食物过敏原免疫学检测技术进展综述

食物过敏原免疫学检测技术进展综述 食物过敏原免疫学检测技术研究进展 摘要:免疫学检测因特异性强、灵敏度高和操作简便的优点而备受青睐。该文介绍了部 分国家和地区食物过敏原标签标注情况，食物过敏原免疫学检测技术，包括酶联免疫吸附法 (ELISA)、免疫层析技术、生物传感器技术的研究进展和应用。通过与质谱、链式聚合酶反应 技术(PCR)对比，探讨了食物过敏原免疫学检测技术的发展方向。 关键词:食物;过敏原;免疫学检测 Abstract:Immunoassays have been paid extensive attention by scientists due to its high sensitivity and simple operation. In this paper，the situations of major food allergens labeling in some countries and areas were introduced，and the research progresses and applications of immunoassay techniques of food allergens，including enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)，lateral flow immunoassay and biosensor technique were summarized. By contrast with mass spectrometry and Polymerase Chain Reaction (PCR) technique，the prospect of immunoassays of food allergens was further discussed. Key words:food;allergen;immunoassay;progress 食物过敏是一个世界性公共卫生问题。调查显示世界上约4,的人口对食物过敏。目前， 已确定的过敏性食物多达180种以上，联合国粮农组织(Food and Agriculture Organization， FAO)了90,以上食物过敏原存在于牛奶、鸡蛋、鱼、甲壳类水产品、花生、大豆、坚果 类及小麦8大类食物中。为保护易感者健康，部分国家和地区对食物过敏原的标签标注进行了 严格规定(如表1所示) ，并列入立法范围，因此食物过敏原的检测越来越重要。食物过敏原 (Food allergen)检测技术根据检测目标物的不同，以全蛋白或酶解后肽段氨基酸序列的 质谱技术、检测编码过敏原DNA片段的聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR) 技术及分析过敏原性的免疫学检测技术为代表 。J。而质谱存在操作费时、仪器昂贵、检测 费用相对较高等缺点 ;PCR方法检测易因操作不当受到污染而产生假阳性结果，存在操作要 求技术性强、费时等缺陷。由于质谱技术和PCR方法在便捷程度、检测速度等方面的局限使其 难以满足市场应用的需求，因此，建立快速、高效、精确的食物过敏原检测方法显得尤为重 要。以酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫层析技术(Lateral flow immunoassay，LFIA)、生物传感器技术为代表的免疫学检测(Immunoassay)方法因其特 异性强、灵敏度高及操作简便而备受青睐 ，目前在众多过敏原检测方法中应用最为广泛。 1 食物过敏原免疫学原理 食物过敏原为食物中引发或激起过敏反应的物质，通常为在特定食物中含有的含量丰富、 天然存在的蛋白质。根据过敏原反应的速度及l临床特点等将致敏机制分为I、?、?、?， 其中大部分食物过敏是由IgE介导的I型超敏反应，包括致敏和发敏两个阶段。一定量的过敏 level of security personnel on duty, fire security measures taken. 9, post signs----construction site management and workers should wear distinctive markings. 10, security----focus on "safety of Sambo", parts of the construction, road surface protection facilities; implementation of Ministry of construction, "score", regular or not regular inspection, timely scoring, reward. ----11, with coordination between the construction and the total package units, collaboration among the type of work, comprehensive progress in contradiction to consult each other when dealt with properly. ----12, public relations personnel to abide by social morality, professional ethics, business discipline, properly handle PR around the construction site. Three, civilized construction appraisal, management (a) the construction site "five": lighting, hardening, greening, landscaping and purification. (B) noise emission standards: the day <65dB night <55dB (c) ... Protections: 1 enhancing the protection of all the construction finished and semi-finished products for education. Often quality education for workers, for moral education of the civilization production and the protection of the finished and semi-finished products. Education staff at the time of construction to respect other people and their work, cherish the completed and partially completed finished or semi-finished products. In front of the project for the corresponding rules 原可诱导易感个体产生足够量的IgE，IgE通过血循环分布全身，并与肥大细胞、嗜碱性粒细胞膜表面特定的受体结合，从而使机体处于致敏状态。