肉品发酵剂葡萄球菌和微球菌的筛选

血 堕 — — — — — — — — ～ — — 一 肉品发酵剂葡萄球菌和微球菌的筛选 王永 霞 ， 牛天贵 郝华昆 1(河北工程学院食 品科学技术系 ，邯郸 ，057157) 2(中国农业大学食品科学与营养工稃学院 ，北京 ，100083) 摘 要 应用一种快速半定量平板方 法初 步筛选可作 为肉品发 酵剂的葡萄球菌和微球 菌。从 中 式传统肉制 品中分 离、纯化 了 100多株葡萄球 菌和微球菌，将菌株点种在加有 KNO3的琼脂平板， 据菌落周 围显示的红圈大小挑选 出硝酸盐还原酶活性较高 的菌株 ，同时具有 一定蛋 白酶和脂肪酶 活性的菌株进行发酵适应性试验。筛选 出 1株过氧化氢酶 阳性球菌，经初步 鉴定 为肉糖葡 萄球菌 s15。通过在模拟肉汤培养基 中和乳酸菌混合培养确定 了一种复配 P20+S15。将混合发酵剂 用于发 酵香肠的制作 ，测定微 生物和理 化指标，并 用仪器测定标准化部分感 官指标。 关键词 葡萄球菌 ，微球 菌，内品发酵剂 ，筛选，快速半定量平板 我国传统 肉制品中广泛存在着优 良的 自然 菌株 ，可以作为分离、筛选优良菌株的来源。关 于乳酸菌的筛选国内已有较多报道 ，但未见有 有关葡萄球菌和微球菌筛选方法的报道。鉴于 葡萄球菌和微球菌应用于发酵香肠的主要作用 是其硝酸盐还原酶活性，试验中设计了一种快 速平板半定量的方法，将菌株硝酸盐还原酶活 性作为筛选的首要条件，以减少以后筛选过程 菌株的数量。然后进行蛋白酶、脂肪酶活性检 测和发酵适应性试验。筛选得到的菌株经过复 配后，进行发酵香肠试验。测定微生物和理化 指标变化，并采用色差计和质构仪测定发酵香 肠色泽和质地变化，使部分感官指标的评价标 准化。为肉品发酵剂葡萄球菌和微球菌的筛选 提供一条思路。 l 和方法 1．1 材 料 1．1．1 菌 株 戊糖 片球 菌 (P．pentosaceus)P20、米酒 乳 杆 菌 (L．sake) J33 和 戊 糖 乳 杆 菌 (L．acidophilus)R17，以上菌种 由中国农业 大 学食品学院提供。 第 -fF者：硕士研究生(牛天贵教授为通汛作者) *国家“十五”科技攻关项 目(No．2001BA5D1A11)资助 收稿时间：2004—06—07，改回时问：2004 07—06 1．1．2 分 离样 品 不同地 区产 的腊 肉、腊肠 、金华 火腿等 20 多种样品。 1．1．3 培养基 (1)半定量硝酸盐还原酶快速检测培养基 ： MSA固体培养基 ，添 加 0．1％的 KNO ，121℃ 灭菌 15～20rain。 蛋白酶检测培 养基 ：以 MSA为 基础培 养 基 ，添加 2％的酪蛋白。 脂肪酶 检测培 养基 ：以 MSA 为基 础培 养 基，以 0．04％溴 甲酚紫为指示剂。取猪油和 2％聚乙烯醇以 1：3比例混合，10 000 r／min搅 拌乳化 5 min，高压灭菌后取 12 mL加入上述 100mL培养基 。 1．2 方 法 1．2．1 菌种分离 以无菌操作取 20 g样品，匀浆后加入 180 mL无菌蛋白胨水(蛋白胨 1 g／L，NaC1 0．85g／ L，吐温 80 1 mL／L)中，振荡均匀，吸取上清液 作系列稀释，倾注 MSA平板，30"C培养 2d，挑 取单菌落 ，以平板划线纯化 。纯菌进行革 兰氏 染色、细胞形 态和触 酶反应检验 。触 酶阳性 和 革兰氏阳性球菌保存并作进一步检验。 (5) 维普资讯 http://www.cqvip.com 麓 1．2．2 菌株 筛选 1．2．2．1 发酵特性试验 (1)琼脂平板检验硝酸盐还原酶括性 将培养 2 d的斜面菌种用牙签点在半定量 硝酸盐还原酶检测平板上 ，30℃培养 ，8 h取 出， 向平板倾倒 1：1的溶液 A和溶液 B(Griess试 剂)。1 min后倾倒出多余的溶液，观察菌落周 围出现的红 圈大小 。 (2)蛋白酶和脂肪酶测定 将在 MSA培养基上培养 2 d的葡萄球菌 和微球菌以点种法接在蛋 白酶和脂肪酶检测培 养基上，30℃培养 2 d，取出观察。蛋白酶检测 ： 在菌落周围滴加 10％的三氯乙酸，观察菌落周 围的透明圈。