纳豆激酶液体发酵条件的优化

l ▲ g 鲁 1l}I誊T 曲 C 一 一 凸nt口tim |n^ |R}，i 纳豆激酶液体发酵条件的优化 熊晓辉 梁剑光 熊 强 (南京工业大学制药与生命科学学院，南京，210009) 摘 要 以纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus s btillis natto，BSN)为实验菌株，对其液体发酵生产进行 l 了研究。实验考察了发酵条件(温度、接种量、起始pH、装液量)和培养基成分(碳源、氮源、金属离 { 子等)对纳豆激酶产量的影响；在优化发酵条件和培养基的基础上，进行了5L发酵罐放大实验，产 I 酶量为 2250IU／mL。 l 关键词 纳豆芽孢杆菌，纳豆激酶，液体发酵 1987年，日本的须见洋行从纳豆中提取出 物制品检定所制备；尿激酶：南京大学药业有 一 种具有溶血栓功能的物质，定名为纳豆激酶 限责任公司产。 (NattokinaSe，简称 NK)⋯。研究表 明[引，NK 1．2 培养方法 具有纤溶活性，可治疗和预防血栓病，还可激活 1．2．1 BSN种子制备 纤溶酶原，从而增加酶源性纤溶酶的量与作用。 挑取斜面种子接入装有50mL种子培养基 目前常用及有待开发的治疗血栓病的药 品 的250mL三角瓶，30"C振荡培养 18～20h。 有[3】：链激酶(SK)、尿激酶(UK)、重组组织纤 1．2．2 发酵培养 溶酶原激活剂(t-PA)和尿激酶原(pro-UK)等， 将种子接入发酵培养基中，振荡培养，按设 但它们均在不同程度上存在一定的缺陷，或者 计进行实验。 毒性强、副作用大，或在体内半衰期短，或来源 1．3 测定方法 紧缺、价格昂贵，而 NK有望弥补这些不足，具 1．3．1 纳豆激酶的酶活测定方法 有较大的开发潜能，成为新一代抗栓药物【4]。 依据(中华人民共和国卫生部 WS-Oll(X- 本文以本实验室所保存的纳豆枯草芽孢杆菌 006)95)关于“蚓激酶的部颁标准”中“尿激酶琼 (Bacillus subtilis natto，BSN)生产 NK的液体 脂糖——纤维蛋白平板法”进行测定。 发酵条件进行优化，为 NK的产业化奠定基础。 (1)将牛纤维蛋白原溶解于 pH7．4磷酸盐 1材料与方法 举 昱蓑嚣 旱 1．1 材 料 7．5单位／mL的溶液。 1．1．1 菌种与培养基 (2)琼脂糖一纤维蛋白平板制备：取 1％琼 菌种：纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 脂糖溶液 20 mL，先在水浴 5012恒温 10～15 natto，BSN)，本实验室保存。 min，然后将牛纤维蛋白原 15 mL在 50"C水浴 种子培养基(％)：蛋白胨 1，牛肉膏 0．5， 中恒温 5～10 min，待两者温度一致时，将凝血 NaC1 0．5，pH 7．0～7．2。 酶 1 mL和牛纤维蛋白原 15 mL与琼脂糖溶液 发酵基础培养基(％)：葡萄糖 1，蛋白胨 1， 迅速混匀，立即倒平板，凝固备用。 { K2HPO4 0．25，KH2PO4 0．1，pH 7．2～7．4。 (3)发酵液经离心后，取上清液，适当稀释 l 1．1．2 主要试剂 后即为粗酶液。加样 10 L于琼脂糖一纤维蛋 牛纤维蛋白原和凝血酶：均为中国药品生 白平板上，同时以一定单位的标准尿激酶作对 第一作者：博士研究生。副教授。 收稿时间：2003—06—16。