中国人皮脂腺囊瘤家系中角蛋白17基因突变的研究道

中国人皮脂腺囊瘤家系中角蛋白17基因突变的研究道 中国协和医科大学 博士学位论文中国人皮脂腺囊瘤家系中角蛋白17基因突变的研究 姓名:赵轶薇 申请学位级别:博士 专业:临床医学 指导教师:张学 20040601～里塑翌堕型,大堂，堕丝兰:旦些兰些堡奎 中国人皮脂腺囊瘤家系中角蛋白,,基因突变的研究 中国人皮脂腺囊瘤家系中 角蛋白, ,基因突变的研究 中文摘要 多发性皮脂腺囊瘤(,,,,,,;,,,,,, ,,,,,,,,,，,,;,，, ,,,,,,)也称多发性皮脂囊肿。其临床特点为大量无症状性皮肤囊肿，多分布于前胸、上腹部、腋窝、腹股沟和肢体的近侧。,,的组织学特点为囊壁由复层鳞状上皮组成，无颗粒层，囊腔内壁由嗜酸染色的单细胞层上皮构成，囊壁内或其近周多可见大小不等的扁平的皮脂腺小叶。,,病例较少见，国外报道多为散发病例，国内报道病例多有家族史，发病无性别差异，双亲之一患病，后代再发风险为,,,，符合常染色体显性遗传。,,也可是多种综合征的一种现，国外报道,,常与,型先天性厚甲症(,,;,,,,,;,,, ;,,,,,,,,,,,,, ,，,,一,;,，, ,,,,,,)或毛囊肿 (,,,,,,,, ,,,,,, ,,,, ;,,,,，,,,,)合并存在。国外学者于,,,,年对角蛋白,,基因(,,,,,)进行,,,产物直接测序，发现,,患者有,,,,,的杂合性错义突变(,,,,和,,,,):于,,,,年发现在,,与,,一,型患者中有相同的,,, ,,的,,,,突变。国内学者,,,,年应用逆转录一聚合酶链反应(,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,,—,,,,,,,,,, ;,,,, ,,,;,,,,，,,,,,,)方法将其产物直接测序，发现中国人,,患者存在,,, ,,基因,,,,的杂合性错义突变。～里协和匿科态学临床医学专业毕业论文 中国人皮脂腺囊癌家系中珀蛋白,,基因突变的研究 本研究采集,个,,家系，患者均以多发性皮脂腺囊瘤为唯一表现，根据临床、病理特点诊断为单纯?裕樱汀, 私 徊椒治觯耍遥裕欤坊 蛟谥泄 耍樱筒? 械耐槐淝榭鲆约盎 蛐陀肓俅脖硇椭 涞墓叵担 狙芯坑τ贸彩骄酆厦噶捶从Γǎ睿澹螅簦澹?,,,)及其产物直接测序、,,,产物,,克隆、插入片段测序及限制性片段长度多态性(,,,,,,;,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,，,,,,)分析等方法对上述,个,,家系中,,,,,基因的突变热点区域进行了序列分析。研究结果表明，在第一个,,家系所有患者和一个,,岁的表型正常的成员中均发现杂合性错义突变,,,,,,(,,,,)。这一突变为国内外首次报道，其发现使与,,或,,(,相关的,,,,,基因突变增至,,种，且这,,种突变均位于角蛋白中间丝螺旋杆区高度保守的,,区域。在另外两个,,散发家系患者中，于同样区域未到突变的存在。 总之，本研究发现,种新的,,相关的,,,,,基因突变，并利用突变检测对家系中一成员进行了症状前基因诊断，为中国人,,遗传学研究提供了重要参考资料，对开展,,基因诊断和遗传咨询有重要的指导意义。中国协和医科大学临床医学专业毕业论文 中国人皮脂腺囊痛家系中角蛋白,,基因突变的研究 , ,,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,;,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,;,,,,,,,;,,,,,, ,,,,,,,,,(,,，,，, ,,,,,,),, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, ;,,,,;,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,;,,,, ;,,,, ,,,;,,,, ,,,, ;,,,,, ,, ,,,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,,;,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,, ,,,,,, ;,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