当再次接触含相同或相似过敏原成分的食品时，过敏原分子特异性识别致敏细胞膜表面的IgE，诱导细胞脱颗粒释放炎症介质而触发食物过敏症。一般症状包括呕吐、腹痛、腹泻等，也包括皮肤反应及呼吸道症状，甚至会出现系统性过敏性休克或者死亡l2 J，目前尚无有效的治疗方法。能引起过敏反应的食物蛋白部分可能是一些氨基酸在一级结构的简单延伸，或蛋白质的独特三维结构，分别称为线性和构象决定簇(构象表位)。食物过敏原免疫学检测技术的原理基于抗原决定簇和抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性，使得抗原与抗体能够特异性结合，而过敏原的分离、鉴定、纯化及抗体的制备是实现食物过敏原免疫学检测的前提。利用过敏原的物理化学性质，采用硫酸铵沉淀、磷酸盐抽提等方法得到粗致敏蛋白提取液;聚丙酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)可使粗提液中不同相对分子质量的蛋白质得到分离;利用对食物过敏原过敏患者的血清或特异性单克隆抗体，通过免疫印迹(Western—bloting)法鉴定过敏原原性;依据致敏蛋白溶解度不同的硫酸铵沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀法，分子大小不同的凝胶过滤层析法，电荷差异不同的离子交换层析，配体的特异性亲和层析方法，疏水性不同的疏水层析法或几种方法的结合可得到纯化的食物过敏原。利用纯化的过敏原免疫兔子或小鼠等动物，抽取血清可得针对多种抗原决定簇的多克隆抗体;通过纯化过敏原免疫小鼠、融合免疫脾细胞和骨髓瘤细胞、克隆筛选、大量腹水制备可得到针对一种抗原决定簇的具有高度均一陛和可重复性的单克隆抗体? ，但需动物取血甚至杀死动物。由于鸡在其蛋中能富集抗体且免疫耐受性比哺乳动物好，所以从蛋黄中提取抗体是经济、方便、对动物友好的方法，得到的抗体可根据抗体类型，采用市售亲和层析柱纯化。过敏原的分离、鉴定、纯化及抗体的制备将为食物过敏原免疫学检测技术提供重要的技术支撑和物质基础。 表1 部分国家和地区食物过敏原标签标注情况 level of security personnel on duty, fire security measures taken. 9, post signs----construction site management and workers should wear distinctive markings. 10, security----focus on "safety of Sambo", parts of the construction, road surface protection facilities; implementation of Ministry of construction, "score", regular or not regular inspection, timely scoring, reward. ----11, with coordination between the construction and the total package units, collaboration among the type of work, comprehensive progress in contradiction to consult each other when dealt with properly. ----12, public relations personnel to abide by social morality, professional ethics, business discipline, properly handle PR around the construction site. Three, civilized construction appraisal, management (a) the construction site "five": lighting, hardening, greening, landscaping and purification. (B) noise emission standards: the day <65dB night <55dB (c) ... Protections: 1 enhancing the protection of all the construction finished and semi-finished products for education. Often quality education for workers, for moral education of the civilization production and the protection of the finished and semi-finished products. Education staff at the time of construction to respect other people and their work, cherish the completed and partially completed finished or semi-finished products. In front of the project for the corresponding rules 2 食物过敏原免疫学检测技术 2.1 酶联免疫吸附法 ELISA技术于20世纪70年代出现，是一种将抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合的免疫分析方法，其检测特异性源于抗原与抗体之间的特异性反应。目前其检测灵敏度一般可达到纳克级，若再加以全自动酶标仪的应用，ELISA方法的特异性和灵敏度还可进一步提高。ELISA方法是目前在食物过敏原的常规检测与筛选领域应用最广的免疫分析技术。ELISA的分类方法众多，主要技术类型有双抗体夹心法、间接法、捕获法和竞争法，其中，双抗夹心ELISA法和竞争ELISA法应用最为广泛。 Faeste等通过免疫兔子制备抗鳕鱼过敏原小清蛋白的多克隆抗体，利用该抗体包被酶标板，并用生物素标记该多抗建立了双抗夹心ELISA法，食物中小清蛋白的检出限为0.0l mg,kg，约每kg食物中可检测5 mg鱼肉成分，灵敏度较高。