改回时间：2003—08—21 维普资讯 http://www.cqvip.com 露纛囊鲁 — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — - - _ 一 现虽然碱性如 pH8．0比中性条件利于菌体生 长，但不利于产酶。因而选择起始 pH7．0为 宜。 照，放置 37"C恒温反应 18h。观察测定溶圈的 直径将其与尿激酶标准品相比较，得出 NK酶 活(相当于尿激酶)单位(IU／mL)。 1．3．2 发酵液中蛋 白质含量的测定 考马斯亮蓝法[ 。以 BSA做标准蛋白曲 线，测定发酵液的 OD595mn值，得到发酵液蛋白 质含量(mgTmL)。 1．3．3 残糖测定 DNS法 J。 1．3．4 生物量的测定 光密度法[引，于 OD660Ⅲn测定。 2 结果与分析 2．1 发酵条件对纳豆激酶产量的影响 2．1．1 温度对纳豆激酶产量的影响 从图 1中可以看出，纳豆激酶发酵的最适 温度为 30"C；过低则不利于细菌的生长，过高 又不利于产酶，且酶在过高温度下极易失活。 2'200 18O0 宅 l400 呈 1000 藿8O0 40O 0 25 30 32 35 温_l童，℃ 图 1 不同温度对纳豆激酶产量的影响 2．1．2 接种量对发酵产酶量的影响 分别接入 1．5％，2％，3％，5％的种子培养 液到发酵基础培养基当中，使其发酵 3 d，测定 各酶活。从图 2可知，接种量对产酶量有一定 的影响，接种量为 2％时，产酶量最高，接近 2 100Iu／mL。接种量太少或太多，都会影响菌 体的生长及酶的产量。因而纳豆激酶产量最高 时的接种量为2％。 2．1．3 起始 pH值对发酵产酶的影响 调节起始 pH至 5．0～10．0，接入 2％的种 子液，发酵 3 d后测定酶活，结果如图 3所示。 当起始pH为7．0时，产酶量最高，偏酸性或偏 碱性均不利于 NK的发酵。实验过程中，还发 曩 1 1．5 2 卫5 3 3．5 4 4．5 5 接种量，％ 图2 不同接种量对发酵产酶量的影响 { 垂 图3 起始 pH值对发酵产酶的影响 图 4 不同装液量对 NK发酵的影响 2．1．4 不同装液量对发酵产酶的影响 500mL的三角瓶中分别加入 50、100、150、 200、250 mL的发酵培养基，培养 3 d后测定 0D660mn及酶活，其结果如图 4。从图 4中可 知，随着装液量的增加，不论是生物量还是产酶 量都呈下降的趋势，说明纳豆菌是好氧菌，提高 溶氧量有利于其生长及产酶。 2．2 发酵培养基的组成对 NK的影响 2．2．1 不同碳源对发酵产酶量的影响 (6a) 维普资讯 http://www.cqvip.com 翻嚏 选择葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、木糖，可溶性淀 粉及甘油作为碳源，浓度为 2％，甘油为 4 mL／ 100mL。其他发酵条件相同，分别在 2～6 d测 定各酶活，其结果如表 1。以葡萄糖为碳源最 高产酶量出现在第 3和第 4天；以蔗糖和木糖 为碳源最高产酶量出现在第 4天；可溶性淀粉 的最高产酶量出现在第 3和第 4天，为 2 333 IU／mL，无论经济上，或发酵周期长短来看可 溶性淀粉都是可取的，因而选择其为最佳碳源。 用甘油作碳源时，从第 2～6天，NK量上升缓 慢，发酵周期较长，发酵液较粘稠，不利于供氧， 故不宜做为碳源。这与 日本竹内尚等人【7]的 报道不一致，可能是菌株不同所致。 表 1 不同碳源对纳豆激酶的影响 2．2．2 可溶性淀粉浓度的确定 确定可溶性淀粉为碳源后，比较其以 1％ ～ 5％几个浓度对产酶的影响，分别于第 2、3、 4、5天测定发酵产酶，结果如图5。 