脂肪酶检测：观察菌落周围黄色 圈。 1．2．2．2 发酵适应性试验 采用 MSA作为基础培养基，筛选条件 ：不 产粘液，15℃具有硝酸盐还原能力，发酵葡萄糖 不产气，不产 H，S，不具有氨基酸脱羧酶，不产 氨 ，耐酸(pH4．5)，凝 固酶反应阴性 。 1．2．3 菌株初步鉴定(见图 1) 过氧化氢酶阳性球菌 I IR 呋喃唑酮、溶葡萄球菌素 I S 薇球菌 葡萄球 I 广 产酸自 (葡萄 I 一I 糖 、甘油 、甘露 除 凝固酶i 糖)精氨酸 、七 I 叶灵水解 产酸 自(纤维I 菌 反应 二糖 、 麦芽糖 、甘露糖 、棉 籽糖 、蔗糖、木糖) 图 1 过氧化氢酶 阳性球菌鉴定 注：S一敏感；R一不敏感；+一阳性反应 ；一一阴性反应 ． 1．2．4 混合培养相互关系的研究 将 3株乳酸菌和葡萄球菌分别在 MRS和 MSA液体培养基中活化 2次，在模拟肉汤培养 基中混合培养，菌种接人量均为 10 个／mL。 每 12h测定 pH及乳酸菌和葡萄球菌数，选择 没有拮抗关系的复配方案 。 1．2．5 发酵香肠制作工艺 1．2．5．1 制作工艺 (6) 配方 ：瘦 肉 80％，肥 肉 20％。其他调料按 肉的质量添加 ，盐 2．5％，蔗糖 0．5％，葡 萄糖 0．5％，NaNO，0．015％，KNO 0．01％，抗坏血 酸 0．05％。 工艺流程：切肉 一 斩拌 一 加入腌制剂和 发 酵 剂 一 灌 肠 一 发 酵 (22℃ ，RH90％ ～ 95％，3 d)一 成熟(15℃ ，RH70％～80％)。 1．2．5．2 实验处理 实验分为 2组，分别以对照 CK和 P20+ S15表示 ，添加发酵剂组 菌种接人量 为 10 cfu／ g。加工后 1、3、7、14和 28 d后取样测定。 1．2．5．3 测定项 目及方法 (1)微生物指标 乳酸菌数：MRS培养基，30℃ 2 d； 葡萄球菌数 ：MSA培养基，30℃ 2d。 (2)理化指标 pH：取样 品 10 g，切碎 加 90 mL 0．85％生 理盐水在研钵 内研碎 ，置于 250mL三角瓶中放 人 5℃冰箱 20 min，摇匀过滤后取上清液用 pH 计测定 。Aw：参 照 GB 9695．12—88。质构 分 析(TPA)：用切片刀将样 品切成 (1 X 1 X 1)cm 的立方体；“T”型金属压头连在材料仪上 ，压头 直径 41 mm；压缩 比 50％；测 定速度 ：50 mm／ min；2次循环 。测定项 目：硬度 Hardness(g)； 胶 粘 性 Gumminess(g)；咀 嚼 性 Chewiness (gram)；粘结性 Cohesiveness。色泽测定：在样 品新鲜切面上覆盖聚乙烯薄膜压平，用色差计 分析，样品的明度值(L)、红度值(a)。 1．3 主要仪器和设备 恒温培养箱，山东潍坊医疗器械厂；PHS一 25型 pH计，上海精科雷磁；722分光光度计， 上海精密仪器有限公司；绞肉机、斩拌机、搅拌 机 、灌肠机 ：德 国 mainca公 司；wSC—S测色色 差计：上海精密科学仪器有限公司物理光学仪 器厂；QTS一25质构仪：英国 Stevens公司。 2 结果与分析 2．1 菌种分离 采用 MSA培 养基 ，从 20多样品 中分 离、 纯化革兰氏阳性和触酶阳性球菌 158株。 维普资讯 http://www.cqvip.com 2．2 菌株的筛选 采用半定量硝酸盐琼脂平板方法，筛选出 32株红圈较大(直径 >12mm)的菌株。然后用 点种法 测定这 32株 菌蛋 白酶 和脂肪酶 活性。 对具有蛋 白酶和脂肪酶活性的 12株菌 ，进行发 酵适应性试验，进一步筛选得到 1株过氧化氢 酶阳性球菌 S15。 表 1 S15的基本情况 性质 S15 来源 菌体形态特征 菌落颜色 过氧化氢酶 硝酸盐还原酶活性(15℃ ) 粘液 }{2()2酶 产气 产氨 产 H2S 氨基酸脱羧酶 蛋 白酶 脂肪酶 耐酸性(PH5．0) 凝固酶反应 金华火腿 球形，直径约 1 m 白色 注：反应圈直径—— 菌落直径 FIIFII；-y．* -y．，7～10mm。 2．3 菌株初步鉴定 表 2 S15的生理生化特征 标注同图 1。 