另外，该研究组应用建立的双抗夹心ELISA法对32种鱼类及其它物种含有的小清蛋白进行了检测，结果显示该方法特异性强，与其它物种中小清蛋白不存在交叉反应。此外，该方法稳定性好，应用此方法分析食物基质中的鳕鱼小清蛋白回收率达68,,138, ，其区内和批问差分别小于12,和19, ，具有较好的应用价值。Kaw等 应用相同的原理，建立了针对羽扇豆中总过敏原的双抗夹心ELISA，应用该方 ，但该方法存在与大豆及黑豆发生交法检测食物中残留的羽扇豆，其定量检测限为1 mg,kg 叉反应的缺点。 Mariager等_1 应用竞争ELISA法，用兔多克隆抗体检测了普通和抗过敏婴儿奶粉中的主要过敏原之一 一乳球蛋白，其检出限为0.08 L。张在军等? 依据斑点一ELISA原理，将3种含过敏原成分的花生、鸡蛋清、虾过敏蛋白以适当浓度点状吸附于硝酸纤维素膜，使其与3种过敏原特异性IgE血清和生物素化羊抗鼠IgG分别反应后，通过肉眼观察硝化纤维膜上斑点的显色确定待检血清中是否含有相应的过敏原成分。该方法操作简便，特异性强，3种过敏原之间无交叉反应。包被过敏原的硝酸纤维膜可在4?稳定保存4个月，重复性较好。Blais等。利用蛋黄中提取的抗体建立了斑点一ELISA法，可同时检测花生、榛子及巴西坚果中的过敏原，其定性检测限分别为0.O1、0.03、0.03 mg,L，检测时间约为30 min。 近十年来，市场上关于杏仁、大豆、花生、甲壳类、芝麻、芥末、羽扇豆、牛奶等食物过敏原的ELISA检测试剂盒均有销售，这些试剂盒可在30,60 rain内实现定性或半定量检测 。目前，特异性强、快速和高通量式检测的新型ELISA试剂盒已成为食物过敏原快速检测方法的研究热点之一。 2.2 免疫层析技术 免疫层析技术始于1990年Beggs等 的人绒毛促性腺激素免疫胶体金层析系统，是ELISA技术原理的扩展应用，一般使用乳胶颗粒、胶体硒、胶体金以及脂质体等作为着色标记物。层析时，标记物与待测物之问形成的复合物被相应的配体捕获而聚集于硝化纤维膜上的level of security personnel on duty, fire security measures taken. 9, post signs----construction site management and workers should wear distinctive markings. 10, security----focus on "safety of Sambo", parts of the construction, road surface protection facilities; implementation of Ministry of construction, "score", regular or not regular inspection, timely scoring, reward. ----11, with coordination between the construction and the total package units, collaboration among the type of work, comprehensive progress in contradiction to consult each other when dealt with properly. ----12, public relations personnel to abide by social morality, professional ethics, business discipline, properly handle PR around the construction site. Three, civilized construction appraisal, management (a) the construction site "five": lighting, hardening, greening, landscaping and purification. (B) noise emission standards: the day <65dB night <55dB (c) ... Protections: 1 enhancing the protection of all the construction finished and semi-finished products for education. Often quality education for workers, for moral education of the civilization production and the protection of the finished and semi-finished products. Education staff at the time of construction to respect other people and their work, cherish the completed and partially completed finished or semi-finished products. In front of the project for the corresponding rules 检测线并呈现出标记物所带有的颜色，因此可通过纤维膜上显色条的有无、颜色的深浅和反射光线强弱等实现定性或定量检测 。 1997年，Mills等 首次将免疫层析技术应用于花生过敏原(伴花生球蛋白)的检出，其中杏仁软糖中花生成分的检出限为0.01,(质量分数)，巧克力中的检出限为0.1,(质量分数)。2003年，两种检测食物过敏原的免疫层析试纸条获得工业化生产，从而引发了免疫层析技术用于食物过敏原检测的研发热潮 。如2005年，Wen等以可目测的脂质体为标记物标记花生主要过敏原之一Arah 1的兔多克隆抗体，建立了以竞争ELISA法为原理的免疫层析检测方法，其在Ara h1质量浓度范围0.1,10g,L的缓冲液中检出限为0.45 mg,L，定性检测范围1,10 mg,L，检测时问小于30 rain且不需精密仪器。2006年，吉坤美等 依据双抗夹心ELISA法，把可目测的胶体金标记的花生总蛋白多克隆抗体固定于样品垫上，待测花生过敏原与胶体金一花生总蛋白抗体形成复合物，被包被在硝化纤维膜检测线上的花生总蛋白抗体捕获浓集成红色，可检测花生的主要过敏原组分Ara h 1与Ara h 2，灵敏度达50g,L。另外，该研究组还应用建立的免疫层析法对食物标签标注的含有花生成分、未含花生成分以及标注不详的l9种食品进行了检测。结果发现17种食品的检测结果与食物标签的内容相符合，2种标示不详的食品检测结果均为阳性，说明该方法特异性强，对于是否含有花生过敏原成分的食物检测具有 种商业免疫层析检测试剂盒，检测物质包括牛奶、花实际应用价值。