小黑豆多肽加工工艺的研究

小黑豆多肽加工工艺的研究 ※工艺技术食晶科学2008,VoL29,No.05231 小黑豆多肽加工工艺的研究 王常青,任海伟 (山西大学生命科学与技术学院,山西太原030006) 摘要:本研究采用双酶分步水解法制备小黑豆多肽.最佳工艺条件为:先用枯草杆菌碱性蛋白酶,在50~C, pH9.0下水解经预处理的小黑豆分离蛋白4h;再用霉菌中性蛋白酶在pH7.0,50~C水解4h,加酶量均为4000U/g. 该工艺的多肽得率可以达到80%以上,水解度(DH%)为32.75%.凝胶色谱明,小于10000D的多肽可达 到总多肽的91.61%. 关键词:小黑豆多肽;双酶水解;多肽得率;分子最分布;水解度 StudyonPreparationTechnologyofSmallBlack—soybeanPepfide WANGChang—-qing,RENHai--wei (InstituteofLifeScienceandTechnology,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China) Abstract:Theoptimumconditionsaboutsequentiallyhydrolyzingsmallblack-soybeanpr oteinisolatedwere:thesmallblack- soybeanwerehydrolyzedbyalkalineproteinasesintheconditionofpH9.0,50?for4hours,andthen,hydrolyzed continuouslybyneutralproteaseintheconditionofpH7.0,50?for4hours,andthequantityofpronaseis4000U/g.Thepeptide yieldreached80%,andthedegreeofhydrolysis(DH)ofblack-soybeanproteinisolateis32. 75%.Theresukofgelchromatography showedthatthepercentageofthecomponentofblack-soybeanpeptideswithamolecularw eightbelow10000D91.61%. Keywords:smallblack-soybeanpeptide;doubleenzymolysis;peptideyield:molecularw eightdistdbutiomDH 中图分类号:TS214.9文献标识码:A文章编号:1002—6630(2008)05—0231—03 黑豆又称乌豆,主要分布在东北,华北,西北和 西南地区,约占全国大豆栽培面积的8%左右.现代分 析表明,多数黑豆品种的蛋白质含量比黄豆高,而且 含有抗氧化和美容作用的黑色素.山西的小黑豆品种独 特,属高蛋白低脂肪型大豆,经测定,蛋白质含量高 达50%左右,氨基酸评分可以达到70,高于普通大豆, 是一种优质蛋白资源.但是,小黑豆子叶坚硬,蛋白 质分子高度压缩折叠,不易深加工和食用. 大豆多肽是由大豆蛋白水解成的分子量小于1O000D 的混合肽,已有研究表明,大豆多肽具有降血脂和降 血压等多种保健作用….本研究用自制的小黑豆多肽进 行动物实验,发现它不仅有以上保健作用,还有抗氧 化和抗衰老作用,可以提高大鼠皮肤弹性,是潜在的 保健食品和美容抗皱护肤品原料.目前尚未见到关于小 黑豆多肽的研究报道.本研究采用山西特有的腰型小黑 ,通过复合酶水解生产黑豆多 豆为原料提取分离蛋白 肽,为小黑豆的开发利用提供科学依据. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1小黑豆分离蛋白 选用山西省静乐县腰型小黑豆,经过筛选,去 皮,烘干后,用正己烷回流脱脂1h;将脱脂豆粉与水 按一定比例混合,用NaOH调pH8.5,9.0,在55?的 水浴中保温搅拌1.0h,然后离心取上清液;沉淀物进行 二次提取,离心;两次上清液合并后,调pH到4.0, 4.2沉淀蛋白,并水洗两次;水洗蛋白用碱液调pH到 中性,然后喷雾干燥,得到成品. 1.1.2凝胶色谱材料与生化试剂 木瓜蛋白酶,2709碱性蛋白酶,AS1.398中性蛋白 酶广西庞博生物有限公司;霉菌中性蛋白酶山西大 学生物工程室;葡聚糖凝胶G50,标准分子参照物蓝色 葡聚糖一2000,核糖核酸酶,胰高血糖素,缩宫素等 上海蓝季科技有限公司. 