人胎回肠淋巴组织发生及IgM阳性B细胞的发育

文章编号: 1000�5404 ( 2011) 05�0493�04 论著 人胎回肠淋巴组织发生及 IgM阳性 B细胞的发育 胡 � 蓉,苏 � 敏, 黄 � 悦,李 � 红,姜俸蓉, 许庭良 � � ( 550004贵阳,贵阳医学院组织学与胚胎学教研室 ) � � [摘要 ] � 目的 � 探讨人胎回肠淋巴组织的发生及 IgM 阳性 B细胞在人胎回肠的分布、定位及发育。 � 收集 2003年 1月至 2005年 12月贵阳市各医院妇产科因流产等终止妊娠的 9 ~ 28周人胎回肠标本 30例, 男 12例、女 18例。 采用 HE染色观察人胎回肠淋巴组织发生, SABC法染色显示 IgM 阳性 B细胞, 并用 B ioM ias29图像分析软件对免疫反应 阳性细胞进行计数, 有关数据作统计学分析。结果 � 胎龄 9周时少量淋巴细胞分布于回肠上皮外的间充质内, 其中部分 细胞表达膜表面 IgM。胎龄 17周时固有层内淋巴组织局部聚集形成孤立淋巴小结,小结内含有较多 IgM 阳性 B细胞。自 24周起, 人胎回肠可见典型的集合淋巴小结。 IgM阳性 B细胞主要分布于淋巴小结, 少量弥散分布在固有层结缔组织或 绒毛上皮内。细胞计数显示 9~ 12周人胎回肠 IgM阳性 B细胞数量为 ( 12. 80 � 5. 72)个,随胎龄增加至 25~ 28周人胎回 肠 IgM 阳性 B细胞达 ( 201. 30 � 36. 35)个,各胎龄组间比较差异显著 (P < 0. 05)。结论 � 24周人胎回肠壁淋巴组织结构 基本发育成熟; 人胎回肠具有潜在的 IgM 合成和释放能力,对胎儿肠道免疫功能的建立和健全起着重要作用。 � � [关键词 ] � IgM; B细胞; 淋巴组织;发生; 免疫组织化学;回肠;人胎 � � [中图法分类号 ] � R329. 1; R392. 12; R322. 45� � [文献标志码 ] � A [基金项目 ] � 贵州省教育厅基金 ( 2002116) [通信作者 ] � 苏 � 敏, 电话: ( 0851) 6908567, E�ma i:l summ30@ 163. com Genesis of lymphoid tissue and developm ent of IgM �positive B cells in human fetal ileum Hu Rong, SuM in, Huang Yue, L iH ong, Jiang Feng rong, Xu T ing liang ( Depa rtm en t of H isto logy and Embryology, Gu iyang M ed ica l College, Gu iyang, Guizhou P rov ince, 550004, Ch ina) � � [Abstract ] � Objective� To study genesis o f lympho id tissue and distribution, loca lization and develop� men t o f IgM �posit ive B ce lls in hum an fetal ileum. Methods� Human fetus spec imens from term inated preg� nancies, 12 males and 18 females w ith gestat iona l ages o f 9 - 28 w eeks, w ere co llected from hosp ita ls in Gu iyang, Ch ina, between Jan. 2003 andDec. 2005. A ll pregnantw omen w ere informed of the purpose of th is study and the protoco l w as approved by the E thics Comm ittee of Guiyang M edical Co llege. HE sta in ing w as adopted to observe the genesis o f lymphoid tissue in human feta l ileum. IgM �posit ive B cells w ere detected by immunoh istochem ical SABC staining, and counted by B ioM ias 29 image analysis so ftw are. R elevant data w ere statist ically ana lyzed. Results� In the ilea of 9�week fetus