蚤 己 U 竽 ： 翘 查阅细菌鉴定手册，初步鉴定 S15为肉糖 葡萄球菌。 2．4 乳酸菌和葡萄球菌的混合培养 通过在模拟肉汤培养基中共培养相互关系 的研究 ，得到一种复配方案。 — ● P20 —_．一 S15—-广-pH 时间／h 图 2 模拟 肉汤培养基中乳酸菌和 葡萄球菌混合培养 的相互关系 图 2表明，乳酸菌和葡萄球菌混合培养时， 乳酸菌数逐渐增加，24 h达到峰值，培养期间基 本保持稳定。pH培养 24 h内下降速度最快， 之后呈缓慢下降趋势。葡萄球菌数培养初期 (24 h)逐渐增加，随后，开始有稍微的降低，但 始终保持菌数 10 cfu／mL左右。说明 2株菌 没有拮抗关系 ，可以用于发酵香肠的生产 。 2．5 发酵香肠的制作 图 3表明 ，对照组乳酸菌数从发酵 1～28 d 一 直极显著低于 P20+S15组。总的变化趋势 是，发酵和成熟初期，乳酸菌数逐渐增加，其后 乳酸菌数缓慢的下降。P20+S15组第 3天，达 到最高值，菌数为 8．952(1og】0cfu／g)。加工后 期 ，乳酸菌数有所下降，但仍保持在 107以上， 发酵结束后菌数为 7．549(1og10cfu )。对照组 第 3天和加工结束后分别为 5．729和 6．230 (1og】0cfu／g) 苟 ： 蝰 酱 滞 淀 图 3 发酵香肠乳酸菌和葡萄球菌的生长情况 (7) 维普资讯 http://www.cqvip.com 碍麓 6 5 ^1 一 一 ‘ 工 5．3 Iq 4．5 1(H) ()％ ()．92 ≥ 《 ()88 (1． 08() 0 10 15 20 25 0 5 1() 15 20 25 30 时IbJ／d 时l~l／d 图 4 发酵香肠 pH和 Aw的变化 葡萄球菌数 P20+S15组始终极显著高于 对照。发酵和成熟期间呈缓慢 的下降趋势 ，发 酵结束后，菌数为 6．748(1og10cfu／g)，对照组为 4．35I(1og10cfu／g)。 由图 4可知，发酵和成熟期间，对照组 pH 值始终极显著高于 P20+S15组。P20+S15组 3 d内 pH值下降迅速，第 3天达到最低值 ，而 后，开始有所回升。发酵 3 d后，pH值 由最初 的6．i0下降到最低值 4．60，发酵结束后，pH 0 5 I() I 2O 25 30 时l'H]／d 为 4．85。而对照组发酵 3 d和加工结束后分别 为 5．42和 5．22。 发酵期间水分活度逐渐降低 ，最初 3 d内， 由于生产环境相对湿度较高(90％～95％)，脱 水速度较慢；干燥期间，由于 pH的降低 ，以及 较低的相对湿度(70％～80％)，Aw开始大幅 度下降。P20+S15组发酵结束后，水分活度为 0．814，而对 照组 为 0．874，极 显 著高于 P20+ S15组 18 16 萼 l4 12 10 () 5 10 15 20 25 30 时IN／d 图 5 发酵香肠明度值(L值)和红度值(n值)的变化 从图 5可以看出，色泽总的变化趋势是：7 和对照组的峰值及下降幅度有明显差异。发酵 d内，发酵香肠的明度值 (L值)和红度值 (n 3 d时，明度值和红度值表现出极显著差异，并 值)逐渐上升，并在第 7天，达到峰值 ，随后，明 且 P20+S15组达到峰值后，基本保持此水平。 度值和红度值均呈现下降趋势。P20+S15组 此结果与目视结果一致。 表 3 发酵香肠 的质构分析 (8) 维普资讯 http://www.cqvip.com 赣 表 3表明，香肠在发酵和成熟过程中，硬 度 、胶粘性和咀嚼性逐渐增加 ，这是 由于乳酸菌 的发酵作用，导致 pH的降低，蛋白质变性，肉 蛋白质的变性和凝固降低了持水力 ，从而使香 肠的结构越来越致密。发酵香肠的粘结性起初 随着香肠的成熟逐渐增加，而后，又显示出下降 趋势。这是 由于原料 肉馅 的物 理结 合较 为松 散 ，随着水分 的散失 ，肉馅结合逐渐紧密 ，弹性 和粘结性就会 有所增加 ，但 随着脱水过程 的进 一 步进行，香肠的脆性增大，弹性和粘结性又会 逐渐下降。表 3表明，P20+S15组和对照组发 酵 3 d后 ，硬度和咀嚼性 即表现出明显的差异。 