杭变链球菌鸡卵黄免疫球蛋白（lgY）的制备及活性检测

Food Science&Technology食品科技 黄 靖 南昌大学中德联合研究院 邮编：330047 罗 健 南昌天惠肉食品有限责任公司 邮编：330001 摘 要 以远缘链球菌 (S．sorbrinus 6715血清型 g)免疫产卵母鸡，应用酶联免疫吸附测定法 (ELISA)测定鸡卵黄中免疫球蛋白(Immunoglobulin ofYolk，IgY)的活性，研究鸡免疫应答并制备 出高免抗 一S．sorbrinus IgY。结果显示以 10’cfu／只剂量免疫的母鸡，第一次免疫后的第七天卵黄 中出现特异性 lgV，加强免设后抗体效价上升更快，经 ELISA法检测，卵黄中的抗体效价到 1： 384。而冷冻干燥后的 IgV，其效价要超过 1：2000。 关键词 变链球茵 鸡卵黄免疫球蛋白 ELISA 免疫球蛋白(Immunoglobulin，Xg)是一类具有增强机体抗菌、免疫功能的活性蛋白质，是维持人类特别 是婴幼儿健康所必需的生理活性物质。鸡蛋中富含免疫球蛋白IgY，是由鸡血清中的IgG转移到卵黄中形 成 的“ 。 远缘链球菌为变异链球菌菌族中感染人龋齿的主要致病菌，其胞壁多糖和菌体面蛋白是主要的保 护性抗原他 。我们采用灭活的菌体和表面蛋白GTF等作为抗原免疫产卵母鸡，得到抗一S．$obl~nu$IgY，可 做为防龋的免疫制剂。 1．疫苗制备及母鸡的免疫 1．1菌体培养 菌种：远缘链球菌(Streptococs sobrius 67 1 5血清型 g) 培养基 ： 一 成分 含量 克数(g) 先溶于3800ml水，用 NaOH调pH至7．1—7．5，过滤，用 250ml三角瓶进行分装，每瓶200ml左右，灭 菌(1 21℃．15min)，接种后置人培养箱进行扩培。培养条件：37℃，95％N：，5％O：。48小时。 1．2疫苗制备 冷冻离心 (9000rpm，30min)分离菌体和上清，菌体超声波灭活，上清超滤浓缩后再进行冷冻干燥，再 将灭活后的菌体与冻干的上清混合制成抗原。镜检计数，菌体浓度为 16×109cuf／ml。 以 L疫苗稀释至抗原浓度为 109cfu／ml，使用前采高速转头进行乳化 ，以便抗原完全均匀分散于混合 液中 江西食品工业 ·2002·1 7 7。 维普资讯 http://www.cqvip.com 墨 技Food Science&Technology 1．3鸡的免疫 用7号针头，皮下多点注射产卵母鸡，注射量为 lml／只，注射部位为胸腹部。两星期后再分别免疫一 次，共免疫三次。 一 ．． I ． - ． 。 1．4抗体效体的 ELISA检测 从第七天开始，取圆鸡 鹭 的_卵冀； 1 H乏仞j 八蒸馏水 ，混匀， 用 HCI调pH值至 5．2，4℃过夜，9，000rpm冷冻离心，取上清《 。 再按 ELISA法测定抗体效价。 。 2．ELISA法测定抗体效价 、 2．1试剂 1)包被液(0．05tool／L pH9．6碳酸盐缓冲液) 0．1M NaC03 3．9ml 0．1M NaHC03 6．1ml H2o 10．0ml 将以上液体混合即为包被液 2)封阻液 脱脂奶粉 3％，用 PBS稀释 3)洗涤及稀释液 PBST和 PBS NaH2PO4H20 1．47g Na~HP0412H20 ． 12．1g NaCI 8．5g Tween一20 0．5ml 加水配成 1000ml 4)底物 Buffer Na2HPO4 0．2M 25．7ml Citric Acid 0．1M 24．3ml H20 50．0ml 5)底物溶度 。‘ OPD 9rag／15ml H202(30％浓度) 22．5／15mi 用底物 Buffer配制 6)终止液 H2SO． 2M 7)抗原 自制的远缘链球菌抗原 8)第二抗体 免抗鸡 Ig Sigma公司 2．2操作步骤 1)包被 抗原用包被液稀释至 5 X 10’cuf／ml，每孔加 100txl，4~C，静置 12小时 2)PBSF洗板三次 3)封阻 每孔加 3％脱脂乳 ，加满各孔，37℃，温育 40min 4)~11抗体 抗体用 PBS稀释，每孔 100~1，梯度稀释，37~C，温育 50分钟 5)洗板 3次 6)加酶标抗体 PBS稀释，每孔 lOOul，37~C，温育 50分钟 7)洗板 5次 8)／~n底物 每孔 lOOul，37~C，酶和底物反应 l5分钟 9)终止反应 加 2M H!SO ，5oUl，l5分钟后测定 0．D值 72 江西食品工业 ·2002·1 维普资讯 http://www.cqvip.com Food Science&Technolo~ 食品科技 10)酶标仪测 OD值(492nm) 2．3数据处理 抗体水平采用吸光值法表示，当吸光值大于 0．2时的最大稀释度作为抗体的效价，即滴度b)。 3．结果与讨论 3．1疫苗制备及母鸡的免疫 远缘链球菌属厌氧菌，在元氧条件下生长良好 ，细菌培养 24小时后可见培养基混浊。在液体培养基 中含有大量的葡糖基转移酶 GTF，将上清浓缩后冻干，再与灭活的菌体混合即得所需的抗原。 