慢性HBV感染者外周血单个核细胞CTLA-4基因多态性与病情转归的关联研究

明p一，宿主的遗传易感性与病毒的感染 状态相关。T细胞的功能与病毒的感染状态及转归有关。 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxicTlymphocyte associatedagent4。C11A-4)基因参与调节T细胞功能的 ‘基金项目：国家自然科学基金资助项目(30771907) 作者单位：230022安徽省合肥市安徽医科大学第一附属医院感染 病科(张亚飞，解俊侠。郜玉峰．李旭)；安徽省基因研究重点实验室，安徽 省人兽共患病研究所(郜玉蜂，沈继龙) 第一作者：张亚飞男。26岁，硕士研究生，住院医师 通讯作者：李旭，Emil：aylixu@yahoo．∞吐蛳 激活。本研究拟对人类CTLA_4基因多态性与乙型肝炎 病毒感染转归的关系进行初步探讨。 与方法 一、对象190例慢性乙型肝炎病毒感染患者均为 HBsAg阳性并持续半年以上的我院住院患者，男性165 例，女性25例，年龄13—9l岁，平均年龄4l岁。同时选取 HbsAb／HBcAb阳性、肝功能正常的既往HBV感染者93 例(男性79例，女性14例，年龄2—86岁，平均年龄38 岁)作为对照。 二、PBMC第1外显子49位点基因的克隆取外周 静脉血5ml，用EDTA—k2抗凝，似h'pm离心分离白细 胞，酚，氯仿法抽提基因组DNA，一80℃保存备用。根据 GenBank中的基因序列设计引物。引物序列为5’一钾C一 万方数据 CTAClTrCC7rGAAGACCT一3’和3’一AGTCTCACTCAC— CTrTGCAG-5’，由上海Invitrogen公司合成。PCR试剂均 购自大连TaKaRa公司，反应体系为：DNA41xl(浓度 是50ng／m1)。10xbuffer(含M92+)2．51LLl，Taq酶0．25td， dNTP41山I(浓度为1．25mMol／L)，上下游引物各l山(浓度 为10pmol／m1)，总体积为25td。940C预变性5min，94℃变 性30s，48℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环，末次循 环后72。C延伸10min，最后4℃结束反应。产物在含溴化 乙锭的2％琼脂糖凝胶电泳中观察，片段长度为162bp。 三、第1外显子区49位基因SNP检测采用RFLP 法，取PCR产物8lxl，加入10xbuffer21山l，Bbvll仙l，无菌去 离子水91xl，混匀后，55℃水浴作用2小时，在含3％溴化 乙锭的琼脂糖电泳中观察产物，扫描成像。 四、统计学处理研究样本的群体代表性用Hardy— Weinberg平衡吻合度检验，不同组间的基因型及等位基 因频率的比较用戈2检验，P<0．05为差异有显著性。统计 学分析采用SPSSl3．0软件。 结果 一、当CTLA_4基因“9位点为G而非A时，产生一 个酶切位点，162bp片段被酶切成88bp和74bp两个片 段。BbvI酶切后将出现三种结果：基因型AA产生162bp 一个片段，基因型GG产生88bp和74bp两种片段，基因 型AG产生162bp、88bp和74bp三种片段(图1o 1-4，6，8为AG基因型；5，7，11为AA基因型； 9，10为GG基因型。M为DNA 图1 CⅡA_4基因“9位点酶切结果1道：产生三条带为 AG基因型；5道：产生一条带为AA基因型；9道：产生两条带 为GG基因型 二、慢性HBV感染者与对照组CTLA一4基因椭位 点基因型和等位基因频率的比较表明，慢性乙型肝炎病 毒感染者GG基因频率显著低于对照组(P=0．034，OR= 0．42)，且G等位基因频率显著降低(舟0．008，OR=0．607。 表1)。 表l两组CTLA-4基因+49位点基因型和等位基因频率分布 比较f％。(OR)】 基因型频率 等位基因频率组剐例数———— 从 AG GG A G CHB患者19040(o．21)87(0．46)63(0．33尹167(o．44)213(0．56)⑦ 对照组 9312(0．13)36(0．39)45(0．48)60(o．32)126(0．68) 与对照组比，①脚．034，OR=O．42；与对照组比，②尸：o．008， OR---O．607(95％CI1．209—3．477) 讨论 病毒感染的清除主要依靠T细胞的功能，目前认为T 细胞的应答、活化至少需要两种信号，第一信号为抗原识 别信号，第二信号来自抗原呈递细胞与T细胞上的共刺 激分子结合，如CD28／B7、CD40／CD40L信号通路。如仅有 第一信号而无第二信号，则导致T细胞无功能或引发其 程序性死亡。CⅡA_4是B7／CD28家族成员，它与CD28 具有结构上的相似性，在氨基酸水平上两者有31％的同 源性。它们有共同的配体B7—1(CD80)和B7—2(CD86)分 子，但它能以高于CD2820倍的亲和力与B7结合阁。与 CD28比较，CTLA_4表达于激活的T细胞上，传递阻止 信号，对T细胞的增殖起负性调节作用，引起T细胞凋 亡，阻止免疫反应的发生。有研究表明嘲，CTLA一4缺陷的 基因敲除小鼠会引起T细胞的过度活化、脏器淋巴细胞 浸润和血清免疫球蛋白异常增高，出现类似于自身免疫 疾病的症状。 众多研究表明16-91，CTLA_4+49G与某些由于免疫反 应所致疾病(如1型糖尿病，Grave’s病，自身免疫性肝 炎，系统性红斑狼疮)发生的危险性相关。另有报道I堋，该 基因类型与a一干扰素治疗丙型肝炎后病毒的清除密切 相关，与乙型肝炎病毒感染后的病毒清除也相关【ll】。 CⅡA_4基因“9位的A—十G替换，导致C711A-4引 导序列第17位氨基酸由苏氨酸变成丙氨酸。如此变化改 变了该位置氨基酸的极性，很可能改变了该氨基酸构成 的蛋白质的功能，从而影响CⅡA_4的功能。 本研究结果提示，C11A-4基因第1外显子区基因多 态性与乙型肝炎病毒感染的转归有关，G／G基因型可能 与降低crllA-4的功能有关，有关机制有待进一步研究。 参考文献 脚HOHLERT，GERKENG，NOTGHIA，eta1．HLA-DRBl+1301 and+1302protectagainstchronichepatitisB叽JHepatol， 1997．26：503-507． 万方数据 塞旦旺壁速盘查2鲤!生!Q旦筮!!鲞筮§塑Z逝麴型：延!逝兰QQ墨：12l：!!塑!：兰 【2】LEEWM．HepatitisBvirusinfection忉．NEnOJ Med。 1997，337：1733—1745． 【3】THURSZMR．Geneticsusceptibilityinchronicviralhepati— tis们．AntiviralRes，2001，52：l13-116． 问 wEAlHERALLD，CLEGGJ，KⅣIATK0wSⅪD．n把role ofgenomicsinstudyinggeneticsusceptibilitytoinfectious disease【J]．GenomeRes，1997，7：967—)73． f5】 CHAMBERSCA，KUHNSMS，EGENJG，eta1．C兀‘A-4一medi- 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