大枣多糖的提取工艺

篓 鱼 塑 — — 大枣多糖的提取工艺 李志洲 杨海涛 邓百万 1(陕西理工学院化学系，汉中，723001)2(陕西理工学院生物系，汉中，723001) 摘 要 对大枣多糖提取及纯化工艺条件进行 了研究。结果明，大枣 多糖最佳提取工艺为 大枣：水(g：mL)=1：20，9012，pH为 8时浸提2 h，多糖浸提率可达 3．5％。蛋 白质去除最佳．Y-艺 为，pH 8，胰蛋白酶用量1 200 U／g，时间2 h，温度37℃，蛋白去除率可达98．6％。 关键词 大枣，多糖，提取，纯化 大枣多糖是大枣中重要的生物活性物质， 可作为免疫促进剂，能控制细胞的分裂和分化， 调节细胞的生长和衰老。经检测，大枣多糖具 有明显的抗补体活性和促进淋巴细胞增殖作 用，对提高肌体免疫力具有重要的作用。可广 泛应用于医药、保健品及功能食品，作为绿色生 物医药产品具有广阔的市场前景。文中对陕北 清涧滩枣的多糖提取工艺进行了研究，初步探 讨出一条较为简便的生产工艺，为其工业化生 产提供参考⋯。 1 材料与方法 1．1 原 料 大枣，陕北清涧滩枣。 1．2 仪器与设备 722型分光光度计(上海第三分析仪器 厂)，TDL一40B离心机(上海安亭科学仪器厂)， KS一1200 ULTRASONIC CLEANER(宁波科声 仪器厂)，单盘分析天平(DJ一100一北京光学仪 器厂)。 1．3 试剂与溶液的配制 1．3．1 主要试剂 葡萄糖，苯酚，浓H2S04，无水乙醇，考马斯 亮蓝G一250，胰蛋白酶，牛血清蛋白等均为分析 纯。 1．3．2 10％苯酚溶液的配制 取苯酚适量，称取25．0g，置250 mL容量 第一作者：学士，讲师。 *陕西省教育厅重点科研项目(No．03JS027) 收稿时间：2004—07—29。改回时间：2004—10—28 瓶中，用水稀释至刻度摇匀，避光，冷藏。 1．3．3 标准溶液的配制 精密称取于105℃干燥至恒重的葡萄糖标 准品1．2500g。将其定容至250mL容量瓶中， 吸取5 mL至另一个250 mL容量瓶中，再稀释 到刻度，得到浓度为100 mg／L的标准溶液。 1．4 多糖的测定与纯化 J 1．4．1 多糖的测定 采用苯酚一硫酸法，以葡萄糖为标准样品。 苯酚一硫酸法，以葡萄糖作标准曲线。分别 取标准溶液(质量浓度为 100 rag／L)0．1、0．2、 0．3、0．4、0．5、0．6、0．7mL依次加水，使最终体 积均为 1 mL。另取H，O 1 mL作空白试验，每 支试管加质量分数 10％苯酚溶液1 mL，摇匀。 用移液管向每支试管中缓慢加入浓 H2SO4 5 mL，并放人冷水中冷却，摇匀。在490 nm下比 色测定，以糖的质量浓度为横坐标，以吸光度为 纵坐标，绘制标准曲线，得直线方程为：A= 7．0C+0．004，相关系数 r：0．699。 1．4．2 多糖的纯化 以牛血清蛋白作标准曲线。分别吸取牛血 清蛋白标准溶液(质量浓度为0、200、400、600、 800、1 000rag／L)0．1mL，每个样品放人10mL 具塞试管中，加入考马斯亮蓝 G一250蛋白染色 剂5 mL，静置2 min，用 10 mm厚的比色皿在 595 Flm下读取吸光度。在吸光度一蛋白含量坐 标图上作标准曲线，得方程：A：0．006 7C。 (127) 维普资讯 http://www.cqvip.com 2 试验内容 2．1 多糖提取工艺 大枣一粉碎一称重一水浸提一上清液一乙 醇沉淀一复溶一去除蛋白质一纯多糖 2．2 试验条件的选择 2．2．1 多糖提取工艺条件确定 确定浸提温度、时间、水料比和pH值为影 响因素，每个因素选三个水平(见表 1)，每组以 10g原料计，作 (3 )正交试验。多糖测定取 浸提液0．5 mL，加清水至 1 mL，加质量分数 10％苯酚溶液 1 mL，摇匀，用移液管向每支试 管中缓慢加入浓H2SOn 5 mL，并放入冷水中冷 却，摇匀，静置20 rain，在490 nm下比色测定吸 光度，将测定的吸光度代入标准曲线，求被测液 多糖浓度，进而求得浸提液多糖含量，并最终求 得提取率。 