specimens, a small amount o f lymphocy tes w ere observed in the mesenchyme out of epithelia, part o fw h ich expressed m embrane IgM. In the ilea o f 17�week fetus specimens, lam ina propria lymphocytes aggregated to fo rm so litary lympho id nodules w ith an increased amount of IgM �posit ive B cells. In the ilea o f24�week and older fetus specimens, typica lPeyer� s patches cou ld be observed. IgM �posit ive B ce lls ex isted m ain ly in lympho id nodules and sporad ica lly in lam ina propria connective tissue or chorion ic ep ithelium. C ell count ing resu lts show ed that IgM �positive B cells in human feta l ilea increased from 12. 80 � 5. 72 in 9- 12 w eek to 201. 30 � 36. 35 in 25- 28 w eek w ith statistically significant difference (P < 0. 05) . Conc lusion� Lympho id tissue of hum an fetal ileum wall is nearlym ature at 24 w eeks o ld. Hum an feta l ileum can po tent ia lly synthesize and release IgM that is impo rtant for constructing and impro� v ing fetus intestinal immun ity. � � [Key words ] � IgM; B ce l;l lympho id t issue; genesis; immunoh istochem istry; ileum; fetus Supported by the Foundation of Gu izhou E du cat ion Departm ent ( 2002116) . C orrespond ing au thor: SuM in, T e:l 86�851�6908567, E�m ai:l summ 30@ 163. com � � 肠道是机体免疫系统与外来抗原、微生物较早接 触的部位,其中回肠淋巴组织丰富,在肠道黏膜免疫屏 障中发挥着重要作用 [ 1- 2] , 肠壁内淋巴细胞是发生免 疫应答的主要免疫细胞。近年来淋巴细胞的发育越来 越受到学者们的关注 [ 3]。关于人胎回肠淋巴组织的 发生孔令平等 [ 4]认为 19周时回肠开始出现孤立淋巴 493 第 33卷第 5期 2011年 3月 15日 � � � � � 第 � 三 � 军 � 医 � 大 � 学 � 学 � 报 ACTA� ACADEM IAE� MEDICINAE� M ILITARIS� TERT IAE� � � � � Vo.l 33, No. 5 M ar. 15� 2011 小结, 而集合淋巴小结于 21周出现。本课题组的研究 表明, 9周人胎肠系膜淋巴结 [ 5]和阑尾 [ 6]内有 B细胞 迁入, 与此同时,回肠壁已有 T细胞迁入 [ 7] ,回肠黏膜 局部的细胞免疫功能就已开始建立。在此基础上, 我 们用 B细胞抗原受体 ( B ce ll antigen recepeter , BCR ) 即 B 细胞膜表面免疫球蛋白 ( surface membrance immunog lobu lin, m Ig)来标记 B细胞, 因 IgM受体在功 能成熟和未成熟的 B细胞膜上皆有表达 [ 8- 10] , 故我们 从形态学角度初步探讨人胎回肠淋巴组织的发生及其 IgM阳性 B细胞的发育情况, 从而为胎儿回肠局部体 液免疫功能的建立和肠道黏膜免疫屏障的完善提供形 态学资料。 1� 材料与方法 1. 1� 标本收集和切片制备 � � 胎儿标本来自 2003年 1月至 2005年 12月贵阳市各医院 妇产科因流产等终止妊娠的 9 ~ 28周胎儿 30例 (每例标本均 征得孕妇本人同意 ), 男 12例、女 18例, 平均年龄 18周, 根据 顶臀长 ( crow n�rum p leng th, CRL ), 按 Patten结合末次月经 确定胎龄, 9~ 12周 5例, CRL为 39. 