,;,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,, ,, ,, ,,,,,,,,,,,;，,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,—,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,;,,,, ,,,,,, ,, ,,,,, ,,,,;,,,,,,,,;,,,,, ,,,;, ,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,,, ,, ,,, ;,,,, ,,, ,, ,,,,,,,,, ,,, ;,,,(,,, ,,,,, ,, ,, ,,,,, ,, ,;;,, ,,,,,, ,,,,;,,, ,,,,,,,,;,,;, ,,, ,,,,,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,;, ,, ,,,,,,,,(,, ,, ,,,,,,,,, ,, ,,;,,,,,;,,, ;,,,,, ,,,, ,,,, ,,,, ,(,,,,，,，, ,,,,,,)?,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,, ,, ,,, ,,,,，,, ,,,,,,,, ,, ;,,,,?,, ,,,,,,,,,(,, ,,,,,,,; ,, ,,,)，,,,,，,,,,,,,,,,,,, ,, ;,,,, ,,,, ,,;,,,,,,,?,, ,,,,,,, ;,,,,;,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,, ,,,, ,, ,, ,,, ,,,,,,, ;,,,,,,,,,,，, ,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,;,，, ,,,, , ,,,,,, ,,,,, ,,,,,, ,,, , ,,,,,,,; ;,,,,， ,中国协和医科大学临床医学专业毕业论文 中国人皮脂腺囊瘤家系中角蛋白,,挂闻突变的研究,,,, ,,;,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,(,,,, , ,, ,,, ,,,;,,,,,, ,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,, ;,,,, ,,,;,,,, ,,,, ,,,;,,,; ,,,,,,,(,,,,,,,,;,, ,,,, ,,,,,;,,, ,, ,,,,,,,,; ,,, ,,？,,,;,,, ,,,,, ,,,,,,;,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,(, ,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,，,,,,(,,,,,,)，,, ,,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,;,,, ,, ,,, ,,,,;,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,, ,,,,,,，,,;,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,; ,,, ,, ,, ,,,,, ,,,，,,, ,,, ,, ,,,,, ,,, ,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,; 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,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ;,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,, ;,,,,, ,,,;,,,,, ,,, ,,,,; ,,,,, ,;,,, ,中厦垫塑垦科大学临脒医学专业毕业论文 中国人皮腊腺囊痈家系中角蛋,,, ,,基因突变的研究 —,,—,一 目,, 吾 优生优育，提高人口质量是当代人类健康的中心问题之一。