagulans TQ33),本院微生物教研室选育。
2.培养基
TQ33芽孢形成液体培养基:酵母膏 1.O%,蛋白胨 1.O%,MnSO4 50ppm,K2HPO4 0.2%.
葡萄糖 0.6%,MgSo4·7I-t,_0 0.1%,pH7.0
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· 6 · 杭州食品科技 2003年第 4期 总第 71期
麸皮琼脂培养基:蛋白胨 2g,酵母膏 0.3g,葡萄糖 0.2g,琼脂 2g,麸皮水 100ml,pH7.0—
7.2。(麸皮水:5g麸皮加水 100ral,小火煮沸 1小时,纱布过滤。)
麸皮液体培养基:除不加琼脂外,成分同麸皮琼脂培养基。
淡薄培养基[2l,玉米粉——酵母膏培养基[2l,TAM培养基[3l,加淀粉的TAM 培养基[3l,
芽孢形成培养基[ ,补充锰的营养琼脂培养基[6]6,普通营养琼脂培养基,Nakayama培养基[6]6。
3.方法
(1)培养条件
固体培养基上芽孢形成的培养:取一环斜面活化菌种接入5ml麸皮液体培养基中,40℃静
置培养24小时,取0.5ml培养液涂布于待测芽孢形成固体培养基平板上,40℃培养。
液体培养基中芽孢形成的培养:取一环斜面活化菌种接入 TQ33芽孢形成液体培养基中
(250rrd三角瓶装 15—50rrd培养基),40—50℃振荡培养(140rpm)或静置培养。
(2)总菌数及耐热芽孢数的测定
采用淡薄培养基,40℃培养48小时,计平板菌落数从而算得培养液的总菌数。芽孢数的
测定,是将培养液经 80℃加热处理 10分钟,然后以同样的方法进行平板活菌计数。
结果与讨论
(一)固体培养基上芽孢形成的观察
对多种固体培养基进行了实验,结果见表 1。
表 1 TQ33在不同固体培养基上芽孢形成情况
注:一表示无芽孢;+表示有个别芽孢 ;++表示有少量芽孢 (<10%);+++表示有大量芽孢 ;/未观察
由表 1可以看到,对TQ33芽孢形成有利的固体培养基有:淡薄培养基、TAM培养基、加
淀粉的TAM培养基、补充锰的营养琼脂培养基,其次为麸皮琼脂培养基及玉米粉酵母膏培养
基,而TQ33在芽孢形成培养基上不形成芽孢。
(二)产芽孢液体培养基的设计
1.液体培养基中芽孢形成的观察
采用与上述产芽孢较好的固体培养基相同配方(除不添加琼脂外)的液体培养基以及
Nakayama培养基进行产芽孢实验。发现 TQ33在 TAM液体培养基,经振荡培养能产生大量
芽孢,耐热芽孢占总菌数的41%。而在其它几种液体培养基中,无论是静止培养还是振荡培
养,都未观察到有芽孢形成。
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2.芽孢形成液体培养基的初步设计
采用TAM液体培养基,经振荡培养,可形成一定量的芽孢,但再现性差。调整TAM培养
基组分,特别是采用不同氮源代替 TAM培养基中的麻蛋白胨,经大量试验发现,用蛋白胨代
替豚蛋白胨,用蛋白胨代替麻蛋白胨能获得一定数量的芽孢,并且重复性较好。初步设计的
TQ33芽孢形成液体培养基配方为:蛋白胨 0.5%,酵母膏 0.5%,葡萄糖 0.3%,K2.HPO 0,
1% ,MnSO450ppm,MgSO4。7I-tl00.05%。
3.芽孢形成液体培养基各组分对芽孢形成的影响
为确定液体培养基各组分对芽孢形成的影响,选用正交表 L】8(3 ),进行六因素三水平正
交试验。4O℃振荡培养 72小时,测定总菌数及耐热芽孢数,计算耐热芽孢数占总菌数的百分
比。实验设计及结果分析见表2、表 3及表 4。
表 2 因素与水平表
表 3 Ll8(3 )正交试验设计及试验结果表
耐热芽孢数/ 试验号
A B C D E F 空白) 总菌数(
%)
l 0 0.5 0.6 0 0 0.05 0
2 0 0 0.3 0.1 50 0 0
3 0 1.0 0 0.2 l00 0.1 1.22
4 0.5 0.5 0.6 0.1 50 0.1 2.92
5 0.5 0 0.3 0.2 100 0.05 0
6 0.5 1.0 0 0 0 0 0
7 l_0 0.5 0.3 0 100 0 O
8 1.0 0 0 0.1 0 0.1 0
9 1.0 1.0 0.6 0.2 50 0.05 37.7
l0 0 0.5 0 0.2 50 0 7.75
ll 0 0 0.6 0 l00 0.1 0
l2 0 1.0 0.3 0.1 0 0.05 0.3
l3 0.5 0.5 0.3 0.2 0 0.1 l0.32
l4 0.5 0 0 0 50 0.05 0
l5 0.5 1.0 0.6 0.1 l00 0 l0.0
l6 1.0 0.5 0 0.1 l00 0.05 0
l7 1.0 0 0.6 0.2 0 0 0
18 1.O 1.0 0.3 0 50 1.0 21.13
I i 9.27 20.99 50.62 21.13 l0.62 38
Ⅱ; 23.24 O 31.75 l3.22 69.5 l7.75 ∑yi=91
. 34
Ⅲ; 58.83 70.35 8.99 56.99 l1.22 35.59
