α-转移葡萄糖苷酶的纯化及酶学特性研究

婆墼 ————————————— ———一 ．】【．转移葡萄糖苷酶的纯化及酶学特性研究 毕金峰 李春红 陈天金 1(中国农科院农产品加工研究所，北京，100094) 2(西北农林科技大学食品科学与工程学院，杨凌，712100) 摘 要 a一转移葡萄糖苷酶是生产低聚异麦芽糖的关键酶。文中探讨了一种黑曲霉所产a一转移葡 萄糖苷酶粗酶的分离提纯方法，并研究了纯酶的部分酶学特性。该酶可用葡聚糖凝胶G一200柱层 析法分离，粗酶液含有多种杂蛋白，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定纯酶的分子质量为130ku。 该酶既有水解特性，又有较强的转移能力。 关键词 a一转移葡萄糖苷酶，纯化，特性 a一转移葡萄糖苷酶 (a—transglucosidase E．C．2．4．1．24)又称 a一葡萄糖苷酶(a—glucosi— dase E．C．3．2．1．20)，它可以从低聚糖类底物 的非还原性末端切开 a一1，4糖苷键，释放出葡 萄糖，或将游离出的葡萄糖残基以a一1，6糖苷 键转移到另一个糖类底物上，从而得到非发酵 性的低聚异麦芽糖(以下简称 IMO，主要包括 异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖等)、糖脂或糖肽 等。它作为工业化生产 IMO的关键酶制剂倍 受国内外食品工业界的重视u-4]。目前，国外 生产的a一转移葡萄糖苷酶大部分为纯酶，国内 研究主要以粗酶液为主 J。文中在选育了 高产a一转移葡萄糖苷酶菌株的基础上，探讨 a一 转移葡萄糖苷酶粗酶的分离提纯工艺，研究纯 酶的部分酶学特性，为其国产化提供理论依据。 1 材料与方法 1．1 材 料 1．1．1 酶制剂 a一转移葡萄糖苷酶粗酶液：为试验室所选 育的高产a一转移葡萄糖苷酶黑曲霉菌株在最佳 培养条件下生长、最适条件下制取的酶液。 1．1．2 Sephadex G一200 B10903 Pharmacia Sino-American Biotec。 1．1．3 标准蛋白 次高分子质量标准蛋白质(43～200 ku)和 低分子量标准蛋白质(14．4～97．4 ku)，上海丽 第一作者：博士后，副教授。 收稿时间：2004—03—15，改回时间：2004—04—15 (60) 珠东风生物技术有限公司。 1．1．4 聚乙二醇(Polyethylene glyco1)--4000、 6000 天津天泰精细化学品有限公司。 1．1．5 纯品麦芽糖 上海生工生物工程有限公司，AMRESCo 分装。 1．2 试验方法和仪器 1．2．1 相对酶活测定方法 国际酶学委员会规定：在一定条件下(pH 值、温度、离子强度等)，1 min内将1／．tg分子的 底物转化为产物的酶量定为 1个国际单位 (I．U．)。本试验中用直接滴定法测定 a一转移 葡萄糖苷酶作用于一定浓度的底物(麦芽糖)生 成产物还原糖的量，用消耗反应液体积来间接 反映a一转移葡萄糖苷酶的酶活，即相对酶活。 通过试验证明，用直接滴定法测还原糖所消耗 的酶反应液体积来反映酶活与高效液相色谱法 定量测定结果趋势一致，可以说明，消耗的反应 液体积越多，反应液中还原糖含量越低，则在单 位时间内a一转移葡萄糖苷酶水解底物(麦芽糖) 的能力越差，即相对酶活越低；反之相对酶活越 高。 1．2．2 纸层析法 点样量为1．5肚L。展开剂为 V(正丁醇)： v(吡啶)：v(水)=6：4：3；层析条件：室温下上 行展开12～15 h，风干后再展开一次；显色条件 维普资讯 http://www.cqvip.com 为70～80℃烘箱中烘烤5～10 min。 1．2．3 电泳测定酶蛋白分子质量 采用SDS-聚丙烯酰胺(PAGE)电泳。 1．2．4 层析胶处理及装柱 称取一定量的Sephadex G一200，加入其质 量20～30倍的缓冲液(内含0．025mol／L Tris— HCL，0．2 mol／L MgC12，0．0005mol／L EDTA) 或蒸馏水室温浸泡48h，装柱(柱规格为 1．5 cm ×30 cm)。 1．2．5 仪 器 高速冷冻离心机(himac CR21G，日本)。柱 层析仪(MB99—3型，豪华配置一套，上海沪西 仪器厂)。电泳仪(北京六一厂)。高效液 相色谱仪(Waters公司600E，美国)。 2 结果与分析 2．1 缸．转移葡萄糖苷酶的浓缩与纯化 2．1．