如何避免缺陷胎儿出生，治疗先天性疾病以成为全球医学工作者关注的焦点。分子遗传学一基因组学的迅速发展，促进了分子医学时代的到来，推动多种复杂疾病致病基因的发现及其发病机理的认识。现代生物医学研究证明，疾病是环境因素(外因)与机体(内因)相互作用而形成的一种特殊的生命过程。遗传因素则是构成机体内因的主要因素。人类的各种遗传因子从精子与卵子结合到胚胎形成时就存在于机体之中，在发育过程中受到环境影响而不断变化。根据,,,,年的普查，我国约有,(,,的新生儿患有严重的出生缺陷或先天畸形，其中,,,(,,,涉及遗传因素。智力低下或智能发育不全在我国人群中的发病率约为,(,,，这是影响我国人口素质的重要因素。其中，,,,以上具有多基因病、单基因病或染色体改变的遗传基础。 多发性皮脂腺囊瘤(,,,,,,;,,,,,, ,,,,,,,,,，,,;,，, ,,,,,,)亦称多发性皮脂腺囊肿，是一种罕见的常染色体显性遗传病。,,,,年，,,,,川对,,进行了最早的病例描述。而其实早在,,,,年，就有类似,,表现的病例报道,,】，只是当时还未将此类疾病命名为多发性皮脂腺囊瘤。直到,,, ,年，,,,,,,,脚才将此类疾病进行命名。其临床特点是大量无症状的皮肤囊肿，,岁至,,岁均有发病报道，好发于青春期，囊肿数量及大小可增长达,年至,,年不等，质地软硬不等，呈皮肤色、主里坐塑堕翌盔堂坚堕堕萝童、业望些论是 中国人皮脂腺囊痛家系中角蛋白,,基因突变的研究黄色或淡蓝色，大小从几毫米至几厘米不等，主要分布于颈部、躯干、腋窝和腹股沟等富含皮脂腺的区域【,】,组织学检查可见囊壁由复层鳞状上皮组成，缺乏颗粒层，其特点是扁平的大小不等的皮脂腺小叶位于囊壁内或贴近囊壁，同时腔内有厚的、均质的、嗜酸染色的角质物不规则的突向囊腔〔,,。临床上很多疾病都被认为与,,相关，其中以毛囊肿 (,,,,,,,, ,,,,,, ,,,, ;,,,,，,,,,)和先天性厚甲症(,,;,,,,,;,,,;,,,,,,,,(,,)最为常见。 ,,,,年，,,,,,〔,,等对一临床表现为全身多发囊肿病人的病理切片进行详细的分析比较后，发现该囊肿在组织学上既具有,,的部分特征，又具有,,,,的部分特征，因而提出,,与,,,,应该是共同起源于毛囊皮脂腺导管的一组疾病。,,,,非常少见，其临床表现于,,,,年首次被描述〔训，它的发病年龄、好发部位、囊肿外观及遗传方式均与,,相似，典型毛囊肿的组织学表现为囊壁由,至,层复层上皮组成，具有颗粒层，囊腔内含有断裂的毛干和沉积的角质。,,,,年，韩国科学家〔,】通过对,,例,,患者的临床和组织学特征进行详尽的研究后进一步验证了,,,,,的观点。 ,,的病因和发病不明，遗传因素起了主要的作用，本病常呈染色体显性遗传。目前缺乏有效的治疗手段，对较大的囊瘤可行手术切除;对较小的囊瘤可行激光治疗，但囊瘤只有在囊壁去除完全时才能得以根治，故特异治疗只能寄希望于基因治疗。所以目前急待解决的问题是阐明,,的分子发生机制，最终解决治疗难题。～尘韭塑型至型二～～竺鲨塑望竺堂些笙苎 生堕?些～～堕窭堕塞墨?塑墨皇～～苎里窒壅竺型塞 ,,,,年，,,,,,等【,,研究发现:,,患者有角蛋白,,(,,,,,,, ,,(,,,,,)的杂合性错义突变(,,,,和,,,,)。次年，,,,,,,,等〔,,,又发现,,与先天性厚甲症,型(,,一,，,，, ,,,,,,)有共同的,,,,,,,,,突变，进而认为,,可能是,,一,的,个亚型，以多发性皮肤囊肿为主要表现伴或不伴有指甲的轻微改变。,,是一种以指甲的过度萎缩为主要临床表现的常染色体显性遗传性皮肤病【,,】，分为两型，,;一,又名,,;,,,,(,,,,,,型，它的主要表现为指甲的过度萎缩和多发性的毛囊皮脂腺囊肿，部分患者还会有早生乳牙、卷毛或角膜营养不良的现象〔,,，,,,。,,,,年，国内首次报道,,,,, ,,,,的突变与中国人,,相关„,,,。 ,,,,,基因定位于染色体,,？,,一？,,，全基因组长约,,,，含,个外显子。,,,,,是一种主要表达于毛囊、甲床、皮脂腺及其他表皮附属器的分化特异性角蛋白，它的致病性突变将严重影响角蛋白细胞纤维网架结构，从而导致表达,,,,,的组织出现细胞脆性的改变和过度角化的现象〔,,】。这就可以解释为何发生上述基因突变的患者会出现指甲萎缩和(或)多发性皮脂腺囊瘤的症状。 