富锌冬虫夏草菌丝体有机化程度及氨基酸含量分析

星 篓 塑 — — 富锌冬虫夏草菌丝体有机化程度及氨基酸含量分析 贾 乐 于克学 姚良同 温孚江 (山东农业大学生命科学学院，泰安，211018) 摘 要 对冬虫夏草进行液体富锌培养，结果明，培养基中适宜添加锌浓度为150 g knL，此时 茵丝体生物量达到10．7g ，茵丝体含锌量为4 875．1 g／g，富锌率为34．05％，有机化程度达到 76．33％。分析氨基酸含量，富锌冬虫夏草茵丝体中氨基酸含量比对照明显增加，说明锌能促进其 氨基酸生物合成。 关键词 冬虫夏草，锌，有机化程度，氨基酸 锌是人体必需的微量元素，人体中约有70 ～ 100种酶的合成与锌有关，锌参与多种代谢 过程，能促进人体生长发育和增强人体免疫机 能 1--3]。 冬虫夏草 (Cordyceps sinensis)富含虫草 素、虫草多糖、蛋白质、维生素、微量元素等生物 活性物质。但是，冬虫夏草自然资源稀少，加上 因需求增长而进行的不合理采挖，使虫草资源 严重短缺，因此液态培养菌丝体成为解决这一 问题的重要手段_4 J。文中以冬虫夏草为载体 进行液态培养富锌，并对富锌冬虫夏草菌丝体 进行了有机化程度及氨基酸含量分析。 1 材料与方法 1．1 材 料 供试菌株：冬虫夏草 G2(本实验室保存)； 斜面培养基(％)：马铃薯汁20，蔗糖2，琼脂2， 自然pH。种子培养基(％)：马铃薯汁20，葡萄 糖 2，KH2po．0．15，MgSO4 0．1，CMC—Na_0．2， 水 1000mL，pH 6．5。摇瓶培养基(％)：马铃薯 汁20，葡萄糖 3，酵母粉 0．4，KH2P04 0．2， MgSO4 0．1，CMC—Na 0．2，水 1 000mL，pH6．5。 1．2 仪器与试剂 1．2．1 主要仪器 第一作者：博士，副教授(温孚江为通讯作者)。 *山东省教育厅资助项目(JOIK32) 收稿时间{2004—04—12，改回时间：2004—06—24 HQL一150A型恒温摇床(中国科学院武汉 科学仪器厂)；uV一190分光光度计 (SHI— MADZU CORP0RAT10N KY0T0 JAPAN)； PU一9200原子吸收光谱仪；日立835—50型氨基 酸自动分析仪。 1．2．2 试 剂 锌源：ZnSO4(上海海光化学制药厂)，其他 试剂均为分析纯。 1．3 方 法 1．3．1 液体菌种制备 取经活化的试管斜面菌种一块(约1 cm2)， 接入盛有60 mL液体种子培养基的250 mL三 角瓶中，25℃静置24 h。25℃，160 r／min振荡 培养72 h，得液体菌种。 1．3．2 液态摇瓶培养 将液体菌种接入装有50 mL摇瓶培养基的 三角瓶中，接种量为5％，分别加入终浓度为0、 30、50、100、150、200、300 t~g／mL的 ZnSO4母 液，25℃，160 r／min振荡培养96 h。 1．3．3 茵丝体生物量测定 将培养液于3 000 r／rain离心20 min后得 菌丝体，60℃烘至恒重，测菌丝体干重。 1．3．4 锌含量的测定 原子吸收法。 1．3．5 富锌率的计算 (95) 维普资讯 http://www.cqvip.com 富锌率 [宣箜董竺堡壁全量! g !二窒鱼董竺堡壁全量i g 2] 宣堡董竺堡±重!g Q 2 培养基内锌含量(~g／100 mE) 1．3．6有机化程度分析 持续透析法 j。 精确称取 0．5 g冬虫夏草菌粉，在含有 0．02％叠氮化钠的双蒸水中反复透析，直到用 茚三酮法检验透析液中无氨基酸，浓缩透析液， 测定透析液中锌含量。透析液中无机锌可以代 表富锌菌丝体中的无机锌，有机化程度指菌丝 体中有机锌与总锌含量的比值。 1．3．7 各组分中锌的测定 (1)称取 2 g菌粉，用浓盐法提取核酸 j， 提取液经Sevag法 J除蛋白后，调pH至2．0～ 2．5，冰水浴中静置30min，离核酸沉淀，用 95％乙醇淋洗3次后测定锌含量。 (2)在上一步提取的残渣中，加水50 mL， 沸水提取2h，分出滤液，重复2次，合并滤液。 Sevag法除蛋白，抽滤，上清液中加4倍95％乙 醇，静置过夜，离心得多糖沉淀，95％乙醇淋洗 后测定锌含量。 (3)称取 2 g菌粉加 100 mL 0．25 mol／L NaOH溶液，50℃水浴提取 4 h，加(NH4)2SO4 至95％饱和度，冰箱中静置过夜，离心后得蛋 白质沉淀，用乙醇一乙醚(2+1)混合液淋洗3次 后测锌含量。 1．3．