1.2仪器与设备 凝胶色谱系统(HD一003一C紫外检测仪和XWT一1044S 台式记录仪)上海天成科技有限公司;生物反应罐江 收稿日期:2007—09—20 基金项目:山西省科技攻关项目(2006031074) 作者简介:王常青(1956一),男,教授,研究方向为小杂粮深加工和功能食 品.E—mail:wcq@SXU.edu.ca 232200&Vo1.29,No.05食品科学※工艺技术 苏东方生物工程设备公司;TDL一5高速离心机上海安 亭科学仪器厂;ORION818pH计美国奥立龙公司. 1I3总氮测定和多肽得率计算方法 总氮采用半微量凯氏定氮法测定;多肽得率按照样品 中的总氮量与水解后离心上清液总氮量的比值进行计算: 离心上清液中总氮量 多肽得率(%)=——————_—一×100, 样品中的总氮含量 1.4氨基酸态氮含量和肽链水解度(DH)测定 氨基酸态氮按照GB/T5009.39—2003的甲醛滴定法 测定;蛋白肽链水解度的计算. DH(%)= 水解后离心上清液中氨基酸态氦一样品巾的氨基酸态氮 —— ×1oo 样品中的总氮量 1.5小黑豆分离蛋白水解试验 1.5.1小黑豆分离蛋白的预处理温度试验 准确称取小黑豆分离蛋白,配制成一定浓度(m/V) 的蛋白溶液,依次按80,85,90,95,100?恒温预 处理15min;然后按每克蛋白加入4000U碱性蛋白酶, ?下分别水解4h,比较多肽得率,确定 在pH9.0和55 最佳预处理温度. 1.5.2水解用蛋白酶的筛选及加酶量比较 分别将碱性蛋白酶(A),枯草杆菌中性蛋白酶(B), 霉菌中性蛋白酶(C)和木瓜蛋白酶(D)4种酶加入预处理的 小黑豆分离蛋白溶液中,各设置2000,4000,6000U/g 三个加酶组,调节到各酶的最佳温度和最适pH值,恒 温水解4h.其中碱性蛋白酶用0.5mol/LNaOH保持水解 过程中的pH值.水解结束后,95?灭酶10min后冷却. 调节水解液到pH4.3,在4000r/min离心15min,取上清 液测总氮和氨基酸态氮含量,比较不同条件的多肽得 率,水解度及不同加酶量对应的多肽得率. 1.5.3水解时间试验与双酶水解组合 根据前步试验筛选确定的两种效果好的蛋白酶,用 浓度8%的小黑豆分离蛋白溶液进行双酶同步或分步水解 4h,观察双酶水解的效果,并确定最适水解时问. 1.6黑豆多肽分子量分析方法 用0.1mol/LTris.HC1洗脱液平衡处理SphedexG一50凝 胶柱后,在280nm波长的条件下,用蓝色葡聚糖一2000 测定凝胶柱的外水体积.在同样条件下按4mg/ml注入标 准蛋白核糖核酸酶(13.7kD),胰高血糖素(3483D)和缩宫 素(1008D)各lml,得到三个紫外吸收峰.根据标准蛋白 分子量的对数(1ogMr)和出峰体积制作标准曲线和回归方 程.将多肽样品在同样条件下的紫外吸收图谱与标准蛋 白的图谱对比,或带入回归方程计算,确定样品多肽 分子量分布. 2结果与分析 2.1小黑豆分离蛋白液预处理温度的确定 图1表明,黑豆分离蛋白在95?水浴15min,多肽 得率最高.可能是黑豆蛋白含有较多的二硫键,在一 定温度下热处理可破坏这些共价键,降低黑豆蛋白溶液 的黏度,使黑豆蛋白致密的立体结构变的松散,成为 柔韧的直链状态,易于被蛋白酶水解,因此提高了多 肽水解得率.当加热温度过高时,蛋白质分子可能会 通过疏水结合形成网状聚合物,阻碍蛋白酶的酶解作 用,降低多肽得率. 2.2水解用酶和加酶量的选定 8O859O95100 温度(?) 图1预处理条件对多肽得率的影响 Fig.1Effectsofprocessingconditionsonpeptideyield 6o 50 — 4o 冰 鐾30 嫠 20 1O O ABCD 酶种类 图2酶种类对多肽水解得率的影响 Ffg.2Effectsofvarfetyofenzymeonpeptfdeyfeld 由图2可知,相同加酶量时,多肽得率高低顺序 为:碱性蛋白酶(A)>枯草杆菌中性蛋白酶(B)>霉菌中 性蛋白酶(C)>木瓜蛋白酶(D).但由图3可以看出,蛋 白水解度DH的高低顺序为:C>A>B>D.