图 5 可溶性淀粉质量分数对 发酵产酶的影响 从图5可见，不同浓度的可溶性淀粉，第 2 天的产酶量无差异，且产酶量均在第 3天或 4 天达到最高值。比较可溶性淀粉质量分数为 2％，396，496时产酶量相差不大，5％的可溶性 淀粉在第 4天达到最大值，而且黏度很大。同 时也说明高浓度的淀粉对 BSN产酶无抑制作 (64) 咖5} 啪景。 量景。 TIIl1．n_、忸{I妊 维普资讯 http://www.cqvip.com 时，产酶下降很快。这是因胰胨浓度过高，抑制 BSN生长，导致产酶量较低。 研囊 鲁 选择 K 、Na 、ca2 、Mg2 、Fe2 、Mn2 、 Cu2 ．其浓度均为0．002 mol／L。考察几种金 2．2．5 金属离子对发酵产酶的影响 属离子对发酵 NK产量的影响，结果如表 2。 表 2 几种金属离子对菌体生长和产酶的影响 从表 2可以看出，ca2 、M 对发酵产 NK有利，K 、Na 对 NK基本没有影响；加入 Fe2 、Cu2 发酵液无 NK活性，可能是其使 NK 失活，或抑制菌株产酶；而加入 Mn2 也使 NK 活性降低。可在发酵培养基中加入 一定的 ca2 、Mg2 提高产量。同时，加入ca2 、Mg2 也利于菌体生长，但各金属离子对 NK激酶的 合成起关键作用。 2．2．6 正交实验优化发酵培养基的组成 在分析发酵条件以及单因素如氮源、碳源 的基础上，选择可溶性淀粉为碳源，胰胨为氮 源，同时考察 Ca2 和 Mg2 对纳豆激酶的影响， 了正交实验，见表 3。所得结果如表 4所 示。从中可知，R值的大小分别为 B>C>A> D，各因素适宜的配比为 A2B2C2D1。氮源的浓 度和 Ca2 浓度对发酵产酶影响较大，碳源的浓 度次之。而表中没有按 A2B2C2D1的配比，需 要做补充实验加以证实。最终酶活为2358Iu／ mL，说明该配比确实为最适产酶培养基。综合 各个方面的因素，以 A2B2C2D1配方为基础，确 立了以BSN发酵生产 NK激酶的适宜培养基 组成为：可溶性淀粉 2％，胰胨 0．5 96，CaCI， 0．0296，酵 母 膏 0．296，K2HP04 0．25 96， K1-12PO4 0．1 96，pH7．0。 2．2．7 纳豆激酶 5L发酵罐放大实验 以优化后的发酵培养基、发酵条件进行发 酵放大实验，5 L的发酵罐配置发酵培养基3 L． 表3 正交实验设计 表 4 正交实验结果 实验号 A B c D NK酶活 ． ／IU·mL一 接种量为2％，转速为 180 r／min。实验结果表 明，BSN在 5 L发酵罐上的生长无明显的延滞 期，在发酵罐里菌体生长较快，发酵周期缩短近 1 d。残糖含量迅速下降，从 3．31％下降到 0．54 96。pH值是先下降后缓慢上升，最后与初 始值接近。检测发酵液的酶活，60 h时的酶活 达到最高 2250Iu／mL。与摇瓶发酵比较，发酵 产酶有所提前，到 60 h可以认为发酵结束。 3 结 论 (1)优化后的发酵培养基最佳组成配方为： 可溶性淀粉2％，胰胨 0．5 96，CaCI20．02％，酵 母膏 0．2％，K2HP04 0．25 96，K1-12PO,0．1 96， pH7．0。 (2)纳豆菌的摇瓶发酵产酶最佳温度为 30℃，在转速 150 r／min条件下，装液量为 100 mL／500 mL，接种量 2％，适宜纳豆激酶的生 产。 (3)在优化发酵条件和培养基的基础上进 行 5 L发酵罐放大实验，纳豆激酶产量达 2 250 ( ) 6 O 7 O 9 8 O 8 8 盯 =2 1 ，‘ 1 ，‘ 1‘ 1 1 1 1 。 