8 氨基酸含量分析 精确称取冬虫夏草菌粉 100 mg，分别置于 水解管中，加入6 mol／L HC1，110℃水解 24 h， 开管定容至100 mL，取2mL在60℃下减压蒸 干，加稀释液2mL，取50肚L进样测定。 2 结果与讨论 2．1 菌丝体生物量及含锌量 由图1可以看出，培养基中锌浓度在0～ 100／~g／mL范围时，对菌丝体生物量影响不明 显，且低浓度锌对菌丝体生长有促进作用；锌浓 度为100／~g／mL时菌丝体生物量达到最大值， 为1．178 4 g／100 mL；150／~g／mL时，菌丝体生 物量为1．066 g／100 mL；浓度超过 150肚g／mL 时，菌丝体生物量急剧下降，而且随着锌浓度逐 ×1OO％ 步升高，有进一步下降的趋势。因此确定冬虫 夏草液体培养最佳富锌浓度为150／~g／mL。 + 菌丝体生物量：+ 苗丝体舍锌量 图 1 富锌菌丝生物量及含锌量 菌丝体中对照组锌含量为87．01 g ，当 菌丝体生物量达到最大时，菌丝体中锌含量为 3222．0 g／g。培养基中锌浓度低于100／~g／mL 时，菌丝体中锌含量与菌丝体生物量有较好的 线性关系；浓度达到300／~g／mL时，虽然菌丝体 中锌含量很高，但菌丝体生物量却很低。当锌 浓度为150~g／mL，即达到培养基最佳富锌浓 度时，菌丝体中锌含量为4 875．1 g／g。 2．2 富锌率的变化 由图2可以看出，随着培养基中锌浓度逐 渐升高，冬虫夏草的富锌率逐渐降低。培养基 中锌浓度为 30 t~g／mL时，富锌率达到最高 70．87％；浓度在50～200／~g／mL时，富锌率多 在35％～50％之间；超过300 gg／mL时，富锌 率急剧下降。在培养基最佳富锌浓度150 ttg／ mL时，冬虫夏草富锌率为34．05％。 魁 忙 赵 碍 墩 衄 0 100 200 3OO 400 培养基锌浓度 g．mL～ 图2 富锌率及有机化程度曲线 2．3 有机化程度分析 维普资讯 http://www.cqvip.com 如图2所示，冬虫夏草有机化程度与富锌 率有较好的线性关系，有机化程度最高可达 91．85％。在培养基最佳富锌浓度 150 btg／mL 下，有机化程度达到 76．33％。随着培养基中 锌浓度逐渐升高，菌丝体中锌的有机化程度也 在逐渐降低，这是由其富集机理决定的。冬虫 夏草富集微量元素的过程主要经历了一快一慢 2个步骤：第1步，生物吸附过程，培养基中的 离子通过络合或离子交换等形式与菌丝体细胞 表面的化学基团结合，这一过程快速且不需要 能量，与代谢无关，主要受离子种类与浓度、 pH、富集时间、竞争离子等因素影响；第2步， 主动运输过程，离子透过细胞膜进入细胞内部， 形成真正的有机态微量元素，这一过程缓慢且 需要能量，与代谢过程有关，主要受代谢强度影 响。 2．4 各组分含锌量分析 由表1可以看出，冬虫夏草菌丝体中蛋白 质是有机锌的主要结合对象，蛋白锌占菌丝体 总有机锌的64．5％。另外有少量锌与多糖结 合，占18．4％。 表 1 培养基锌浓度为 150ltg／mL时冬虫 夏草各组分锌含量分析 2．5 氨基酸含量分析 从表2可以看出，在培养基中添加不同终 浓度锌离子后，冬虫夏草菌丝体中氨基酸含量 均比对照明显增加，其氨基酸总和分别比对照 提高了53％、77％、65％、53％、63％和82％，说 明适宜浓度的锌元素能促进冬虫夏草菌丝体中 氨基酸的生物合成。 表 2 冬虫夏草菌丝体中氨基酸含量分析 续表2 注：“一”未测定。 3 结 论 对冬虫夏草进行液态富锌培养，结果表明， 培养基中适宜添加的锌浓度为 150 btg／mL，此 时菌丝体生物量达到1．07g／100mL，菌丝体含 锌量为4 875．1 btg／g，富锌率为34．05％，有机 化程度达到76．33％，其中主要为蛋白锌，占总 有机锌的64．5％。氨基酸含量分析表明，添加 不同终浓度锌离子后，冬虫夏草菌丝体中氨基 酸含量均比对照明显增加，分别提高了53％、 77％、65％、53％、63％和82％，说明锌能促进 其氨基酸生物合成。 参 考 文 献 1 陈必琏，黄 建．我国富锌和富硒功能性食品研究 现状[J]．食品研究与开发，1999，20(1)．33～36 2 陈炳卿．营养与食品卫生学[M]．北京：人民卫生出 版社。1994，36～4O 3 葛可佑，常素英．中国居民微量营养素的摄入[J]． 营养学报，1999，21(3)：322～327 4 杨淑全，王澄澈．冬虫夏草液体培养初报[J]．中国 食用菌，1998，18(5)：28～29 5 孙希雯，李齐庚．金针菇富锌条件及锌结合形态的 研究[M]．微生物学报，1997，37(1)：4O～46 6 张龙翔，张庭芳，李令媛．生化实验方法和技术 [M]．