0~ 79. 0 mm; 13 ~ 16周 7 例, CRL为 91. 0 ~ 137. 0 mm; 17~ 20周 6例, CRL为 147. 0 ~ 185. 0 mm; 21~ 24周 6例, CRL为 197. 0~ 230. 0 mm; 25~ 28周 6例, CRL为 240. 0~ 270. 0 mm。取各例回肠标本, 用 10%甲醛 溶液固定, 经乙醇梯度脱水, 透明, 石蜡包埋, 载玻片经镉矾�明 胶处理, 4 �m连续切片、贴片。 1. 2� HE染色和免疫组织化学染色 � � 免疫组织化学 SABC法染色主要步骤如下: 切片脱蜡下行 入水, 入 3% H 2 O 2 10 m in, 蒸水洗 2 m in � 3次, 热抗原修复 10 m in, 正常兔血清 ( 1�10)室温下 20 m in, 一抗 ( IgM 1�400) 4 � 过夜, PBS洗 2 m in � 3次,生物素化兔抗山羊 IgG 37 � 孵 育 20 m in, PBS洗 2 m in � 3次, SABC液 37 � 孵育 20 m in, PBS 洗 5 m in� 3次, DAB�H2O2液显色, 中性树胶封固。阴性对照: 用 PBS缓冲液代替一抗,余步骤同前。鼠抗人 IgM 单克隆抗体 ( m ousem onoc lona l antibody anti�hum an IgM ) 和 SABC免疫组化 试剂盒由武汉博士德生物制药公司提供。 1. 3� 细胞计数 � � 每胎龄段标本随机取 5例, 各例均取非连续切片 3张, 每 张切片间隔 36�m以上, 在 40倍物镜下各例随机选取不重叠 的 5个视野, 应用 B iom ias 29图像分析系统分别计数每个视野 内的 IgM 阳性 B细胞数。 1. 4� 统计学分析 � � 数据以 �x � s表示, 采用 SPSS 11. 5统计软件进行单因素方 差分析, 组间两两比较用 q检验。 2� 结果 2. 1� 人胎回肠淋巴组织的发生 � � 胎龄 9周时, 回肠黏膜上皮为复层柱状, 上皮外的间充质 内可见少量淋巴细胞 (图 1A ), 散在分布或聚集成小群。 12周 时, 可见短锥形的绒毛, 上皮为单层柱状, 可见杯状细胞, 而黏 膜肌尚未形成完整的环形, 黏膜和黏膜下层分界不清,其结缔 组织内淋巴细胞数量仍较少 (图 1B )。 15周时, 回肠淋巴细胞 仍然散在分布于黏膜和黏膜下层结缔组织中 (图 1C)。至 17 周, 回肠壁淋巴细胞数量增多较明显, 在固有层内聚集成孤立 淋巴小结 (图 1D )。24周时,回肠固有层和黏膜下层结缔组织 内大量淋巴细胞聚集构成典型的集合淋巴小结 (图 1E ), 小结 中央未见生发中心, 少量淋巴细胞弥散分布。至 28周, 淋巴小 结仍为初级淋巴小结 (图 1F )。 2. 2� IgM阳性 B细胞在人胎回肠的分布和定位 � � 胎龄 9周时, 回肠内可见 IgM阳性 B细胞 (图 2A ) ,数量较 少, 单个散在分布,主要定位于上皮外的间充质内;棕褐色阳性 反应产物位于细胞膜上或细胞质内,不连续, 反应较弱。12周, 回肠 IgM 阳性 B细胞阳性反应较强, 细胞成群分布, 位于绒毛 中轴或深部结缔组织内 (图 2B )。 15周 ,回肠壁内 IgM 阳性 B 细胞渐增多 ,散在分布 (图 2C)。 17周, 回肠 IgM 阳性 B细胞于 固有层内集聚形成小结状 (图 2D ) ,绒毛上皮内也有少量阳性 细胞浸润。 24周, 回肠壁 IgM阳性 B细胞数量明显增多, 除散 在分布外, 大量阳性细胞参与构成体积较大的淋巴小结 (图 2E)。 28周, 淋巴小结内聚集了更多的 IgM阳性 B细胞 (图 2F )。 2. 3� 阳性细胞计数及统计学结果 � � 随胎龄增长, 回肠内 IgM阳性 B细胞数量逐渐增加 [ 9 ~ 12 周: ( 12. 80 � 5. 72)个; 13 ~ 16周 ( 26. 00 � 10. 72)个; 17 ~ 20 周 ( 65. 20 � 21. 59)个; 21~ 24周 ( 143. 60 � 26. 81)个; 25~ 28 周 ( 201. 30 � 36. 35)个 ] ,差异有统计学意义 (P < 0. 05)。 3� 讨论 � � 肠道黏膜免疫系统是机体免疫系统内最大且最为 复杂的部分 [ 11] , 它由肠相关淋巴组织组成 ( gut�associ� ated lymphoid tissue, GALT ), 包括肠壁的弥散淋巴组 织、散在分布于黏膜上皮及固有层内的淋巴细胞、孤立 淋巴小结、肠系膜淋巴结以及回肠的集合淋巴小结 ( peyer patches)等。