表 4 发酵香肠的感 官评价 3 讨 论 (1)本试验将硝酸盐还原酶活性作为第一 筛选标准，将新鲜斜面培养物点种在 KNO 琼 脂平板上，通过实验确定培养最佳时间为 8h。 培养时间过长 ，倾倒 Griess试 剂后 整个 平板 成 为红色，影响观察结果和点种的数量。而且 由 于硝酸盐还原酶是厌氧性诱导酶，把菌种点在 琼脂平板上可以避免直接接触氧气，造成一种 厌氧环境，有利于菌种产生较高的酶活。因此 该方法可以简单快速地反应硝酸盐还原酶活性 的大小 。 将硝酸盐还原酶活性较高，同时具有蛋白 酶和脂肪酶活性的菌株进行发酵适应性的试 验。这种筛选方法大大减少了繁杂的工作量， 且保证菌株具有较好的发酵特性 。本实验筛选 得到的肉糖葡萄球菌 S15具有良好的发酵特性 和发酵适应性。 (2)乳酸菌和葡萄球菌在共培养过程中，由 于某些乳酸菌的产酸抑制和代谢产物抑制，可 能会影响葡萄球菌的正常生长。本实验 P20+ S15组中，葡萄球菌并没有被抑制，而是逐渐增 加，并在培养期间保持较高菌数，说明两者之间 无拮抗作用 ，可 以作为混合发酵剂用 于发酵香 肠的生产 。 (3)发酵剂 的添加对发酵香肠微生 物和理 化指标产生较大的影响，发酵期间，P20+S15 组乳酸菌数和葡萄球菌数均显著高于对照组。 乳酸菌和葡萄球菌数发酵 3 d后，达到最高值， 成熟后期，由于低 pH和低 Aw使菌数有所下 降，但仍然可以保持较高的菌数。 由于乳酸菌 的产 酸作用 ，P20+S15组 pH 和Aw显著低于对照组，低 pH和低水分活度 对发酵香肠 的稳定性很重要。P20+S15组 pH 下降迅速 ，发酵 3 d后 ，达到 4．60，完全可 以抑 制如金黄色葡萄球菌等腐败菌的生长。并且， 由于低 pH导致 蛋 白质 的变性 ，有利 于发 酵香 肠的干燥，从而使发酵香肠具有较好的质构。 试验采用色差计和质构仪测定分析发酵香 肠发酵过程中色泽和质地的变化 ，为发酵香肠 色泽和质地品质指标的标准化以及优良发酵剂 的筛选提供了进一步的物性学方面的依据。由 于葡萄球菌 的硝酸盐还原酶和过氧化氢酶的作 用，P20+S15组明度值和红度值在整个发酵和 成熟过程中都极显著高于对照。仪器测定结果 与感官评价结果一致。 总的来说 ，通过对发酵香肠发酵和成熟过 程 中理化 和微生物变化 、色泽 和质地变化 的测 定和分析，结合感官评价，P20+S15有可能作 为混合发酵剂用于发酵香肠的生产 ，有关其他 特性有待进一步测定。 参 考 文 献 1 Miralles M C，Flores J，Perez—Mareinez G．Biochemi— cal tests for the selection of Staph OCOCCUS strains as potential meat starter cultures[J]．Food Microbiolo— gY，1996，13：227～236 2 Coppo la R．Lorizzo M ． Characterization of microc occi and staphylococci isolated from soppressate molisana，a Southern Italy fermented sausage[J]．Food Microbiol— ogy，1997，14：47～ 53 3 Papamanoli E，Kotzekidou P．Characterization of Mi— crococcaceae isolated from dry fermented sausage[J]． (9) 维普资讯 http://www.cqvip.com Food Microbiology．2002，19：441～449 4 东 秀珠 ，蔡 妙英 ．常 见细 菌系统 鉴定 手册 [M]．北 京 ：科学出版社 ，2001．2 5 李里特．食 品物性 学[M]．北京 ：中国农业 出版社 ， 2001．6 6 张元生．微生物在肉类加工中的应用 [M]．