本研究应用巢式聚合酶链反应(,,,,,, ,,,)及其产物直接测序、,,,产物,,克隆、插入片段测序及限制性片段长度多态性(,,,,)分析等方法对,个辽宁籍,,家系进行致病基因的突变筛查，以期进一步明确中国人,,与,,,,,异常的关系，探索中国人,,的遗传学基础，并为,,的基因诊断与 遗传咨询提供科学依据。～堡,塑塑堕型叁堂，堕壁堕堂皇些望些论文 中国人皮脂腺囊痛家系中期蛋白,,基网突变的研究 材料与(方法一、 实验材料,家系材料 本课题研究对象为中国辽宁的,个,,家系。我们使用,,,,抗凝的,,,,,,,,?型真空采血管采集包括临床病例及其家系成员共,,人的外周血，,,,,人，其中患者,例，表型正常的家庭成员,例。研究前征得受检者本人的知情同意。血样置(,,?备用。,(,系谱及临床资料:家系,:,代,,人组成。 ,, , , , 图,(家系,系谱图 “一为采集血样者宅璺坠塑医科,叁箩临床医学专业毕业论文 中国人应脂腺囊痛家系中角蛋白,,基因突变的研究 先证者(，，,,,，见图,)女，,,岁，父母非近亲结婚，足月顺产。自,,岁始全身渐出现大小不等皮肤囊肿，以背部和颈部为主(见图,)，且随年龄增长，囊肿数目增多，体积增大，最大为,(,;, , ,(,;, ,,(,;,，囊肿质地软硬不等，似橡皮样硬，颜色淡黄。其身高、体重、智力发育均正常，无指甲、毛发、口腔黏膜白斑及早生乳牙等表现。家系中其余,名患者临床表现与先证者均相似，同样以全身多发皮肤囊肿为主要表现，无指甲、毛发等外胚层发育不良的表现。对先证者取不同部位共活检,个囊肿，组织病理学符合,,的诊断(见图,)。家系,:为散发病例 ，? 图,(散发家系,系谱图 患者女(,,,，见图,)，,,岁，父母非近亲结婚，足月顺产。自,,岁起全身渐出现黄豆大小皮肤囊肿，以颈部和右上肢屈侧为主(见图,)，双腹股沟区可触及,(,个小囊肿，但外观正常。近几年，囊肿数目渐增多，体积也略有增大，囊肿质地较硬，颜色淡黄，活动度好。其身高、体重、智力发育均正常，无指甲、毛发、口腔黏膜白斑及早生乳牙等表现。因患者拒绝行囊肿活检，故，临床诊断为,,。～削洳和医科大学临眯医学专业毕业论立 中剧人皮脂腺囊痈家系中角蚩白,,基埘突变的研究家系,:为散发病例 ，? 图,(散发家系,系谱图 患者男(,,,，见图,)，,,岁，父母非近亲结婚，足月顺产。自,,岁起全身渐出现绿豆粒大小皮肤囊肿，于颈部、右腋,及左小腿屈侧分别可见一淡黄色绿豆粒大小囊肿，质较硬，活动度好。背部及双腹股沟区可触及,(,个外观正常的小囊肿。近几年，囊肿数目渐增多，体积也略有增大。患者身高、体重、智力发育均正常，无指甲、毛发、口腔黏膜白斑及早生乳牙等表现。因患者拒绝行囊肿活检，故临床诊断为,,。,(,临床照片 图,(家系,中先证者?,,临床特征中瑚协和医科人学临床医学专业毕业论文 中国人皮脂腺囊瘤家系中角蛋白,,基州突变的研究 图,(散发家系,中先证者临床表现,(,病理图片 图,(家系,中先证者,,,病理表现 ,,～主堕堡塑堕型查堂堕堕堕堂皇、业望、业堡兰 中国人皮脂腺囊痛家系中角蛋白,,基因突变的研究,主要试剂,(, ,,,提取相关试剂 ,)(,,,,,?，,,,型真空抗凝采血管(,,,,抗凝，,,,,,,, ,,,—,,,公 司) ,)(,,,十二烷基磺酸钠(,,,，,,,;,,,,公司) 在,,,,,去离子水中，溶解,,,电泳极,,,，加热至,,?，用 磁力搅拌器搅拌助溶，加入数滴浓盐酸，调节溶液的,,值至,(,， 加水定容到,,，分装。常温保存。 ,)(乙二胺四乙酸(,,,,),(,,,,,,(,, ,(,) 在,,,,,水中加入,,,，,,二水乙二胺四乙酸二钠，在磁力搅拌器 上剧烈搅拌，用,,,,调节溶液的,,值至,(,，加水定容至,,， 分装后高压灭菌备用。 ,,(蛋白酶,(,,,,,,,)(,,,;,公司) 在,,,,去离子水中，加入,(,,蛋白酶,， 充分溶解，,,,,。,储 存备用。 ,,(,,,,饱和酚(北京化学公司) ,、(氯仿(北京化工厂) ,,(, ,,,,,醋酸钠(,,,(,) ( ,,,,,,,,, ,,(,,,，,,,,去离子水，冰乙酸调至,,,,(,，定容 到,,,,,。高压灭菌，,”,保存。 ,,(无水乙醇(,,京化工厂) ～旦堡竺垦型查兰堕堕垦兰兰些兰些丝苎—一 ～里叁些～～壁塞翌窒墨～塑垄皂～～茎垦窭壅塑翌～壅 ,)(,,,乙醇 ,,)(,,(,, ,(,): , ,,,,, ,,,, ,,,(,, ,(,) ,(,,, ,(, ,,,,, ,,,,(,, ,(,) ,(,,, ,,,,, ,,(,,, 混匀后加水定容为,,,,,。