肠道黏膜免疫系统具有完善的免 疫反应机制和严格的免疫调控机制, 在机体与外环境 间黏膜稳态的建立和维持上发挥重要作用。回肠由于 淋巴组织丰富,在肠道黏膜免疫系统中的作用不容忽 视。回肠的集合淋巴小结是免疫应答的主要诱导部 位 [ 12- 13 ] ,淋巴小结主要由大量 B细胞构成, B细胞在 淋巴小结诱导后分化成熟, 并移行到黏膜效应部位, 即弥散淋巴组织和散在分布的淋巴细胞,通过分泌抗体 发挥体液免疫应答功能 [ 14- 16]。由此可见,胎儿回肠淋 巴组织的发生与 B细胞的发育在一定程度上可以反映 胎儿肠道黏膜免疫系统尤体液免疫功能的建立情况。 � � B细胞通过形成抗原特异性免疫球蛋白, 在 B细 胞的发育、存活和选择激活上起了关键的作用。不成 熟 B细胞,细胞表面表达穿膜 IgM,成熟 B细胞 IgM和 494 第 33卷第 5期 2011年 3月 15日 � � � � � 第 � 三 � 军 � 医 � 大 � 学 � 学 � 报 ACTA� ACADEM IAE� MEDICINAE� M ILITARIS� TERT IAE� � � � � Vo.l 33, No. 5 M ar. 15� 2011 A: 9周; B: 12周; C: 15周; D: 17周; E: 24周; F: 28周 � � � 示初级淋巴小结; � 示淋巴细胞 图 1� 不同胎龄人胎回肠 HE染色观察 A: 9周; B: 12周; C: 15周; D: 17周; E: 24周; F: 28周 � � �示 IgM阳性 B细胞; � 示集合淋巴小结 图 2� 免疫组化 ( SABC )显示 IgM阳性 B细胞在不同胎龄人胎回肠的分布 IgD共存。文献 [ 17]报道 7. 5周的人胚肝内就有免疫 球蛋白合成的最早表现, 12周胎儿血流中的 B细胞已 有 IgM受体表达, 发生宫内感染时, 抗原与此受体结 合, B细胞分裂形成分泌 IgM的浆细胞, 对付抗原。本 实验研究结果显示,人胎 9周回肠内可见 IgM阳性 B 细胞,提示在消化道原基建立的同时, B细胞已开始从 胎儿肝脏迁移到回肠壁间充质内, IgM受体的表达为 B细胞在回肠内的存活和发育奠定了必要的条件。这 一结果与我们之前报道人胎肠系膜淋巴结和阑尾内 IgM阳性 B细胞出现的时序一致, 因此,我们推测 IgM 受体在肠道相关黏膜免疫系统的表达基本同步。回肠 和阑尾等管壁内 IgM受体的表达早于胎儿血液可能与 495 第 33卷第 5期 2011年 3月 15日 � � � � � 第 � 三 � 军 � 医 � 大 � 学 � 学 � 报 ACTA� ACADEM IAE� MEDICINAE� M ILITARIS� TERT IAE� � � � � Vo.l 33, No. 5 M ar. 15� 2011 研究技术敏感性的提高有关。结合我们观察到 T细 胞也是 9周迁入回肠壁,我们认为 T、B细胞是同时迁 入回肠内,共同参与回肠黏膜免疫屏障的建立。 � � 我们通过 HE染色观察到, 17周时回肠壁可见单 个分布的淋巴小结,免疫组织化学染色亦证实 17周有 大量 IgM阳性 B细胞聚集形成的小结状结构,这一结 果较孔令平等 [ 4]报道 19周时回肠开始出现孤立淋巴 小结的时间要早, 而集合淋巴小结出现的时间我们观 察到是在 24周, 比孔令平等 [ 4]报道的 21周略晚。淋 巴小结出现时序的差异可能是由于实验方法的不同和 标本的个体差异等所致。淋巴小结是体液免疫功能的 重要形态单位,我们前期的研究发现肠系膜淋巴结和 阑尾内淋巴小结皆在胎龄 23周时形成,提示回肠的体 液免疫应答能力可能早于也强于阑尾和肠系膜淋巴 结,这可能是由于生理特征决定它将更早、更多地接触 到抗原所决定的。从淋巴小结在回肠内的发育我们可 以看出,胎儿回肠淋巴小结并不是发生的开始就以集 合淋巴小结的形式存在,而是先形成孤立淋巴小结,再 随胎儿发育逐步形成集合淋巴小结的。 24周时,集合 淋巴小结形成,胎儿回肠的体液免疫应答能力正逐步 健全。细胞计数结果显示,随胎龄增加 IgM阳性 B淋 巴数量逐渐增多 (P < 0. 05), 也提示了胎儿回肠的体 液免疫功能随胎龄增长而逐渐完善。 参考文献: [ 1] 束弋, 王健伟.肠道黏膜免疫系统的研究进展 [ J ]. 微生物与感 染, 2007, 2( 1 ) : 59- 62. [ 2 ] 张彤, 戴炳华. 淋巴器官发育的研究进展 [ J] . 国外医学: 免疫学 分册, 2005, 28 ( 1) : 55- 59. [ 3] 张毓. 淋巴细胞的发育、分化、激活、凋亡及其调节 [ J] .科学观察, 2009, 4( 4 ): 37. [ 4] 孔令平, 朱清仙, 曾慧红, 等. 胚胎小肠 S�100+树突状细胞的组 织分布 [ J] .解剖学杂志, 2004, 27( 2 ) : 169- 171. [ 5] 李红, 苏敏, 胡蓉, 等.