【word】 Mad2蛋白在有HeLa细胞有丝分裂期的动态定位

【word】 Mad2蛋白在有HeLa细胞有丝分裂期的动态定位 Mad2蛋白在有HeLa细胞有丝分裂期的动 态定位 第11卷第21期2011年7月 1671—18l5(2ol1)21—5158—04 科学技术与工程 ScienceTechnologyandEngineering Vo1.11No.21July2011 @2011Sci.Tech.Engng. Mad2蛋白在有HeLa细胞有丝 分裂期的动态定位 李腾高彦飞常艳 于鸣 王玉博 巩伟丽 穆蕊陈亮甄诚韩秋影 张维娜李慧艳 (国家生物医学分析中心,北京100850;军事医学科学院基础医学研究所细胞免疫学教研室,北京100850) 摘要在细胞有丝分裂中纺锤体检查点对保证遗传信息的稳定性有着重要的调控意义.其中Mad2蛋白作为纺锤体检查 点蛋白在前中期被招募到未与微管正确结合的着丝粒上,从而保证纺锤体检查点的激活并抑制后期的开始.通过活细胞荧 光共聚焦显微镜对Mad2的定位动态追踪,定量了其在有丝分裂过程中位于着丝粒上的光强变化,从而为研究纺锤体检查点 的功能提供了依据.而Mad2本身的蛋白表达过强过弱均可导致肿瘤的发生,因此通过对其有丝分裂中光强的定量也为研究 肿瘤的发生机制提供了线索. 关键词Mad2有丝分裂活细胞观察 中图法分类号Q253;文献标志码A 纺锤体检查点(Spindleassemblycheckpoint, SAC)对于保证染色体的正确分离以及遗传信息的 稳定性起着重要的作用.它主要作用在于可以延 长有丝分裂前中期的时间直到中期赤道板上的所 有染色体的两侧正确结合了由两极发出的微管,而 后SAC被灭活,可保证后期的开始J.而有丝分裂 检查点复合体(MCC)包括Mad2,BubR1,Bub3, Cdc20其可结合有丝分裂后期促进复合体(APC/ C),抑制其活性从而阻断APC/C作为E3酶的活性 来降解CyclinB以及Secufin,从而阻止后期的开 始….Cdc20可作为APC/C的共激活子来促进E3 酶对底物的招募与激活_lj.做为主要的MCC蛋白 Mad2与BubR1又通过结合Cdc20来抑制其对 APC/C的激活,因此Mad2的功能非常重要.其功 能又主要体现在有丝分裂中的定位变化,当SAC被 激活时,Mad2可以被招募到未与微管正确结合的着 丝粒上并与Madl结合,其作为可以使胞浆中 2011年4月I1日收到国家”863”项目(2009AA02Z103)资助 第一作者简介:李腾(1983一),男,博士研究生. 通信作者简介:李慧艳,E-mail:huiyanli@hotmail.corn. 失活型的O—Mad2构象改变成激活性的C—Mad2,从 而通过与Cdc20结合抑制APC/C的激活,阻断后期 的开始.而当微管与着丝粒正确结合时,Mad1一 Mad2被从着丝粒上去除,不再产生有活性的C. Mad2,而APC/C也不再被抑制,从而促进后期的开 始_2I3J,Mad2在SAC激活过程中存在着胞浆和着丝 粒定位的循环变化.并且Mad2不论过度表达或表 达减少均可导致小鼠肿瘤的发生.本工作即通 过免疫荧光及活细胞荧光共聚焦显微镜对Mad2在 着丝粒上的光强进行了定量并对其有丝分裂期定 位进行动态追踪,从而为后续研究Mad2对APC/C 产生抑制作用的分子机制提供线索. 1材料与方法 1.1材料 DMEM培养基和胎牛血清分别购自Gibco和 Hyclone公司;LipofectAMINE2000购自Invitrogen公 司. 1.2细胞培养 HeLa(人宫颈癌细胞)或HeLa/GFP—H2B细胞 2l期李腾,等:Mad2蛋白在有HeLa细胞有丝分裂期的动态定位 (人宫颈癌细胞,由本实验构建的稳定表达GFP— H2B的HeLa细胞系)采用DMEM+10%胎牛血清 (Hyclone),培养于37?,5%CO培养箱中. 1.3细胞转染及细胞同步化方法 将HeLa/GFP—H2B细胞种于8孔的腔室盖玻片 系统(Lab—Tek@Chambered#1.0BorosilicateCover GlassSystem,Nunc)中,当细胞密度达到80%左右 时,将细胞换至有血清无抗生素的DMEM培养基 中.LipofectAMINE2000进行细胞转染,RFP—Mad2 0.25孔,6h后更换新鲜培养基.转染后30h 后加人含有Thymidine(胸腺嘧啶核苷,2.5mnlol, Sigma)的DMEM新鲜培养基中培养24h,而后用 1XPBS洗三次去除培养基中的Thymidine,再加入 DMEM新鲜培养基培养8h后,大部分细胞进入有 丝分裂期,置于显微镜进行图像采集. 1.4活细胞荧光共聚焦显微镜观察 将HeLa/GFP—H2B细胞种于8孔的腔室载玻片 系统中,扫描前细胞密度达到70%一80%.图像每 5rain采集一次,共采集8h.488nm通道曝光时问 为0.1S,561nm通道曝光时间在0.3S,扫描宽度上 下共10m,采集10层.采用100倍油镜的荧光倒 置显微镜(NikonEclipseTi—E)及UhraView转盘式 共聚焦扫描设备(PerkinElmer)进行图像采集.