目前，市场上至少有14 生、榛子、甲壳类水产品等，如麸质谷物中的醇溶朊定性检测限为2.5 mg,kg，检测时问为5 min，贝、甲壳类水产动物的定性检测限为5 mg,kg，检测时问为10 min 。 近二十年来，免疫层析技术在食物过敏原检测中得到了快速发展，但多集中在花生、榛子等坚果类过敏原的研究，商业化免疫层析检测试纸条多为定性或半定量检测。随着纳米材料学的发展，一些带有功能基团的纳米材料如胶体金、胶体银、荧光素、超顺磁性纳米微球可作为标记物与抗体偶联达到定性或定量检测的目的。因此，应用免疫层析检测技术结合新型纳米材料作为标记物，优化层析体系将是食物过敏原检测技术的研究热点之一。 2.3 生物传感器技术 自1 967年科学家研制出第一个生物传感器葡萄糖传感器以来，生物传感器在食品安全方面如致病菌检测、抗生素残留检测、农兽药残留检测、毒素检测方面得到了广泛应用 ，但在食物过敏原检测方面的应用研究较少。生物传感器根据待测物质和分子识别元件特异性结合，发生生物化学反应，产生的生物学信息通过信号转换器转化为可以定量处理的电、光等信息，再经仪表放大和输出，从而达到分析和检测的目的，如靶分子(抗体或单链DNA分子等)固定在传感器芯片表面，可实时定量检测一一种或多种分子问的反应。 过敏原的检测是通过不同的物理化学技术实现的，如表面等离子体共振(Surface plasmon reso.nance，SPR)、共振增强吸收(Resonance—enhanced absorption，REA) 。“等。Lu等 副采用SPR生物传感器定量检测了鲤鱼过敏原小清蛋白，检测时间为5 min，且仅需少量level of security personnel on duty, fire security measures taken. 9, post signs----construction site management and workers should wear distinctive markings. 10, security----focus on "safety of Sambo", parts of the construction, road surface protection facilities; implementation of Ministry of construction, "score", regular or not regular inspection, timely scoring, reward. ----11, with coordination between the construction and the total package units, collaboration among the type of work, comprehensive progress in contradiction to consult each other when dealt with properly. ----12, public relations personnel to abide by social morality, professional ethics, business discipline, properly handle PR around the construction site. 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In front of the project for the corresponding rules 样品(低至3.55 mg,L)，对样品纯化程度要求较低。微型SPR生物检测器已应用于食品生产过程中花生过敏原的检测，该检测器可实现在线定量检测。基于REA生物传感器检测牛奶过敏原 .乳球蛋白的研究显示，REA生物传感器在检测时需使用标记探针，纳米金颗粒标记的抗体可得到更强的REA信号 ]。沈丽燕?纠以抗原抗体免疫反应和压电型传感技术为基础，选择1，6一己二硫醇一纳米金自组装方式，建立了食物过敏原的压电型免疫传感器快速检测方法。该传感器对河虾过敏原原肌球蛋白的检出限为0.03 mg,L，花生蛋白的检出限为0.2 mg,L，检测时间约6 rain。其交叉试验结果与ELISA一致，且免疫传感器可再生1次之多，具有较好的应用前景。最近，Bremer等 研究出一种快速灵敏的免疫检测生物传感器，可在橄榄油中检出高于0.08 mg,kg的榛子蛋白，检测时间少于4.5 rain，同时可用于鉴别橄榄油中掺杂的榛子油，保护对榛子过敏者的健康。目前，已开发的商业化生物传感器可用于牛奶、鸡蛋、坚果、花生、鱼、芝麻等食物中致敏蛋白成分的检测 。 生物传感器技术兼具免疫检测技术和光电学技术的优点，在食物过敏原检测方面，选用最佳生物传感器、扩大应用范围将是生物传感技术的研究热点之一，另外高灵敏度、集成化、微型化、多功能化及商业化也是生物传感技术的发展趋势和重点研究方向。 讨论及展望 3 近年来，随着人们对食物过敏意识的增强，部分国家和地区已建立严格的食品过敏原标签，并立法强制要求对食物过敏原进行标示，推动了食物过敏原检测技术的不断发展， 表2对食物过敏原的几种主要检测技术进行了比较。 表2列出的几种主要检测方法中，质谱技术能精确测定全蛋白或酶解后肽段的氨基酸序列，再根据相应数据库确定致敏蛋白。液相,Z重串联四极杆质谱仪、高精度四极杆一飞行时问串联质谱仪、飞克级气相色谱,三重串联四极杆质谱联用仪、全新的代谢物谱库和软件平台使质谱技术的灵敏度有了新突破，但质谱技术鉴定过敏原多是结合高性能的分离纯化手段如双向电泳、液相色谱、毛细管电泳、场流分级等技术，存在操作费时、仪器昂贵、检测费level of security personnel on duty, fire security measures taken. 9, post signs----construction site management and workers should wear distinctive markings. 