表1 多糖浸提试验条件 序号 E：浸提液体积(mL)，F：多糖质量浓度(mg／mL)，G：浸提率(％)。 表2结果表明：影响浸提率因素顺序为：加 水倍数>酸度>温度>浸提时间。最佳参数为 大枣：水(g：mL)：1：20，90*(2浸提2 h，酸度pH =8。在此工艺条件下浸提率为3．5％。 (128) 2．2．2 浸提级数的确定 在最佳的提取条件下对原料连续浸提 3 次。其结果为，第1次浸提后浸提率为3．5％， 第2次浸提后浸提率为2．68％，第2次浸提后 浸提率为 1．16％。考虑到后期醇析工序的经 济性，采用2级浸提为宜。 2．2．3 超声波提取多糖 频率超过20 kHz的声波称为超声波。超 声作为一种机械能量方式，已经广泛应用于化 工、医学及生物学等多个领域[ ．8】。超声波提 取技术是利用超声波产生的强烈振动、高的加 速度、强烈的空化效应和搅拌作用等，加速物体 有效成分进入溶剂，从而提高提出率，缩短提取 时间，并且免去了高温对提取成分的影响。因 此把超声波作为提取的一种手段，在这个领域 中具有良好的应用前景。 称取5 g大枣，加水100 mL，调节pH=8， 放入超声波炉中提取，试验结果如表3所示。 表 3 超声波提取结果 表3结果表明，在相同pH值，相同倍数浸 提剂条件下，随着时间加长，浸提率依次提高， 当时间为60 S时浸提率达到最高值4．96％，而 后时间延长，浸提率依次降低。比水浴提高了 1．46％。这说明超声波浸提，能节省时间，提高 浸提的经济性。 2．2．4 醇析条件的选择 取一定体积的经提取、分离、抽滤后的上清 液，分多组少量多次的加入不同量的乙醇于清 液中，使乙醇终体积分数分别为 75％、80％、 85％。沉淀24h后离心，取其上清液测其多糖 的含量。结果表明，乙醇体积分数升高，醇析量 一他 ∞ 叫如 } ．．．．．．．． 一0 1 2 i 3 3 0 一 一2 8 9 1 9 0 7 0 0 ．一9 7 6 6 3 5 8 6 0 F一0 0 0 0 0 1 0 1 1 一 ． ． ． ． ． ． ． ． ． 一0 0 0 0 0 0 0 0 0 一 E一 加 矾 鹅 一 1，‘1，‘ ，‘1 D一 2 3 3 2 2 3 口：0 0 一 一 C一 2 3 2 3 3 2 0 一 2 6 6 0 2 2 B一 2 3 2 3 2 3 m m Ⅲm 一 ～ A一 2 2 2 3 3 3 0 0 ， 。 。 Ⅲ R 维普资讯 http://www.cqvip.com 增多，但乙醇终体积分数超过 75％后，醇析量 增大比例不甚明显，且上清液中多糖含量降低 不大，考虑到经济因素，故选择醇析浓度为 75％。 2．2．5 酶法脱蛋白 准确称取0．6000g大枣多糖粗粉溶于pH = 8的50 mL水中，加入0．001 g CaC12使其完 全溶解。称取2g胰蛋白酶溶于100mL pH：8 的蒸馏水中，配成 5 U／mL的酶液。分别吸取 样品液5mL于6支干净的锥形瓶中，将酶液及 样品液同时放人37℃水浴锅中预热 10 min，然 后分别吸取酶液3(15 U)、6(30 U)、12(60 U)、 14．4(72 U)、18(90 U)、21．6 mE(108 U)依次加 入上述样品瓶中，并振荡保持30 min后放人 100℃水浴锅中灭酶10rain。冷确至室温。 在体积分数75％乙醇中醇析 2 h离心分 离，弃取上清液将沉淀物烘干、称重。加水(pH ：8)溶解，配成相同浓度的溶液(0．07 g／mL) 用考马斯亮蓝G_250在595 nm处测定吸光度。 表 4 酶法脱蛋白试验结果fpH=8．02) 编 号 多糖质量／g 加水量／mL 胰蛋白酶用量／U 吸光度 1．0 1．1 1．2 1．06 1．18 1．