Q 681.17 898.28 6o8.48 644.85 844.82 5o4.29 P=463.5
S 217.67 434.78 144.98 181.35 381.32 4079
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· 8 · 杭州食品科技 2oo3年第4期 总第 71期
表4 Ll8(3’)方差分析结果
方差来源 平方和 自由度 均方 F 显著性
A 217.67 2 108.84 1.85 △
B 434.78 2 217.39 3.7O (*)
E 381.32 2 190.66 3.24 (*)
C 144.98 2、
I
D 181.35 2 l 58.83
F 40.79 2}¨
误差 280.05 5
总和 1680.94 17
注:(*)表示影响较显著 ;△表示有一定影响
由方差分析结果可知,酵母膏(B)、MnSO4(E)对芽孢形成有较显著的影响,蛋白胨 (A)有
一 定影响。在实验范围内BEA的最优水平组合为 B3E2A2,即:酵母膏 1.0%,MnSO450ppm,
蛋白胨 1.0%。根据方差分析结果,葡萄糖、K2吼 、MgSO4·7H20对芽孢形成的影响很小,
原则上可任意取值。但试验发现,缺乏碳源(葡萄糖)时,细胞增殖缓慢且总菌数低,因而芽孢
总数也不可能达到较高的数量。考虑到这一原因,按表 3中三个水平的最大值取葡萄糖 0.
6%。对 K2HPO4及 MgSO4·7H20也取三个水平中的最大值。因此,芽孢形成液体培养基的
最佳配方为:酵母膏 1.0%,MnSO450ppm,蛋 白胨 1.0%,葡萄糖 0.6%,K2HPO40.2%,Mg—
SO40.1%。
关于 Mn2+能否促进芽孢形成的报道并不一致。Rowe等(1975)[’]认为,Mn2 并非 B.
Stearothermophilus形成芽孢所必需的微量元素;而 Anderson等 (1972) J及 Cheung等
(1982)[9]的研究结论正好相反。本实验结果表明,Mn2 有促进 TQ33菌株形成芽孢的作用,
这与Yokata等(1981)t~o3的报道相一致。他们认为 Mn2 能促进 Bacillus野生株及突变株开始
形成芽孢并合成D一葡萄糖脱氢酶(GLD,D—glucose dehydrogenase)。GLD是一种只与芽孢
形成有关的酶,存在于前孢子中,目前尚未在母细胞中发现。.该酶的合成被认为是芽孢形成过
程中一系列生化反应的特征标志之一。
(三)温度和通风量对芽孢形成的影响
在4O℃、45'E、50℃三个温度下,以250ml三角瓶分装 15、25、35、45ml培养基,对 TQ33
的芽孢形成情况进行试验。以转速 140rpm振荡培养 72小时,测定结果见表 5、6、7。
表 5 40℃时不同通风量对芽孢形成率的影响
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表6 45"C时不同通风量对芽孢形成率的影响
装液量(rra) 总菌数(C J/rn1) 芽孢数(CFu/rn1) 芽孢数/总菌数(%)
由表 5、6、7可知,温度对
TQ33的芽孢形成有显著影响。
在 40~50℃范 围内,TQ33的芽
孢形成率随温度升高而递增。在
4o、45℃条件下,菌体主要以营养
体形式存在,芽孢形成率较低;而
在 50℃条件下,芽孢形成率可达
到 57.7%。另外,从表中数据可
知,通风量对 TQ33的芽孢形成
率也有影响,,I、Q33的芽孢形成率
随通风量的减小而递增。在 50℃
条件下,当装液量由 35 变为
45 时,芽孢形成率由 33.1%突
增到 57.7%。由实验结果说明,
在较高温度和通气不良的条件
下,芽孢菌属的细菌以形成芽孢
的形式抵抗不良环境而生存。为
此,选择培养温度 50℃,三角瓶装
液量 45 ,为 TQ33菌株产芽孢
的最适条件。
(四)TQ33在芽孢形成培养
基中的生长及 芽孢形成曲线
, ,
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· 1O · 杭州食品科技 2003年第4期 总第7l期
在TQ33形成芽孢的最适条件下,以时间为横坐标,总菌数、耐热芽孢数、pH值为纵坐标
,
得到图1。从图1中曲线可知,耐热芽孢的数量在菌体生长的对数后期迅速增加
, 当进入稳定
期时仍缓慢增长,在培养60小时时,达到最大值(8.0×10 CFU/m1)
, 占总菌数的 52.1%,而
后基本保持不变。pH在菌体生长的开始阶段,变化较小,但在 12至 24小时之间
,pH迅速上
升至 7.4,至 72小时时,pH达 7.5。
结论
凝结芽孢杆菌TQ33在本文所设计的芽孢形成液体培养基中,于 50"C振荡培养
, 耐热芽孢数
可达8.O×10 CFU/ral,约占总菌数的 52%。Mn2 对 TQ33芽孢形成有明显促进作用
,不含
Mn2 的液体培养基中未观察到芽孢形成。
参考文献(略)
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