1 硫酸铵盐析法浓缩 取 10 mL a一转移葡萄糖苷酶粗酶液，查 (NH4)2SO 饱和度常用，配制不同饱和度的 (NH4)2SO4酶溶液，混匀后于冰箱中静置12h。 将沉淀后的反应液于冷冻离心机中4℃离心15 min(10 000 r／min)，分离沉淀与上清液。用 1 mL pH 5．4的HAC—NaAC缓冲液溶解沉淀作 为酶液1，取1 mL上清液混匀作为酶液2，按相 对酶活测定方法测定相对酶活，结果见图 1。 随着硫酸铵饱和度的增加，上清液的相对酶活 逐渐降低，而其沉淀的相对酶活逐渐升高。粗 酶液在70％硫酸铵饱和度时沉淀出大部分a一 转移葡萄糖苷酶，此时相对酶活迅速升高。后 期沉淀酶液的相对酶活差别不大，而上清液中 相对酶活降至最低。说明可以通过这种方法进 20 ． -1 18 之 16 塞l4 搬 l2 耀 1() 8 图 1 不同处理的相对酶活曲线 行该酶的浓缩与纯化。 将用硫酸铵浓缩 10倍的酶液，装入处理好 的透析袋中，透析24 h，至透析液用 10％BaC1， 滴定无沉淀生成为止，测定透析酶液(浓缩酶)、 未浓缩酶液(原酶)相对酶活，同时设 1 mL水代 替酶液进行反应的对照(CK)，结果见图2。说 明经透析的浓缩酶液酶活明显提高，透析浓缩 效果明显。 原酶 浓缩酶 冷丙酮沉淀 取粗酶液若干份，用不同体积的冷无水乙 醇、冷丙酮沉淀。可见冷丙酮和冷乙醇中均有 沉淀产生，加10mL的比加5mL的沉淀多。将 沉淀后的酶液迅速冷冻离心，去上清液，用缓冲 液溶解沉淀作为初始待测酶液，测定相对酶活， 对照(CK)为1 mL蒸馏水代替初始酶液进行反 应的处理，结果见图3。可知冷丙酮、冷无水乙 醇沉淀的酶仍有一定活性，加入 10 mL有机溶 剂比加入5mL的好。采用有机溶剂沉淀法时， 尽量缩短沉淀时间，防止酶变性。 {20 F 蓁： [ ． 蒌 ． ． ． 除上述2种方法外，本试验中也采用聚乙 二醇一4000、6000进行酶的浓缩，浓缩 10～12 h 即可，浓缩效果好，酶活损失少，易操作。采用 等电点沉淀法分离浓缩酶试验时，发现沉淀效 果不明显，沉淀酶容易变性，酶活明显降低。2 方法在此不详述。 (61) 维普资讯 http://www.cqvip.com 采用葡聚糖(Sephadex G一200)凝胶层析柱 分离提纯粗酶液。流速为0．5 mL／min，绘制洗 脱曲线，结果见图4。收集不同峰的洗脱液，测 定相对酶活，同时做CK (粗酶反应液)，收集不 同峰的洗脱液，测定相对酶活，同时做 CK (粗 酶反应液)、CK2(蒸馏水代替粗酶的反应液)， 结果见表 1。 ll 2() 4() l l IIM)120 1401 ll l 2(M)22() 体积，mL 图4 Sephadex G一200柱层析洗脱曲线 表 1 不同峰收集液的相对酶活 峰号 13．22 17．50 17．53 11．23 17．50 耗糖体积／mL 由图4和表 1可见，粗酶液具有 a一转移葡 萄糖酶苷酶活性的蛋白均出现在1号峰，2号、 3号峰蛋白不具有该酶的活性。该酶反应液纸 层析结果见图5，再次证明只有 1号峰的酶液 具有水解麦芽糖和转移葡萄糖的能力。 葡萄糖———— 麦芽糖—— 麦芽三糖——’ 潘糖— 注 ：左右两图为重复样 ，CK为麦芽糖样品，1、2、 3、4为收集峰号。 图5 不同峰收集液反应纸色谱 2．2 n．转移葡萄糖苷酶特性的研究 2．2．1 粗酶电泳分析 吸取粗酶液、商品a一转移葡萄糖苷酶酶液， 做变性和非变性处理，进行SDS一聚丙烯酰铵凝 胶(SDS—PAGE)电泳，结果见图6。可知商品a一 转移葡萄糖苷酶较纯，通过变性电泳结果可知， 该酶蛋白由4个亚基组成。a一转移葡萄糖苷酶 粗酶含有较多杂蛋白，但含有与商品酶蛋白分 子质量一致的蛋白质。 2．2．2 纯酶分子量测定 将经过柱层析提纯的酶液按峰浓缩后，电泳 结果见图7。可见纯酶呈现一个谱带，对照标样， 计算尺 值，确定该酶的分子质量为130 ku。 注：左右2张分别为7．5％胶和 10％胶的电泳图。1、2、3、5、6、7号为不同处理的粗酶液；4号处理 为次高分子量标样；8、9、10号为商品酶，9号为非变性处理。 图6 粗酶电泳图 2．2．3 a }移葡萄糖苷酶的催化机制 取反应底物(20％纯品麦芽糖)5 mL，加入 5 mL缓冲液，于55℃水浴箱中保温5 min后， 加入纯酶液5 mL，在反应不同反应时间用高效 液相色谱仪定量分析反应液各组分，测定结果 见图8。可知潘糖含量先增加后减少，异麦芽 (62) 糖含量随反应时间延长而逐渐增加，葡萄糖含 量逐渐升高。