高效液相法测定β—胡萝卜素

每食品检洲 (-t-品工业》 1999年第2期 -45 ， 莺 害 鹄 畚 - { 蒜 ≥ 《毒 ；j §0 荸 棼 《誓《 瓴 《 辑 辑 辞 睨 《 上海市食品I业研究所 刘霄玲 李伟英 l／左景善 言 P一胡萝 素 g )：ABS 45。×4 l7 p一胡萝 }、素属脂溶性维生素，对人体健康、促进 1．4 样品制备 生长、提高免疫力起到重要作用，在人体内最终转化为 维生素A。其硷删方法早在二十多年前 AOAC上就有 紫外法、分光光度比色法等，目前在多种杂志上发表用 高效液相法测定(90版国标法是用纸层析法)。但是正 如美国FDA所指出：方法虽多，测定的结果误差也很 大，有鉴于方法的重要性，FDA提出了他们使用的 方法．邀请了国际上 24个较有影响的检测试验室参加 台作验证测定 我们也是其中之一。他们提供了7只食 品样品、标准参考样品和j蚵l定方法，因我们现有的仪器 不同，经多次测定，本方法对奶粉样品中P一胡萝 I、素 的变异系数为 1．23％，回收率为 101 5％ 1， 材料与方法 1．1 仪 器 A．U~／VIS可扫描光谱仪 B．由泵、进样器、UV／VIS检测器、仪或数据 处理机组成的}Ⅱ，Lc C．HPLC柱 ODSC18 5／1 ∞ ，Pbres趾 150A或类似的注。本 试验用国产 OOSC18，3．9x1．~mm (Ah~．h公司提世 ) D．玻璃仪器等 1．2 试 剂 KOH(分析纯)5o％溶液 乙醚(分析纯) 乙醇(分析纯) 无水硫酸钠(分析纯) 己烷(分析纯) 甲醇(分析纯) 1％酚酞溶液。 +106nl乙醇 vjfc生化级) ~ r(FDA提供) 乙睛(}Ⅱ，Lc级) 二氯甲烷(分析纯) 蒸馏水 1．3 标准参考溶液 B一胡萝 I、素标准溶液 1．3．1 母 液 精确称取 p一胡萝 卜素 (来自FDA)于25(I'nl 容量瓶中。用已往溶解，另加几滴三氯甲烷将 p～胡萝 素完全溶解，然后用己烷定客到刻度 1．3．2 标准工作液 移取 l~-al母液于 5【hd容量瓶申．并用已烷定 客。在 4跚m波长下测定其吸收值，并按下式计算浓度 1．4．1 精确称取或量取在最后抽提液审台 1．0IU／ p一胡萝 素的混合样品于园底烧瓶中。 1．4．2 皂 化 加 6 d乙醇 +0． vc。加 10g KOH溶蔽。(对于 脂肪含量高的样品，要使用更多的KOH，以保持 KOH 浓度在 35％左右的水平)用空气回流管在沸水浴上回 流 30／~n，对脂肪含量高的样品回流 6(h'An，对脂肪含 量低的样品 30n'An已够 冷却 惶 温后抽提。 1．4．3 抽 提 (1)将皂化液定量转移到分液漏斗中，用 8(h~l水 洗涤烧瓶，再用 5【hd乙醇淋洗 (2)加 6【hd乙醚到分 液漏斗中．倒置并放气，激烈振摇并时时放气。(3)分 层，如出现乳化现象，加乙醇破坏乳化层。(4)将下层 (水相)放到第二个分液持斗中。(5)加 6 i乙醚．按照 2 和 3 进行第二次抽提和第三次抽提。(6)将下层(水 相)敬到废液杯中。(7)将三次乙醚层台并到—个分液 漏斗中，用乙醚淋洗分液漏斗 。(8)加 8(h~l水到醚相， 洗涤井去水相(底层) (9)加 81rrt水，旋转或轻轻地振 摇，弃去水相。(10)重复以上9 ，但振摇时擞烈些。 (11)继续甩水清洗醚层，直到 1％酚酞显中性(在弃击 的水中没有明显的粉红色)。(12)将醚相通过无水硫酸 钠到烧杯中，井用少许乙醚淋洗分液埽斗。(13)将醚相 放在蒸汽浴上，在N 气流下将乙醚接近蒸干．然后从 水塔上移开，用N：继续吹干 (14)立即用己烷将残渣 定量地转移到容量瓶中．并定容。 1．4．4 分析与计算 在将样品进样到I-l=1．C之前，按照下 U步骤先测 出工作液的浓度。 (1)测定 p一胡萝 I、素的参考标准工作液的浓度 a．在UWVIS分光光度计土从520t~到 390m~对 P一胡萝 素的步骤工作液扫描 ，波长扫描速度 1．嘶n／sec。纸速 jnch，吸收值范围0～1．0，参考 液和样品液都用己烷调零 b．