北京 ：中 国商业出版社 ，1991 Selection of Staphylococci and M icrococci as M eat Starter Cultures W ang Yongxia ’ Niu Tiangui Hao Huakun 1(Department of Food Science and Technology，Hebei Engineering College，Handan，057 1 50) 2(College of Food Science and Engineering，China Agriculture University，Beijing，1 00083) ABSTRACT A fast semi—quantitative plate assay has been applied to select staphylococci and micro— cocci with Dossible value as meat sarter cultures．One hundreds of strains have been isolated and purifi— cated from Chinese traditional meat products．AIl strains have stabbed with match—stick into KNO3一 containing agar plates．Colonies showing very high nitrate reduction properties that suggested by the size of surrounding red halos were selected．The proteolytic and lipolytic activities of the selected colonies were tested．According to fermentation adaptation，one catalase—positive cocci was selected and identified as Staphylococcus carnosus S15．Meat mixed starter culture P20+S15 without counterac— tion were selected on simulative broth medium．Changes of Physico—Chemical and M icrobial properties were measured and analyzed．Changes of color and texture were measured with instrumental measure— m ent． Key words staphylococci and micrococci，meat sarter cultures，selection，fast semiquantitative plate 欢迎订阅 2005年《食 品开 发 》 《食 品开发》是一份全 国性食 品行 业科技和 信息类综合杂 志。 由食 品界元老秦含章 先生题 写刊名。 《食 品开发》侧 重食 品开发 理论 和应用 、国 内外食 品行业新理 念 、新科 技 、新 动态 类文章。 辅以行业纵览、本刊视 点、市场研 究、营销策略 、 海外 潮流 和信 息 总 汇等 。是 食 品资讯 开 发、食 品科技开发 、食 品行业的指导性刊物。 《食 品开发》信 息 量 大 、涉及 面 宽、读 者群 广 、影响力强。每年参加 20余个行业重 点展 览 会，已成为 国内外食 品原辅材 料、食 品机械设备 厂商和食品生产企业等宣传产品及传递信息的 理想窗 口。 《食 品开 发》还 为食 品企 业界 提 供 整 合 策 划、新品开发 、认证咨询 、企 业 内训、设计 印刷 等 服务。 欢迎认 阅 诚征广告 恳请赐稿 地址 ：上 海市 闸北京 区恒丰 北路 108弄 灵 广大 厦 2号 802室(200070) 电话 ：021—56533893 传真：021—56533891 E—mail：foodnews@shl63．net WWW．cnfoodnews．com (10) 维普资讯 http://www.cqvip.com