高压灭菌，,?保存。 ,(, ,,,相关试剂:均购自,,,,,,公司 ,)(,,,聚合酶,,,,,, ,,？ ,,,聚合酶,,,, , ,)(引物 ? ,)(,,,, ,,,,,,, ,、(,, , ,,, ,,,,,,(,,,?,,,, ,, ,,,，,,,,,) ,,(,,, ,,,,,,(,,,,,,),(,琼脂糖凝胶电泳相关试剂 ,)(琼脂糖(,,,,,,,公司) ,)(,, ,,, ,,,水中加入,, ,,，,,溴化乙啶(,,)(,,,,,公司): 在,, 磁力搅拌数小时，以确保其完全溶解， 用铝箔包裹容器，,?避光保存。 ,)(,, ,,,,电泳缓冲液 ,)(,,,,,电泳缓冲液 ( ,,(,, , ,,,,,,, ,,,,,,(,,,,,,公司),(, ,,,片段的分离及纯化 采用,,,？,,;, ,,, ,,,,,;,,,, ,,,(,，,,,,公司) ～旦型塑型至型盔堂堕堕堕堂～些望些堡壅 中国人皮腊腺曩痛家系中角蛋白,,照因突变的研究,(,限制性内切酶: ,,,，，限制性内切酶购自,,,,,,公司,(, ,,,聚丙烯酰胺凝胶相关试剂 ,)(,,,,,电泳缓冲液 ,)(,,,,,电泳缓冲液 ,)(,,,丙烯酰胺凝胶贮存液 ,,(四甲基乙二醇(,,,,,)(，,,,,,,,,,公司) ,)(,,,过硫酸胺 ,,(, , ,,,,,,, ,,,,,,(,,,,,,公司),(,银染色法相关试剂 ,)(固定液(,(,,) 量取无水乙醇,,,,,，无水冰醋酸,。,,,，加入双蒸水至,,,,,。 ,,(染色液(银染液,(,,) 称取硝酸银(,,,,。),克，加入双蒸水,,,,,。避光保存于棕 色瓶中。 ,)(显色液(,(,,) 称取,(,,氢氧化钠加入双蒸水,,,(,,,，待氢氧化钠完全溶解加 入,(,,,甲醛(分析纯，北京化工厂)混匀，常温保存。,(, ,,克隆相关试剂:均购自,,,,,,公司 ,,(,,,,,一,质粒 ,,(,,,,,化学感受态细胞中国协和医科大学临床医学专业毕业论文 中国人皮脂腺囊痛家系中角蛋白,,基因突变的研究,几种主要试剂的配制,(, ,, ,,,,电泳缓冲液 ,,,,,(,,,, ,,,(,,(,,,,,,,公司, 冰乙酸 ,,(, ,, ,(,,,,,, ,,,,(,, ,(,) ,,,(,,, 加双蒸水至,,,,,,，常温备用,(, , ,,,,电泳缓冲液 ,,,,,,电泳缓冲液 ( ,,,, 加双蒸水至,,,,,，常温备用,(, ,,,,,电泳缓冲液 ,,,,(,,,, ,,(,,(,,,,,,,公司) 硼酸 ,,(,, ,,,,,, ,(,,,,,,,,,,(,, ,(,) 加双蒸水至,,,,,,，滤纸过滤，常温备用 ,(, ,,,丙烯酰胺凝胶母液 丙烯酰胺(,;,,,,,,,,) ,,,(,,,,,公司) ,，,一亚甲基双丙烯酰胺(,,,(,;,,,,,,,,),,(,,,;,,,,公司) 加水至,,,,,，滤纸过滤，,?避光保存。 ,(, ,,,过硫酸胺 称取过硫酸胺,(,,(,,,,,,,公司)，加水至,,,，充分溶解，,?保 存,—,周。 ,,中国咖和医科人学临床医学专业毕业论文 中国人皮脂腺囊痛家系中角蛋白,,摧因突变的研究,(, ,,,聚丙烯酰胺凝胶 ,,,丙烯酰胺 ,,,, ,,,,, ,,,, ,,,过硫酸胺 ,(,,,, ,,,,, ,,,, 加水至,,,, ,(,,,固体培养基 蛋白胨 ,,, 酵母提取物 ,, 氯化钠 ,,, 琼脂粉 ,,,加去离子水至,,,,,,，高压灭菌，溶液尚未冷却时，取出培养基，并轻轻转动以使溶解的琼脂能均匀分布于整个培养基溶液基溶液中，冷却至,,?左右时，加入不耐热的氨苄青霉素，然后铺制平板。,主要仪器设备 …„? „ ? 一 一 一 , 一 ,… 仪器 … ;来源及产地 一 ,, „ ，一, 普通冰箱 ,,,,,,,，德国 ,,,,?冰箱 ,,,,, ,;,,,,,,,;，美国 微量加样器 ,,,,,,，法国 ——一一…——一一————一 ,,,,,,,,,, ,,,,高速低温离心机 ,,,,,,,,,，德国中国协和医科大学临床医学专业毕业论文 中国人皮脂腺囊痛家系中角蛋白,,赫因突变的研究 ,,,,,,,,,高速离心机 ,,,,,,,,,，德国 ,,,一,,,高速台式离心机 , 上海 , ,,高性能,,,仪 , ,,,,,,,,，德国 , ,,,,,, ,,,,,,,,,型凝胶成像系统.