北京：人民教育出版社。1981．224～225 维普资讯 http://www.cqvip.com 7 姚桂卿，周建树．冬虫夏草培养及菌丝多糖的提取 ～49 纯化研究初报[J]．微生物学杂志，1994，14(2)：47 Analysis of Organized Degree and Content of Amino Acid in the Zn-accumulation Mycelia of Cordyceps sinensis Jia Le Yu Kexue Yao Liangtong Wen Fujiang (College of Life Sciences，Shandong Agricultural University，Taian，271018) ABSTRACT Cordyceps sinensis was cultured in liquid medium containing Zn ions．The result showed that the biomass of mycelia reach 10．7g／L，content of Zn 4 875．1 g／g，ratio of Zn—accumulation 34．05％ and organized degree of Zn 76．33％ when content of Zn ions in medium is 150／~g／mL．The analysis also showed that the content of amino acid in Zn--accumulation Cordyceps sinensis is consider-- ably increased than the origina1．A conclusion can be made that Zn can activate biosynthesis of amino acid． Key words Cordyceps sinensis，znic，organic degree，amino acid <功能食品研究与应用> 吴谋成主编，2004年1月出版，30元 被人们称为“21世纪的食品”的第升代功能食品(保健食品)，是食品营养与功能研究的热门课题，是 当今的研究前沿与方向。本书上篇对第三代功能食品的概念、发展方向、各类功能活性成分及其性质与 结构的研究方法、功能评价、提取、分离纯化、制备进行了详细的阐述；下篇对各生理阶段人群的营养及常见病，各 类功能食品进行了介绍。 <发酵工程实验技术> 陈 坚、堵国成、李 寅、华兆哲编著，2003年5月出版，56元 该书是<生物实验室系列>丛书中的一本，重点介绍了涉及各种生物反应器的微生物细胞、动物细胞和植物细 胞培养技术，包括发酵工程实验室的建立、实验室规模生物反应器的使用、菌种保藏、接种技术、无菌操作郊术、发 酵过程的检测与传感器、连续培养和补料分批培养操作技术等内容，还详细讨论了发酵过程控制、建模和仿真等 发酵工程领域的前沿技术。本书将国外最新实验技术、国内现有的实验材料以及作者自己的科研有机地结合起 来，前沿性、实践性和系统性构成了本书的拓色。 <食品与农产品品质无损检测新技术> 陈 斌、黄星奕编著，2004年3月出版，25元 食品与农产品品质无损快速检测技术是20世纪后期发展起来的集物理学、化学、物料物性学、分析仪器、数 据处理、信号分析煌计算机应用等学科为一体的交叉型应用科学。本书从原理和应用两个方面，介绍了利用食品 与农产品的力学特性、电学特性、光学特性、外形特征和嗅觉特性等快速检测其品质的新技术。 <动物细胞培养技术与应用> 王 捷主编，2004年5月出版，32元 该书作为<实用生物技术丛书>(共7册，已出版5册)中的一册，全面系统地介绍了动物细胞培养技术的最新 理论和应用。内容包括：动物细胞培养的基本过程和放大技术，动物细胞在单克隆抗体制备、疫苗生产、基因重组 蛋白药物生产、组织工程、SARS研究中的应用，外源基因在动物细胞中的表达与产物纯化，树突状细胞的制备技 术。全书内容紧密结合实际，具有较高的学术价值。 其他已出版的4册分别为：<酶的生产与应用>(郭勇主编，2003年 10月出版，35元)；<基因克隆技术在制药 中的应用>(杨汝德主编，2004年1月出版，45元)；<细胞融合技术与应用>(罗立新主编，2004年1月出版。25 元)；<植物细胞培养技术与应用>(郭勇 崔堂兵 谢秀祯主编，2004年1月出版，33元)。 以上各书均可在编缉部订购，另加15％的邮费。 。 管息 霄～ 维普资讯 http://www.cqvip.com