1 13．7 15．O 16．4 14．5 16．2 15 15 30 60 72 90 108 0．845 0．832 0．822 0．805 0．800 0，802 表4结果表明，当胰蛋白酶用量在1 200 u／g(原料)时纯化效果最好，蛋白去除率可达 98．6％。 3 讨 论 (1)在本试验中采用水浴浸提大枣多糖和 超声波提取多糖2种方法，在90℃时，加水20 倍，pH=8，浸提 2 h时，浸提率最高，可达 3．5％；在相同条件下，用超声波提取技术浸提， 60 s可达最大浸提率为4．96％，说明超声波浸 提费时短，提取率高，是一种值得推广的方法。 (2)文中用酶法进行了大枣多糖的纯化， 得出酶脱蛋白的最佳工艺为，时间 2 h，温度 37℃，pH=8，胰蛋白酶用量为1 200U／g。蛋白 去除率可达98．6％。 参 考 文 献 1 张 立．马 琼．灵芝，香菇，枸杞提取物中多糖含 量测定[J]．中草药，2004，35(2)：167～168 2 苏拨贤主编．生物化学制备技术[M]．北京：科学出 版社，1986．32～33 3 蔡武城．袁厚积主编．生物物质常用化学分析方法 [M]．北京：科学出版社，1982 4 李志洲．邓百万．杨海涛等．美味牛肝菌最佳提取工 艺研究[J]，氨基酸和生物资源，2003，25(3)：27～ 29 5 李世敏．刘 冬．金针菇多糖提取新工艺的优化 [J]．食品与发酵工业，2002(10)：45～48 6 王丽华．李元瑞．陈 懿等．姬松茸多糖脱蛋白方法 研究[J]．食品科技，2003，26(1)：18～19 7 马 骥．超声在植物生理学领域的应用[J]．西北植 物学报，2004，24(5)：957～958 8 黎海彬．李 琳．郭祀远等．药用植物有效成分提取 技术[J]．现代化工，2002，22(5)：59～62 Study on Extraction of Polysaccharide from Juj ube Li Zhizhou Yang Haitao Deng Baiwan2 I(Department of Chemistry shaanxi University of Technology，Hanzhong，723001) 2(Department of biology，Shaanxi University of Technology，Hanzhong，723001) ABSTRACT The optimal conditions for extraction and purification of polysaccharide from J uj ube were studied in this paper．The optimal parameters are as follows：the ratio of water to raw materiaI being 20，extraction temperature being controlled at 90℃，pH being adjusted to 8。the time of extrac— tion being 2 hours．Under this condition，the extraction rate was 3．5％．The process for removing residual protein was studied and optimized．The optimal conditions included pH being controlled at 8． Trypsin usage 1evel at 1 200 Ug．The rate of purification reached 98．6％． Key words J uj ube，polysaccharide，extract，purification (129) 维普资讯 http://www.cqvip.com