培 养皿置于温度保持恒定37?,5%CO培养小 室内. 1.5免疫荧光 将HeLa细胞种于铺好盖玻片的24孔板(Cor— ning)中,过夜后加入含有Thymidine(2.5mmo1)的 DMEM新鲜培养基中培养24h,而后用1×PBS洗 三次去除培养基中的Thymidine,再加入DMEM新 鲜培养基培养8h后,待大部分细胞进入有丝分裂 期后加入4%多聚甲醛室温固定10rain,而后用1× PBS洗去4%多聚甲醛再加入0.3%TritonX一100 (Sigma)的1XPBS在冰上孵育10min,再用含 0.3%TritonX一100,3%封闭用羊血清的1×PBS室 温封闭1h,后加入一抗Mad2(抗兔多抗,1:100, Covance),CRESTantisera(抗人单抗,1:1000,An— tibodiesIncorporated)过夜,再加入二抗(Molecular Probes)室温1h,DAPI染色(Invitrogen).用Zeiss 510激光共聚焦显微镜,100x油镜进行图像采集. 对于Mad2及CREST的图像采集采用固定0.2m 间距扫描,并固定相同的扫描参数. 1.6ImageJ荧光定量 对于前中期及中期Mad2光强定量实验,使用 ImageJ(NIH)软件对Mad2及CREST的平均光强 值进行测量.每组分别统计大于l0个细胞,150个 着丝粒以上的Mad2与CREST光强比值得到平均 值及差,CREST光强作为内参,将前中期Mad2 与CREST光强比值的平均值设定为1.采用SPSS 13.0软件对数据进行t检验统计学分析,P<0.01 认为存在显着性差异. 2结果 ????? ????? ?????图1RFP—Mad2蛋白存问期及有丝分裂期的定位 5160科学技术与工程11卷 2.2Mad2在有丝分裂中期在着丝粒上的定位减少 文献报道,Mad2在前中期在着丝粒和胞浆中循 环运动,而着丝粒则作为一个平台使失活型的O— Mad2结合Mad1变为有活性的C—Mad2,从而可以与 胞浆中的Cdc20结合,抑制其对APC/C的激活作 用J.随着细胞周期进程到有丝分裂中期当所有 的微管与着丝粒连接后,Mad2则不再在着丝粒上被 激活产生抑制信号,从而解除了对APC/C的激活. 而APC/C复合体的激活则促进多种底物的顺序性 降解,包括CyclinB及Securin等蛋白,其降解进一 步促进以染色体向两极分离的后期的开始.为了 进一步确定图1所示的结果,即Mad2在着丝粒上 的定位在前中期强,而中期减弱.通过免疫细胞荧 光染色分别对有丝分裂的前中期及中期内源性的 Mad2,标记着丝粒蛋白CREST及细胞核进行免疫 荧光染色,可见CREST的光强在前中期及中期并无 明显改变,而Mad2在中期位于着丝粒的定位基本 消失(见图2).而后对Mad2光强进行定量分析, 如图3所示.Mad2在中期光强与前中期相比有显 着性的降低(P<0.01).与文献报道Mad2前中期 定位于没有与微管结合的着丝粒,而当微管与着丝 粒正确连接后其在着丝粒定位消失是一致的,从而 解除Mad2对APC/C的抑制. 蹑 鲁 j盂 躁 岳 每组分别统计大于10个细胞,150个着丝粒以 上的Mad2与CREST光强比值, 将前中期Mad2与CREST光强比值设定为1. 平均值-4-标准差(P<0.01,ttest) 2.3动态分析Mad2从前期到后期开始在着丝粒 定位光强的变化 为了进一步研究Mad2从着丝粒上解离的动态 过程,我们采用活细胞荧光共聚焦显微镜对Mad2 进行连续观察.发现Mad2在核膜破裂后细胞膜的 定位不再存在,而位于着丝粒上的光强有一定增 加.随着染色体逐渐有序排列,主要是由于由中心 体产生的微管与染色体的着丝粒结合,并产生拉力 从而逐渐将每个姐妹染色体拉向中期的赤道板,此 时Mad2在着丝粒上的定位逐渐消失(见图4).到 有丝分裂中期后,当所有微管都与着丝粒正确连接 时,Mad2在着丝粒定位完全消失,而少量定位于细 胞浆中,从而不再产生对Cdc20有抑制作用的激活 性C—Mad2.对上述过程中的Mad2光强进行动态 定量,结果如图5所示.可见Mad2从核膜未破裂 到核膜破裂在着丝粒上的光强有所增强,而后由核 膜破裂到中期开始光强逐渐减低最后几乎消失,这 与图3的结果是一致的. Ma(12CREST.?A?ge3讨论 ?? ??图2免疫荧光检测Mad2在有丝分裂前中期及中期的定位 右上角的小图代表其中的一对着丝粒(比例尺:10m) 1 盘?—l lI一 图3分别定量前中期与中期的Mad2相对光强 SAC的调控网络非常的复杂,Madl—Mad2在着 丝粒上可作为模板促进有活性的C-Mad2的产生, 为研究SAC调控的动态过程起着重要的作用.因 此对Mad2定位变化的解析将复杂的调控过程直观 化对研究SAC的调控有着重要的意义.如SAC提 前灭活通常伴随着Mad2定位的减弱或消失J,而 SAC的过度激活经常伴随着中期仍有着丝粒上 Mad2的定位,从而产生对APC/C的抑制.通过 Mad2在有丝分裂不同时相的动态定位研究,为探索 SAC激活及灭活的机制提供了很好的模型. 