10, security----focus on "safety of Sambo", parts of the construction, road surface protection facilities; implementation of Ministry of construction, "score", regular or not regular inspection, timely scoring, reward. ----11, with coordination between the construction and the total package units, collaboration among the type of work, comprehensive progress in contradiction to consult each other when dealt with properly. ----12, public relations personnel to abide by social morality, professional ethics, business discipline, properly handle PR around the construction site. Three, civilized construction appraisal, management (a) the construction site "five": lighting, hardening, greening, landscaping and purification. (B) noise emission standards: the day <65dB night <55dB (c) ... Protections: 1 enhancing the protection of all the construction finished and semi-finished products for education. Often quality education for workers, for moral education of the civilization production and the protection of the finished and semi-finished products. Education staff at the time of construction to respect other people and their work, cherish the completed and partially completed finished or semi-finished products. In front of the project for the corresponding rules 用相对较高等缺点。PCR主要通过引物的特异性选择从而使具有一定同源性的DNA分子之间的交叉反应降低到最低 ，其灵敏度和特异性均较高，但经系列加工处理后食物样本中的DNA受损较大因而较难提取，且DNA需经转录、翻译等过程才能表达为具有一定生物功能的蛋白质，而此过程又受诸多因素的影响。因此PCR检测的阳性结果只能说明食物中含有致敏因素，但不能反映食物的真正过敏性即人们摄入该食物后会产生过敏反应。传统PCR多是定性分析，随着PCR技术的发展，实时荧光PCR、PCR—ELISA法可实现定量检测，但即使商业PCR试剂盒也需7,8 h，较为费时。质谱技术和PCR方法因在便捷程度、检测速度等方面的局限性而难以满足市场的应用需求，食物过敏原的免疫学检测技术因较好的特异性、操作简便性和低成本等优点受到食品工业界的青睐。其中ELISA技术较为成熟，可实现多样本同时检测，目前应用也最为广泛，较适合于过敏原的常规筛选和检测;基于生物传感器的检测方法克服了以往酶法分析成本高和化学分析步骤繁琐的缺点，其检测结果不受颜色、浊度的影响，操作系统比较简单，容易实现自动分析和现场检测，因而较适合于大规模样本的实时高通量检测。免疫层析技术将免疫反应转移到玻璃纤维和硝化纤维膜上进行，从而省略了标记物的结合与分离过程及加样、洗涤步骤，因而操作简便、检测快速(一般少于30 rain)，通过肉眼观察即可实现定性或半定量检测，较适合于现场的实时检测和监管。目前国内尚无自主研发的食物过敏原免疫层析试剂盒产品，开发免疫层析的定性与定量检测将是今后食物过敏原检测技术的研究热点之一。 随着生物技术的发展，各种多学科交叉的新型检测技术也将日益增多。纳米技术在食品安全快速检测中表现出的快速、简便、高效、灵敏等优点，使其在今后的应用中具有较大的发展潜力。近年来，基于新型纳米材料的免疫层析技术、生物传感器技术的研究也将推动食物过敏原检测方法朝着更加快速、高效、简便和经济的方向发展，并逐步应用于现场快速过敏原检测中，为我国食物过敏原快速检测技术的发展和食物过敏原标签标示制度的实施提供重要的技术支撑。 参考文献: 【1】 张迎俊，常见过敏原的种类和检测，国临床医生2008年第36卷第12期(895-897); 【2】 曾江龙，过敏性皮肤病患者过敏原检测分析研究，吉林医学2010年5月第31卷第14 期(1966-1967); 【3】 王成玉，过敏原、过敏性疾病及其治疗进展，中国医学创新2009年6月 第6卷第l8 期(119-121); 【4】 陈文彬，过敏原检测系统临床应用价值探讨，医学信息 2010年9月 第23卷 第9期 (1111-1112); 【5】 Rudolf Valenta* and Dietrich Kraft，From allergen structure to new forms of allergen-specific immunotherapy，Current Opinion in Immunology 2002, 14 :718–727. level of security personnel on duty, fire security measures taken. 9, post signs----construction site management and workers should wear distinctive markings. 10, security----focus on "safety of Sambo", parts of the construction, road surface protection facilities; implementation of Ministry of construction, "score", regular or not regular inspection, timely scoring, reward. ----11, with coordination between the construction and the total package units, collaboration among the type of work, comprehensive progress in contradiction to consult each other when dealt with properly. ----12, public relations personnel to abide by social morality, professional ethics, business discipline, properly handle PR around the construction site. 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