在这四 种酶中,用碱性蛋白酶水解黑豆蛋白可以得到的多肽最 多,而霉菌中性蛋白酶水解肽键的效率最高.兼顾提 高多肽得率和提高蛋白水解度(DH)两方面的因素,最终 选用枯草杆菌碱性蛋白酶和霉菌中性蛋白酶为双酶同步 (或分步)水解试验用酶.从图2,3还可以看出,随着 加酶量的增加,多肽得率与DH也在上升,但是加酶量 超过4000U/g后,多肽得率上升幅度很小,因此,最 终确定以上两种酶的最佳添加量为4000U/g蛋白. 2.3水解时间的分析 实验表明,无论是双酶同步水解还是分步水解, 多肽得率均随时间的延长而上升,但3,5h后增幅很小; 如船 一一瓣番=}琏餐 ※工艺技术艮晶科学2008,Vo1.29,No.05233 S 吞 200040006000 加酶量(u/g) 图3酶种类和加酶量对水解度的影响 Fig.3Effectsofthevarietyofenzymeandoptimalenzyme quantityonDH 褂 赃 餐 先中性后碱性 .先碱性后中性一世-- 时间01) 图4酶组合方式对水解度的影响 Fig.4Effectsofmodeofcombinationofenzymeonrateof peptidesproduction 同步水解4.5h时得率反而下降(图4).可能是因为随着 时间延长,多肽之间通过非共价键(如疏水基作用,氢 键和配位键)相互聚集,产生了聚合反应,导致多肽减 少.所以最终确定水解最佳水解时间为4h. 2-4复合酶组合方式的比较 在双酶同步水解(组合1),先碱性.后中性蛋白酶分 步水解(组合2)和先中性.后碱性蛋白酶分步水解(组合3) 三种组合试验中,组合1的多肽水解得率和DH最低, 可能是因为该水解条件下所选的pH值不在双酶各自最佳 活性范围,致使酶活性不能充分发挥(图4,表1);组 合2和3的水解得率接近(图4),但是组合2水解产物的 DH却比组合1高18.30%(表1),说明先用碱性蛋白酶, 再用中性蛋白酶水解黑豆蛋白,切断肽链的效率相对较 高;用凝胶色谱检测分析也表明(图5),在两种水解产 物中,组合3中水解不完全的火分子比例较多(A处对应 的分子量为10000D,B处为3100D),而组合2水解产 物中大分子比例很小,对小分子多肽的水解有利.可 能是先用碱性蛋白酶处理黑豆蛋白,能使其中的疏水基 团更充分的破坏,外露,增大了蛋白质的水溶性,因 而有利于霉菌中性蛋白酶的进一步作用【4_. 根据标准蛋白得到的回归方程v=一124.61x+570.15 (Vt=一124.611gMr+570.15)和面积积分法计算得知:采 用先中性,后碱性蛋白酶水解黑豆多肽,分子量分布 为:分子量大于10000D的为15.27%,10000~3100D的 占64.39%,小于3100D占30.33%;而采用先碱性,后 中性蛋白酶水解的分子量分布为:分子量大于10000D的 多肽仅为8.39%,10000~3100D的占54.35%,小于3100D 占37.25%,大分子明显减少.凶此,从总体上看,双 酶水解组合2(先碱性.后中性)的水解效果最好. 表1蛋白酶不同组合方式的效果比较 Table1Effectscomparisonofdifferentmodesofcombinationof protease 350 30o 250 名0o 150 10o 50 0 3055130 洗脱体积(m1) 图5黑豆多肽分子量分布 Fig.5Molecularweightdistributionofblack-soybeanpeptide 3结论 采用95?预处理小黑豆分离蛋白15min,可使其致 密的蛋白结构松散而易于水解,提高多肽得率.采用先 用碱性蛋白酶,后用霉菌中性蛋白酶分步二次水解,效 果好于该这两种酶的同步水解或先中性,后碱性酶分步 水解.当碱性蛋白酶用量4000U/g,在pH9.0,50?下 水解4h后,再用等量的霉菌中性蛋白酶在pH7.0,50? 水解4h,可以使分子量小于10000D的多肽达到90%以 上,其中小于3100D的占37.25%,水解度为32.75%. 参考文献: [1]蒋文强,孙显慧.大豆多肽的功能特性及其开发应用[J】.粮油加工 与食品机械,2004(7):39. 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