a 转移葡萄糖苷酶的催化机制 是：该酶在反应中先水解一部分麦芽糖生成葡 萄糖；再将葡萄糖以a一1，6糖苷键转移到麦芽 糖分子上，生成潘糖；随着反应时问延长，该酶 再水解麦芽糖分子和潘糖分子上的a一1，4糖苷 维普资讯 http://www.cqvip.com 誊一 酶 1号为蛋白标样(44～200 ku)，5号、6号为纯酶 图7 纯酶电泳图 键生成葡萄糖和异麦芽糖；当葡萄糖以a一1，6 糖苷键转移到其它异麦芽糖分子上时，形成异 麦芽三糖等。因此，可以通过控制反应时间来 使产物中低聚异麦芽糖含量达到最高。 { 呈 1 s 擎 0 + 葡萄糖 糖苷酶。 (2)通过SDS一聚丙烯酰铵凝胶电泳测定 a一转移葡萄糖苷酶粗酶液含有许多杂蛋白。经 柱层析纯化的a一转移葡萄糖苷酶是一种较纯的 蛋白，分子质量为130ku。通过高效液相色谱 法定量分析酶反应液各组分含量，可推测该酶 既具有水解特性，又具有转移能力。 参 考 文 献 1 岳振峰，陈小霞，彭志英．a一葡萄糖苷酶研究现状及 进展[J]．食品与发酵工业，2000，26(3)：63～67 2 陈必成，扈芝香．转移葡萄糖苷酶(transglucosidase E．c．2．4．1．24)生产异麦芽寡糖的研究[J]．食品与 发酵工业，1999，25(4)：1～4 3 高 雯．食品酶学原理与分析方法[M]．哈尔滨：黑 龙江科技出版社，1991．237～285 4 彭志英．食品酶学导论[M]．北京：中国轻工业出版 社．2002．182～214 反应时问(min) 5 Kuriki T，Yanase M ，Takata H et a1．A new way of 图s酶反应液中s种糖变化曲线 0= b y usi ng thpe 一 3 结 论 plication of Environment Microbiology，1 993，59：953 — — 959 (1)a一转移葡萄糖苷酶可用(NH4)2SO4、聚 6 Tanriseven A．Dogan S．Production of isoma1toI 乙二醇浓缩，浓缩酶酶活较高。有机溶剂、等电 oligosaccharides using dextransucrase immobilized in 点沉淀法易使酶变性。通过葡聚糖凝胶 alginate fibers[J]．Process Biochemistry，2002，37： (Sephadex G一200)柱层析可以提纯a一转移葡萄 1 111～1 115 Purification of a．transgluc0sidase and Its Characteristics Bi Jinfeng Li Chunhong Chen Tianjinz 1(Institute of Food Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing，100094) 2(College of Food Science and Engineering，Northwest Sci—tech University of Ag riculture and Forestry，Yangling，712100) ABSTRACT a—transglucosidase is a critical enzyme for producing isomaltooligosaccharide．The meth— ods to produce coarse enzyme of a—transglucosidase produced from Aspergillus niger，were studied． The characteristics of the pure enzyme were also studied．The coarse enzyme of a—transglucosidase was obtained using sephadex G一200 column chromatography．the molecular weight of pure enzyme was de— termined to be 130ku by SDS—PAGE electrophoresis．a—transglucosidase has the properties of both hy— drolases and transferases． Key words a—transglucosidase，purification，characteristic (63) 维普资讯 http://www.cqvip.com