嗜碱性芽孢杆菌产高碱碱性蛋白酶发酵培养基及发酵条件的研究

垄 嗜碱性芽孢杆菌产高碱碱性蛋白酶发酵 培养基及发酵条件的研究 苑 琳 戚 薇 路福平 杜连祥 (天津科技大学食品科学与生物工程学院应用微生物教研室 ，天津 ，300222) 摘 要 对一株高产高碱碱性蛋 白酶的嗜碱性芽孢杆菌的发酵培养基及发酵工艺进行 了优化。 确定 了发酵培养基所采用的棉籽饼粉最适粒度为 80目，麦芽糊精的最佳 DE值为 30％。并确定 了该菌株的最适发酵培养基配方为(g／100mL)：棉籽饼粉 3，酵母浸粉 1．75，麦芽糊精 10，柠檬酸 钠 0．3，CaCI2 0．3。K2HPo4 1；最适摇瓶发酵条件为：种龄 12h，接种量2％，装液量 50mL／250mL， 摇床转速 200 r hnin，34℃，发酵 54 h，碱性蛋 白酶 的发酵单位可达 33 985 u L，比优化前提高 了 54．48％。此外，还进行 了5 L罐放大 实验，在 5 L罐所确定 的最适工 艺条 件下，发酵单位 可达 36 579u／mL。 关键词 碱性蛋白酶，嗜碱性芽孢杆菌 碱性蛋白酶是指在碱性条件下水解蛋白质 肽键的酶类，主要应用于生产加酶洗涤剂 J¨， 另外，在制革、丝绸、医药、食品、饲料和生物化 学试剂等领域也有应用。我国在 20世纪 70年 代初期就成功开发了碱性蛋白酶，并实现了工 业化生产 2¨ J。目前，我国用于生产的菌种为国 内学者 自行筛选诱变的菌株——地衣芽孢杆菌 2709，其发酵单位在 10 000 u／mL，与国外先进 水平相差甚远。本实验所采用的高产高碱碱性 蛋白酶菌株为嗜碱性芽孢杆菌，其实验发酵单 位为 22000 u／mL，与国外大型酶制剂公司所报 道的生产水平 30 000 u／mL相差较大。本实验 对该菌株的发酵培养基及发酵工艺进行 了优 化，从而使其发酵单位达到了 30 000 u／mL以 上，达到国内外领先水平，为其工业化生产奠定 了基础，具有很大的开发价值。 1 材料与方法 1．1 菌 株 嗜碱性芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)。 1．2 试剂及仪器 干酪素中国医药(集团)上海化学试剂公 司；麦芽糊精山东省菏泽市都庆股份有限公司； 第 一作者 ：硕士研究 生。 收稿时间 ：2003—10—22，改 回时间 ：2004—01—07 (32) 棉籽饼粉河北；其余试剂均为国产纯及生 化试剂。MP220型 pH计，722分光光度计 ，恒 温水浴锅，GL20A型高速冷冻离心机，LD5—10 离心机 。 1．3 培养基 ①平板培养基：酪素培养基 3¨ J。②种子培 养基：肉汤培养基[ 。③初始发酵培养基(g／ 100 mL)：棉籽饼粉 2，酵母浸粉 1，麦芽糊精 (DE≥47％)10，柠 檬 酸钠 0．3，CaC12 0．3， K2HPO4 1。 1．4 菌种的培养 ①将酪素平板上形成透明圈、生长正常的 单菌落转接于装有 30 mL种子培养基的 250 mL三角瓶中，34℃，200 r／min，摇床振荡培养 12 h。②以2％的接种量将种子培养液转接于 装有 30 mL发酵培养基的 250 mL三角瓶中， 34℃ ，200 r／min，摇床振荡培养 54 h。③将发酵 液8000 r／min离心 10min，上清液即为粗酶液。 1．5 酶活力的测定 按 Folin试剂显色法 4¨ J在 pH11、40℃下测 定酶活力，将该条件下每分钟水解酪素产生 1 g酪氨酸所需的酶量定义为一个活力单位。 1．6 菌体核酸量的测定 维普资讯 http://www.cqvip.com 该实验所采用的发酵培养基中含有棉籽饼 粉，杂质较多，故采用菌体内核酸量示其菌体 量。核酸量的测定方法如下：①取 2 mL发酵液 加 8 mL蒸馏水，混匀 ，3 000 r／min离心 15 min； ②弃上清 ，在沉淀 中加冷 的 10％三氯乙酸 2 mL，振荡，冰水浴中放置2～3min，30000 r／min 离心 15min；③弃上清，沉淀中加冷的 5％三氯 乙酸 2 mL，混匀，沸水浴中加热 30 min，冷却后 离心 ，3 000 r／min×15 min；④取 上清 0．