将制备好的抗原与等体积的完全福氏佐剂混合，可增强抗原的免疫原性 ，这是因为羊毛脂可延长抗 原在母鸡体内的存留时间，延长了抗原对母鸡机体免疫系统的刺激，因而提高了机体的抗体水平。 ELISA法测定了所产鸡蛋中卵黄 IgY的活性。当 IgY稀释液的稀释度为卵黄中的 l／48时，以0．D 值表示 IgY活性的相对大小，以免疫天数表示横坐标，所得免疫应答曲线如下图示： 0．D值 0．6 0．5 0．t 0．3 0．2 0．1 0 7 11 15 18 22 25 29 34 38 41 图’1 免疫应答曲线 (天 ) 第二次和第三次免疫后，活性略有下降，但随即迅速上升，到4l天时即达到最大。按 O．D值大于 0、2的稀释度作为抗体效价。根据实验结果，三次免疫后，鸡卵黄中抗体效价为 l：384。我们对水稀法提 取的 IgY粗提物再进行冷冻干燥除去水分 ，冻干品用 ELISA方法进行了检测 ，冻干品的效价大于 l： 2000。冻干品的效价要远大于卵黄中抗体效价，因此将 IgY冻干，可获得高效价的IgY，同时也有利于长 期保存。 ’ 3．2 E LlSA法检测抗体效价 检测抗体效价的 ELISA方法的建立，在特定的反应体系下，必须确定抗原包被浓度和封阻剂浓度， 而显色时间对反应的灵敏度有很大影响。 3．2．1抗原包被浓度的确定 o．D值 5x 100 10‘ 5 X lo7 lo7 l 图 2 抗原包被浓度的确定 105 ． 江西食品工业 ·2002·1 1,3 2 3 8 6 4 2 2 3 2 2 2 2 维普资讯 http://www.cqvip.com 食品科技 Food Science&Technology ，10 ，5XlO ，10 ，10 ，10 cfu／ml抗 原包 被 ，EL1SA O．D，37"U显 色 I~,-j'lnJ为 15分 钾 。 实验结果如上图： 结论：抗原浓度大于 5 107cfu／ml时，O．D较高且较为平稳。可取得较好的灵敏度，为节省抗原，采用 5 107cm／ml浓度作为包被抗原。 3．2．2封阻浓度的确定 分别用 l％，3％，9％脱脂乳封阻，37C显色时间为 lO分钟，结果如下： oD值 (脱脂乳浓度) 图 3 封阻浓度确定 结论：当封阻剂浓度为 3％时 OD值较高，故采用 3％的封阻浓度，强取得较好的灵敏度。 所采用的ELISA对每一样品均采用双孔测定。取算术平均做为测定的数据。根据以上实验，我们采 用 5 107cm／ml的抗原浓度作为包被浓度，3％的脱脂奶粉作为封阻剂浓度，显色时间为 37C，15分钟。 利用保护性抗原免疫产卵母鸡，可从其产卵中分离到特异性 IGY。本研究用 S．sobrinus皮下多点注 射产卵健康母鸡，首次免疫一周后即检出抗体，一个月后效价上升到最高。从鸡卵黄中可提取出大量的 特异性抗体。鸡的大规模工业化饲养早已实现，只需对母鸡进行免疫即可生产出大量的高免 IGY。因此开 发、利用 LGY这一生物资源具有重要的意义。 参考文献 (1)杨严俊，周建新，蛋黄免疫球蛋白的功能性研究与开发，无锡轻工大学报，1998年 5 月。(2)刘天桂，岳松龄，口腔疾病的微生物学基础，人民卫生出版社，1999。(3)杨利国，胡少昶等，酶免疫 测定技术，南京大学出版社 ，1998。(4)钟青萍，许杨等，抗幽门螺杆菌鸡卵黄免疫球蛋白的制备及活性检 测，《第三届国际天然药与微生态学术研讨会论》，2000 ’ (上接 3O页) V‘q·8 (1) 综合上述各因素可得：Q OCAT· K、K。因此，通过在每一个风机盘管处采样温度， 其中风速 V与温差AT成正比，风速越大，温差 越大，即 ATocV。可表示成： AT=∈‘V (2) 专：系数；流过盘管的冷水流量 q=U ‘t (3) U：为冷水在管内的流速 ， t：为风机盘管开 启的时间； 综合式(1)(2)(3)可得：Q ∈·V ·U·t·8(4) 由于在冷源系统设有进 、出水管道压差检测，并 据此来调节旁通阀，保证冷冻水进 出水管的管道压 差恒定 ，则冷冻水的流速基本稳定。因此，风机盘管 处的热交换量与风机盘管处风机的转速及风机盘管 的开通时间有关。 风机的转速 由温度控制器的开关档位进行控 制，分高 中、低三档。可以根据风机及盘管的特点 ， 对三个档位的风速综合成三个相应的使用系统 Kl、 74 江西食品工业 ·2002·1 控制高、中、低三个档低的状态和风机和盘管的开 通时间四个量，可获得每个用户冷量的计量。 3．结论： 基于上述原理，对各用户冷量的计量采用先 按分区计量冷冻水的用量，获得小范围内的冷量 使用费。然后将此费用按计量区域内的各内风盘 管风速的高低及相应的开通时间来进行分摊。计 算出每个具体的分用户的冷气使用费用。从而实 现企业中央空调冷气使用费分户计费目的。通过 冷气计费的方法，做到计量合理、准确，充分体现 “多用多收，少用少收”的管理原则，解决了冷气使 用费准确计算： 参考文献：1．徐梅芳，中央空调计费方法及其 选择实例，建筑热能通风空调，2000，I9(3)．一 59—60 2．陈炎，梁锡鸿，计算冷量的空调汁费系统， 制冷，l999，18(31，一74—76 9 8 7 6 S t O O O O O O 维普资讯 http://www.cqvip.com