2 3 2 3 。 。 2 3 哟 嘲 。 2 3 2 。 3 3 。 2 螂 哟 1 2 1 。 2 3 。 2 3 。 2 3 啷螂 1 ，‘ 1 8 6 9 1 1 1 2 2 2 3 3 3 窨j 1 2 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 R 维普资讯 http://www.cqvip.com ≤ 盛 意 楹 鲁 1须见洋，行。， 等于一 线溶系n 化学 生 5张龙翔，张庭芳，李令媛．生化实验方法和技术 。。 ． ： 1 1 (I 、 囝M匠扰厶 1 51~I ~,199 ； ．版社 9 7，，J． O0。-，JL70 2 平： 。 究 。国夕 成 6 、 ’ 法 ． 髦 、 舟 9(2 匕 ) 击 ：67 ⋯ -- 7 秉 -二 ⋯一 ～ 3 · 黼 购 栅 n 7 茹： 造 ]_日本 工程进展 ， ：． --AO1995 15(5)46 49 ⋯ ’一 ～ ⋯ ⋯ ～ 一 ⋯ ⋯⋯ ⋯ 。 市场动态 我 国番茄昔 出口价格攀升 由于2003年我国番茄产量大大低于预计水平，且同期世界其他主要番茄酱生产国产量也出现下滑，我国番茄 酱出口价格迅速攀升。 据我国番茄酱加工企业反映，2003年新疆开春比较晚，而且还受到低温、雨水和大风天气的影响，番茄收获期 推迟。番茄成熟度不够。预计 2003年的番茄产量和加工量不会超过 2002年的水平，产量约为270万 t。 由于番茄成熟度不够，固形物含量低，使得加工成品率下降，我国新疆等番茄主产区前期普遍出现原料供应紧 张。工厂开工不足的情况。同时，欧洲主要番茄酱生产国意大利、西班牙和希腊普遍受到高温和干旱天气的影响， 番茄减产幅度也比较大。 由于国际市场番茄酱供应不足，我国番茄酱出口价格迅速上升。来 自加工企业的消息称，9月初，我国36％／ 38％浓度番茄酱出口价格已经达到 600美元／t(FoB)，28％／30％浓度的番茄酱出口价格达到 550美元／t(FoB)。 在国际市场上，几个主要番茄酱生产国之间依然存在价格差距，中国的产品有一定的价格优势，美国、土耳其 和欧il}l产品的价格则相对较高。 中国和美国的产品受汇率变化的影响要大于其他影响(如包装、运输和付款条件等)。中国番茄酱在意大利南 部(用于再加工)、俄罗斯和东南亚等市场的份额快速增长，并且逐步向中欧、中东和中亚等地扩展。 根据中国海关统计，2002年，我国出口番茄酱 37．3万 t，创汇1．89亿美元。2003年 1～8月，我国番茄酱出口 量为 16．58万 t，基本与去年持平。按照这一发展趋势，预计今年出口量与去年相比变化不大，或略低于2002年。 英国<食品新闻>最新报道，2003年全球番茄酱产量约为2 6O0万t，与已签之间存在 300万t的差量。 预测显示，欧洲最大的番茄酱产地意大利2003年的番茄产量将比预期减少 30％～40％。意大利北部主产区 ! 的新鲜番茄价格 已经由最初的87欧元／t上涨到了98欧元／t。世界另一大番茄主产 区美国加利福尼亚州2003年 的番茄产量将不足 1000万 t，至少比预期下降50万 t。美国番茄酱 2002年在欧洲市场的销量不错，但是欧洲买家 ： 近日表示，由于美国番茄酱价格较高，他们可能会减少采购量。 ； 、 H * H * H H * H ∞ H ●_日 _ _ _目 H ∞ H * H ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ 维普资讯 http://www.cqvip.com