1 mL， 加4．9mL蒸馏水，混匀后，在紫外分光光度计 上测 260 nm处吸收值 A。菌体核酸量(g／L)= A ×1．72 1．7 总糖的测定 参见文献[5]。 2 结果与分析 2．1 培养基组成成分对产酶的影响 2．1．1 棉籽饼粉的浓度及其粒度对产酶的影 响 实验选用河北产棉籽饼粉(100目)，在培 养基中分别添加不同浓度的棉籽饼粉，其结果 如图 1。 藿 26(xx1 25(xx1 24(xx1 23(xx1 22000 2l O(x) 20(xx1 2．0 2．5 3．0 3．5 棉耔饼粉质量浓度 ，％ 图 1 棉籽饼粉浓度对产酶的影响 可以看到，增加棉籽饼粉的浓度至 3％时 粗酶液中酶活力最高，继续增加其浓度，酶产量 没有增加反而降低。此外，实验中还对棉籽饼粉 的粒度对产酶的影响进行了研究，结果如图2。 藿 26 500 26(X砷 25 500 25O00 24 S00 24000 23 500 23000 22 500 60 80 100 粒度，目 图 2 棉籽饼粉粒度对产酶 的影响 可见，棉籽饼粉越细越利于产酶，同时也 可以看到，80目的棉籽饼粉与 100目的差别不 大，因此，从生产成本考虑决定采用 80目的棉 籽饼粉 。 2．1．2 酵母 浸粉浓度对产酶的影响 实验在培养基 中添加不同浓度 的酵母浸 粉，其结果见图 3。 30O00 29O00 28O00 27(Xx】 26(】(X) 25O00 24O00 图 3 酵母 浸粉浓度对 产酶 的影 响 可见，增加酵母浸粉的浓度可以提高菌株 的产酶量。当酵母浸粉浓度为 1．75％时其粗 酶液中酶活力最高，继续增加至 2％时，酶产量 不再增加反而降低。 2．1．3 不同DE值的麦芽糊精对产酶的影响 本实验以麦芽糊精为发酵培养基的主要碳 源，对山东省菏泽市都庆股份有限公司产的 5 种不同 DE值的麦芽糊精及北京奥博星生物技 术责任有限公司生产的糊精分别进行了发酵试 验 ，其加入量均为 10％，产酶情况如图4所示。 ， 35000 30000 25000 蠢 藿 0 5(xx1 000 0 }圈圈圉圈圈圈 l5 3O 35 47 53 糊精 DE值 图 4 不同 DE值麦芽糊精及糊精 对产酶的影响 由图4看出，以DE值为 30％的麦芽糊精 为碳源，发酵后的粗酶液酶活力最高，可达 31 752u／mL。同时可以看到，麦芽糊精的 DE值 越高越不利于产酶，说明该菌株可能存在分解 代谢阻遏现象。 2．1．4 最佳发酵培养基的确定 在确定了发酵培养基主要氮源棉籽饼粉的 粒度为 80目、主要碳源麦芽糊精的 DE值为 30％的基础上，采用单因素实验法对发酵培养 基进行了优化，确定 了该菌株的最适发酵培养 基组成为(g／100 mL)：棉籽饼粉 3，酵母浸粉 (33) 维普资讯 http://www.cqvip.com 维普资讯 http://www.cqvip.com 菌体核酸量 、粗酶液中酶活力及发酵液中总糖 进行了测定，所绘发酵曲线如图 10所示。5 L 罐发酵单位最高可达 36 579 u／mL。 2fl 1．6 、 1 2 a 04 0 l 5 l0 15 2f)25 3fl 35 40 45 54 时间，h 图 10 5L罐发酵过程曲线 3 讨 论 本实验对一株高碱碱性蛋白酶高产菌株的 发酵条件进行了优化，并在摇瓶优化的基础上 进行了5 L罐的放大实验，最终使其发酵单位 达到 36 579 u／mL。该生产水平已达到国际大 型酶制剂公司所报道的水平，为其工业化生产 奠定 了基础 。 参 考 文 献 1 华章熙，徐 清 ．洗涤剂酶应用手册[M]．北京：中 国轻工业出版社，1999．39 2 薛林贵 ．我国碱性蛋 白酶的应用及研究进展[J]． 微生物学通报，1997，24(6)：370～371 3 杜连祥 ．工业微生物学实验技术[M]．天津 ：天津 科学技术出版社 ，1992，274 4 王福荣 ．工业发酵分析[M]．北京：中国轻工业出 版社 ，1997，90～92 5 蔡定域 ．酿酒工业分析手册[M]．