利用牛乳生产活性肽CPP

惶品|素 每冰淇淋、乳品工业特辑，礼品I业 删网半乳生产活性赋 湖北工学院生物工程系 吴思方 武汉医药保健品有限心司 杨金树 华末理工戈学生物工程学院 汤亚杰 摘 要 本文研究了从牛乳中提取酪蛋白，用胰蛋白 酶水解牛乳酪蛋白的最佳I艺条件厦从水解液中提 取、精制CPP的I艺流程和I艺条件。 关键词 牛乳 CPP 提取 Abstract rhe casein extracted from milk the optimum condltioTm for hydmlyzing casein by uslng trypsin and the process for extraction、Puvification from hydmlysate to pro- du。e CPP wele studied． Keywords milk CPP extraction 活性肽——酪蛋白磷酸肽 fCasein Phospopepfides。 以下称 CPP)是现代科学研究中新发现的促钙 、铁吸收 物质 。】，比传统方法能明显提高补钙、补铁效果 酶具有高度专一性。含有赖氨酸或精氨酸羧基的 酰胺 、酯和肽都能被胰蛋白酶迅速地水解⋯ 本文利用胰蛋自酶 ，对牛乳中提取的酪蛋白进行 水解 ，生成活性肽 CPP，经提取、精制获得粉状产品： I． 材料与方法 1 1 材 料 胰蛋白酶(1 250)．鲜牛乳 其他试剂均为分析纯。 1 2 主要仪器设备 HHS一2型电热恒温水浴锅，ZD一2电位滴定计， HYA一Ⅱ恒温摇床 ，7520型紫外可见分光光度计 ． M 一6A高效液相色谱仪。 1．3 方 法 1．3 I 牛乳酪蛋白提取方法 离 分离 r稀奶油 牛 扎 — — 一 f “L脱脂乳～加热到4o℃ ， 在搅拌下 慢慢加入预热到 4O℃ pH4 7的醋酸 (IL4C)缓冲液，调 pH至4 7，将上述悬浮液冷却王室温，然后放置5mitt， 用细布过滤 ，收集的沉淀、干燥，即为酪蛋白。 1．3 2 酪蛋白的酶促水解方法 取～定浓度、一定 pH值的酪蛋 白溶液于大试管 中，按试验设计于水浴中恒温，然后加人一定的胰 蛋白酶溶液混匀并开始计时，每 5min摇晃一次，在水 解过程中应当监控 pH值的变化 用 lmol／LNa0H来调 节 ，到选预定反应时间后立即置于沸水浴中 5min对酶 进行灭活 以终止水解反应： 1 3．3 水解度的测定，按文献 进行测定 1．3 4 胰蛋白酶活力测定 。 2． 结 果 2．1 牛乳醅蛋自得率 本试验得率为：2．76％ (所得 酪蛋白与脱脂乳的克数比)。 2 2 胰蛋白酶活力 经测定，每克样品中胰蛋白酶 的单位数为 658．10(U／g酶)。 2 3 胰蛋白酶水解酪蛋白最佳工艺条件 2 3．1 正交试验 结果 因素位级表 底袖浓度 U／S DH值 水解温度 水解时间 (％W】 ( ) (oC) (h) A B C D E 1 5 3 29 7 0 40 I．0 2 10 6 58 7．5 50 I 5 3 15 9 87 8 0 60 2 0 4 20 13 16 8 5 70 2 5 胰蛋白酶《游离酶)水解酪蛋白 制备GPP的最佳条件正交试验 ＼ 因素 底袖 水解 水解 泉度 UAS pH值 温度 时间 水解度 (％w) (u／s1 (oC) (h) DH ＼亍 (％) 矗隆专、一 A B C D E I I 2 3 2 3 l0．00 2 3 4 l 2 2 7．88 3 2 4 3 3 4 l1 37 4 4 2 l 3 I 7 01 5 I 3 1 4 d 9 I9 6 3 1 3 4 1 I 85 7 2 1 l I 3 2 87 8 4 3 3 I 2 5 94 9 1 I 4 3 2 6 2l l0 3 3 2 3 3 Il 05 1I 2 3 4 2 1 7 77 I2 4 I 2 2 4 7 15 13 1 4 2 1 1 】1 00 14 3 2 4 1 4 7 12 I5 2 4 2 4 2 8 04 16 4 4 4 4 3 5 18 KI 36 40 I8 08 26．95 26 93 27 63 K2 30 05 32 17 37．24 32 8O 28 07 K3 27．90 33 95 29 I6 35 64 29 10 K4 25 28 35 45 26 28 24 26 34．83 总和 极差R 1I．I2 17 55 10 96 1I 38 7 20 I19．63 因素重 要程度 重要 关键 重要 重要 一般 维普资讯 http://www.cqvip.com 冰淇淋、乳品工业特辑／乳品I业 矗 案 2 3 2 正交试验结果分析 2 3．2．1 直接观察 直接观察的优秀方案：No3 A B 4C，D 】E 4 DH=11 37％ 2．3．2．