21期李腾,等:Mad2蛋白在有HeLa细胞有丝分裂期的动态定位5161 O O O O 核膜破裂 图4活细胞荧光共聚焦观察RFP—Mad2 在有丝分裂期的动态定位时间/min 核膜破裂之前及之后的时间/min 图5定位于着丝粒上的Mad2光强随时间的 动态定量将核膜破裂前5rain的Mad2光强值设定为1 参考文献 1MusacchioA,SalmonED.Thespindle—assemblycheckpointinspace andtime.Naturereviews.Molecularcellbiology,2007;8(5): 379—_393 2MaldonadoM,KapoorTM.ConstitutiveMadItargetingtokineto— choresuncouplescheckpointsignallingfromchromosomebiorienta. tion.NatureCellBiology,2011;13(4):475—482 3FangG,YuH,KirschnerMW.ThecheckpointproteinMAD2and themitoticregulatorCDC20formaternarycomplexwiththeana— phase’promotingcomplextocontrolanaphaseinitiation.Genes&de— velopment,1998;12(12):1871--1883 4SotilloR,HemandoE,Diaz—RodtlguezE.Mad2overexpressionpro. motesaneuploidyandtumorigenesisinmice.CancerCell,2007;11 (1):9—-23 5MichelL,Diaz—RodriguezE,NarayanG.Completelossofthetumor suppressorMAD2cansesprematurecyclinBdegradationandmitotic failureinhumansomaticcells.ProceedingsoftheNationalAcademy ofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2004;101(13): 4459——d464 6MapetliM,MassimilianoL,SantaguidaS.TheMad2eonfnrmational dimer:structureandimplicationsforthespindleassemblycheck. point,Cell,2007;131(4):73O一743 7MeraldiP.SorgerPK.AdualroleforBublinthespindlecheckpoint andchromosomecongressionTheEMBOJournal,2005;24(8): I621,I633 DynamicLocalizationofMad2inHeLaMitosis LITeng,GAOYan.fei,CHANGYan,WANGYu-b.,MURui,CHENLiang,ZHENCheng,HANQiu—yi”g, YUMing,GONGWei...1i,ZHANCWei—na. LIHui-yan口 (NationalCenterofBiomedicalAnalysis,Beijing100850,P.R.China; DepartmentofMolecularImmunology,InstituteofBasicMedicalSciences,AcademyofMilitaryMedicalSciences ,Beijing100850,P.R.China) [Abstract]Spindleassemblycheckpointinmitosisisveryimportantforinsuringthestabilityofgeneticinf_0rma— tion.Inpresentmodelsofcheckpointsignalling,akeystepistherecruitmentofMad2tokinetochoresthatlack propermicrotubuleattachments,andtheninhibitetheanaphaseonset. Here,thoughtime—lapsec0nf0ca1scanning1a. sermicroscopy,thelocalizationandquantifytheintensityofMad2levelsOilkinetochoresinmitosisareobsewed.that facilitateUStoknowtheregulationofspindleassemblycheckpoint.Howerver,Mad2expressi0nhigher0rlowerbothcan inducetumorgenesis,SOquantificationofMad2levelsinmitosisalsoofferatoolforresearchingthetumorgenesis. [Keywords]Mad2mitosislive.cellimageing ?正o 誉靛zp目窖划