北京 ：轻工业 出版 社 ，1988，293 The Study on the M edium and Conditions of Bacillus alcalophilus Producing the High Aikaline Protease Yuan Lin Qi W ei Lu Fuping Du Lianxiang Cai Xingwang (Department of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin，300222) ABSTRACT The fermentation medium and conditions of Bacillus alcalophilus，which produces high—yield alkaline protease，were studied in this paper．The optimum granularity of cotton seed meal was 80mu and the optimum DE of maltrin was 30％ ．The highest enzyme activity was obtained using 50 mL of culture medium in 250 mL shake flasks at 34℃ and 200 r／min for 54h．The fermentation mediun consisted of(per 100 mL)：3g cotton seed meal，1．75g yeast extract，10g maltrin，0．3g NaCi— trate，0．3g CaC12，lg K2HPO4．The optimal inoculum volume was 2％(v／v)．Under optimal condi— tions，the yield of alkaline protease is 33 985u／mL，which is 54．48％ higher than that of before．The experiment was also carried out in a 5 L fermentor．Under the optimal conditions，the alkaline protease activity reached 36 579 u／mL in the 5 L fermentor． Key words alkaline protease，Bacillus alcalophilus 0 圉『本啤酒包装的爱他 ． 羹’ 13本啤酒消费量近年来每年都在70亿升以上，2000年为71．3亿 L，2001年为71．8亿 L，略增了0． ： 霄 3％，其中啤酒49亿L，发泡酒22．3亿 L。从包装看，日本啤酒主要分为玻璃瓶、金属罐和大桶等3大类包 装物。玻璃瓶 曾长期在 日本啤酒包装市场上 占有统治地位，直到 1993年玻璃瓶装啤酒仍然占一半以上， 但此后则逐年明显下降，由 1993年的50％分别下降为 1995年的43％、1997年的 37％和 1999年 的35％，2000年 降为 32％，2001年为31．9％。而金属听装啤酒的比例在同期内则由 1993年的41％分别上升为1995年的45．3％、 1996年的47．5％、1997年的48．7％和 1999年的47．1％，2000年为47．9％，2001年下降为45．1％。大木桶等桶装 啤酒比例也有所上升，1993年为8．7％，1995年、1997年和 1999年分别上升为 11．8％、14．4％和 17．9％，2000年 为 19．7％，占日本啤酒总消费量的20％，2001年上升为 23％。在日本啤酒的各种包装物中，金属罐所 占比例变化 不大，而且近年来还略有上升(但 2001年有所下降)。玻璃瓶则明显下降，而大桶包装又重新大幅上升，后者增加 的部分刚好是前者减少的部分，这说明大木桶装啤酒在 日本市场上的销量不断增长。 (35) I三Ⅲ 5 0 l11山l 一J(至 、蛙避 ．． fr 星一 、舞蹬 维普资讯 http://www.cqvip.com