2 一般计算分析： 根据极差，因素 主次排列顺序是：B，D．A．c，E； 可能最优方案为：A1，I}4，C2，D3，E4 2 3 2 3 考察位级趋势 ．探寻可能更优方案 我们尽量考虑到工业生产的实际情况．如水解时 间不能过长，否则影响设备的利用效率 ：底物不能走 步，否则影响产量 ，扩大反应器的体积；酶量不能太高， 否则提高产品的成本 ，影响经济效益，我们设计可能更 优方案为：A：5％．B：13．16{1／g，C：7 5，D：60'=E，E：3h 2．3．3 第二轮试验计划表 ＼ 因素 底特 水解 承解 浓度 U S DH值 温度 时间 水解度 f％W) (U／g) DII (℃) (hj 方案来 ＼ A B C D E (％) 直接观察 1O 13．16 8 0 6o 2．5 11 37 一 般计算分析 5 13 16 7 5 6o 2 5 15 41 趋势探寻 5 13 16 7．5 60 3 O 15 78 我们比较 “一般计算分析”与 “趋势探寻”两次试 验 ，两者之间只有水解时间的差别，随着水解时间的延 长．水解度逐渐增大，但水解 2．5h以后 ，水解度增加的 幅度不大，故我们确定最终水解条件为：底物浓度 5％ (W／W)，U／S13 16U／g，pH值 7 5，水解温度 60~C，水解 时间 2 5h。 2，4 CPP的提取、精制研究 2 4 I 工艺流程的确定 本研究确定等电电、有机溶剂沉淀法提取、精制 CPP工艺流程 0 酪蛋 白溶液 4 酶解 4 调节DH至4 6，离0(8O00 r／min) l 沉淀 上清液 加10％无机盐溶液至终．残度为1．O％lW／V)一 加至有机溶剂终浓度为50％(V／V)一 离 f8000 r／ndn)一 厂————— 1 上清 沉淀即CPP ． ： 工艺 撇 ⋯ ⋯ 2．4 2 1 酪蛋自水解液中CPP的提取 酪蛋白的等电点为pl|4 6，调节水解液 DH至 4 6． 静置 &h，离心分离酪蛋白沉淀，得含CPP上清液。 2．4．2．2 CPP的精制 (1)无机盐终浓度的确定：各取 1Oral』二清液，分别 加^不同量的 】O％无机盐 使其终浓度各不相同，再 加^相l司量的有机溶剂至终浓度为50％【v／v)，观察出 现絮状白色沉淀的速度及量 无机盐的 。 l。． 0 6 O．8 1 0 1 2 l 1 4 终浓度(％j 沉淀的快慢 慢 }慢 一般 较怯 快 较快 较快 沉淀量 + + ++ r+ 卅 “ +”越 ；，代表沉淀量越 多 确定无机盐终浓度为：l 0 1w／ ) (2)有机溶剂终浓度的确定：各取 lOml i-清液．再 用无机盐调至终浓度为 1 O％(w／vj，然后加人不同量 盟互塑监型：堕基垫萃星釜至塑回：些星墨建篮翟 有机盐的终摩度(％)1 30 I 40 50 l 6o l 7O 沉淀的幔慢 慢 l 睫 快 1快 l快 沉淀量 + l H }卅 I卅 “ +”越 ；，代袁沉淀量越 多 确定有机溶剂终浓度为：50％(v／v) 2．5 CPP的得率 定义为：CPP与酪蛋白的重量之比(干基)．本研究 得率为 27 5％= 2．6 CPP的检测 研究所得 CPP产品，经武汉大学分析测试中心检 测： —CPP分子量为 5000 禽量为 】1％，p—CPP分子 为 3300．含昔为4％．CPP总合 为 l5％。 经农业部食品质量监督椅验测试中 tL,(武汉)捡 测：总磷 3．矾％ 氨6．97％．．氟磷比4 23，水分 3．72， 无苦昧，浅黄自色粉l末。 参考文献 [1】Ootsttka．Ryuichi C,ekkan Fudo Kemokrall 1995．11 (10 J 55～60 【2 JGoto Toshiyuki．e1 ．dI．Nippon Eigo．shokungo Ciakkaishl 1995．48(3】：195～202 【3j Tsuchita．ihroshi el a1．Nutr lles．【N Y ) 1995．15 (11)：1657～1667 [4]沈同，王镜岩，生物化学 f上衍)，北京：高等教育出 版 社 ．199O．12l f 5]赵新淮．冯志彪，食品科学，1994，l1：65～67 f61徐秀兰．生物化学害验与指导．南京：中国医药科技 出版社 ．1994 【7】姜同川，正趸试验设计，山东科学技术出版社．1985 【8 J tleyndds E．C tlielv． P F Adamson． ． j．Anal Biochem 1994，217：277～284 [9 Jtl Nalto．T Nognebi．R ．K 】 “ a『ld H ltldaka． Japan Pate Jl【．1990．2091]～209S 【10】冯风琴 ．许时婴．王璋．食品与发酵X-业，1997， 23l2 ：l 8～21网 维普资讯 http://www.cqvip.com