记录吸收值井按照下列公式计算标准工作液 的浓度 ABS45Qrrn×4 17=mc g／ml (2)设定 }Ⅱ，Lc条件 a．柱 ：嘶 C18 3．9×15~ra ， 维普资讯 http://www.cqvip.com ． 46．1999ff-~2辩 《食品工业》 每食品检潮 b．流新 目；70％乙腈；加％二氯甲烷；8％甲醇；2％ 2．3 回收率 水 c．流速 ：2．(xnl／min d．纸速：0．5an n e．检测器：436rrn固定波长或可变波长的 45嘶 f．范围：0．OIAL~S (3)进样：标准与样品 a．进 5—10V-I，保留时间必须在 2--6min b 测定标准和样品峰高 c．计 算 p一胡萝 素=PHI／P} ×V2／Ⅵ ×标准浓度× DFx1 品称样量 式中：Fill一样品峰高(rrm) PH2一标准峰高(ram) V1一样品进样量( ) 、 一标准进样量(“) 标准i农度从扫描中测定的浓度( g／m1) 样品称样量：g I3F：样品稀释系数 2， 稿定培果 2．1 样 品 2．2 变异系数 删定值 平均值 标准偏 差 变异 系数 序子 JU唐 1U／g ±IU／g C．V．％ l 0 B1 2 0 82 3 O 82 4 0 80 0 81 ±0．01 1 23 5 0 81 6 0 81 7 0．79 奶将 巾B一 添加 强化后样品中 回收卓 序 号 胡萝 }素售t 浓度 口一胡萝 卜素 (％)一 IU／g IU／g IU／g 1 0 486 0 51 1 O1 102 7 2 0 486 0 51 l 03 1o6 7 3 0 486 0 51 1 00 100 8 4 0 486 0．51 0 975 95 9 *p一胡萝卜素特化为维生幸A计算。 **平均回收率％为 101．5。 3． 讨 论 3．1 以上操作基本为FDA提供，由于我们实验室条 件的限制和其他原囡．作了以下调整 ．并取得了FDA 的同意。 3，1．1 FDA提供的 眦 柱为 0D6C18 5／10micro 15QA，我们用 ODSC18 3．9x 150(Altech公司提供 ) 3．1，2 FDA提出的眦 条件为施速 ：M~l／nm，灵敏 度 O．02(AL~S)，我们改为流速2．6rnl／min．灵敏度0．01 (^ I．Ⅱ=s) 3．1．3 样品前处理 FDA在样品抽提时每改均用20 乙醚，根据我 们经验，在既节约试押J又抽提完全的前提下。经皂化抽 提改为：精确称取 奶粉+,50ml乙醇 +0． 维生素 c+10gKCH，皂化 3 ，冷却后用 3×617ml乙醚抽提， 最后醚相在 40"C水塔中通 N z蒸干。 3．2 操作方便 ．简单．特别是取消了拄层析或纸层析 这一步骤，没有了各种色素相互干扰，这是最大优点。 3，3 本方甚灵敏度高、准确性和重现性通过回收率 稻变异 系数都好 。 3，4 本实验室所测结果与其它实验室及AOAC法所 删结果比较，见本页下表。表中 a一 由英、美、击等 画家 17十实验室所潮 出的实 验 结果 ．FDA统 计提供 。 b—一所 测敷 据 由FDA提供 。 附 p一 萝 I、素标准和样品分离图谱(略)四 本所剐定值 合作潮定 · 相对信堇 样品名称 统计学平均值 AOAC法剐定值 Iu／g(x1) 标准偏差 IU／g(X 3) (XI—X 2)／ (X2一X3)／ IU／g(X 2) X ×100 X 3×100 各 类 17 20 19 288 3．043 18 74 —8 22 +2 92 奶 粉 0．83 0．963 0．170 0．902 —7 98 +6 76 胡萝 卜素 77．18 74 388 9 81 1如 00 —35鹋 —38 01 蔬 菜 汁 7．27 6 987 0 534 12．57 一42．16 —44 42 婴儿食品 14 42 16．163 2 517 17 6l —1＆ll —8笠 婴儿食品 15 99 17．53 2 763 l7 I2 ～6．60 +2 39 B一胡萝 素丸 1∞90 ll035 1138 10867 ～7．15 +1．54 维普资讯 http://www.cqvip.com