人胎肠系膜淋巴结组织发生及相关 T、B细 胞的发育 [ J] . 解剖学杂志, 2009, 32( 2 ): 183- 186. [ 6 ] 李红,苏敏,杨宇, 等.人胎阑尾淋巴组织及 T、B淋巴细胞的发育 [ J] .第三军医大学学报, 2010, 32( 16 ) : 1766- 1769. [ 7] 苏敏, 胡蓉, 李红, 等. CD3和 CD8免疫反应阳性细胞在人胎回肠 的发育 [ J] .世界华人消化杂志, 2009, 17( 35 ) : 3606- 3610. [ 8] 程小星, 蹇锐.浆细胞发育基因表达谱的建立及部分基因表达的 调控 [ J] .第三军医大学学报, 2004, 26( 15 ) : 1333- 1335. [ 9] 李军林, 韩骅. B淋巴细胞发育的基因调控 [ J] .细胞与分子免疫 学杂志, 2005, 21( Supp l): S34- S36. [ 10 ] 孙剑, 沈倍奋. B淋巴细胞的成熟 [ J ]. 中国免疫学杂志, 2006, 22( 7) : 682- 683, 687. [ 11 ] Mow at A M. Anatom ical basis of toleran ce and imm un ity to intestin al ant igens[ J]. N at Rev Imm uno,l 2003, 3( 4) : 331- 341. [ 12 ] 熊建美, 李贞, 李务荣, 等. 人小肠各段粘膜上皮及固有层淋巴 细胞分布规律的研究 [ J] . 泰山医学院学报, 2006, 27( 6) : 532- 533. [ 13 ] N ewb erry R D, LorenzR G. Organ iz ing a mu cosal defen se[ J ]. Im� m unolRev, 2005, 206: 6- 21. [ 14 ] 范骏. 肠道黏膜免疫 [ J] . 国际免疫学杂志, 2006, 29( 2 ): 111- 115 . [ 15 ] S tenstadH, Sven sson M, CucakH, et a l. D ifferen tial hom ing m echa� n ism s regulate reg ional ized effector CD8alph abeta+ T cell accum ula� tion w ith in th e sm all in test ine[ J] . Proc Natl Acad SciU S A, 2007, 104( 24 ): 10122- 10127. [ 16 ] 高娟, 李芳兰, 周一珺, 等. 不同发育时期大鼠小肠粘膜及派氏 结 T淋巴细胞发育活化的研究 [ J] . 中国免疫学杂志, 2009, 25 ( 8) : 678- 683. [ 17 ] 杜涛, 方群.胎儿淋巴细胞的发育和功能 [ J] . 国外医学: 妇产科 学分册, 2005, 32 ( 2) : 94- 97. (收稿: 2010�09�21;修回: 2010�11�26 ) (编辑 � 王 � 红 ) � � (上接 488页 ) 2� 讨论 � � 心包积液是临床上很常见的一种临床症状,易于和其他疾 病相混淆。引起心包积液的病因较多 ,诊断较为困难,尤其是 以心包积液为首发症状的肺癌患者,肺部症状常不典型或因心 包积液征象突出掩饰了肺恶性肿瘤的临床症状 [1]。这些患者 的肺部病变多靠近纵隔部位,胸部 CT也不易发现。若临床医 生诊断经验不足, 仅考虑为心血管相关疾病, 就容易造成误诊。 当患者有心包积液时, 如同时发现肺部结节、胸腔积液、纵膈或 锁骨骨淋巴结肿大等, 应考虑肺癌伴心包积液的可能。应尽快 完善辅助检查, 行心包积液穿刺术, 在迅速缓解患者症状的同 时进行细胞学检查以明确心包积液中是否有异型细胞, 进而明 确心包积液中癌细胞的组织学来源, 避免误诊、误治。心包积 液的组织学诊断和鉴别诊断中, 免疫组化发挥着重要作用, 其 中 TTF�1对肺腺癌的敏感性和特异性都较高 [ 3]。本例心包积 液的免疫表型 CK7和 TTF�1阳性可确定为肺部来源, 而 CDX�2、 CK20和 V illin阴性可排除胃肠道来源的恶性肿瘤, CK5 /6、CR、 M C和WT1阴性可排除恶性间皮瘤的可能。肿瘤性心包积液 是恶性肿瘤晚期的并发症之一,明确诊断后应尽快进行放化疗 以延长患者的生存时间和生存质量。 参考文献: [ 1] Parkin D M, Bray F, Ferlay J, e t al. G loba l can cer statistics[ J]. CA Can cer J C lin, 2005, 55( 2 ) : 74- 108. [ 2] 苏学英,蒋莉莉, 李甘地, 等. 浆膜腔积液转移性肺腺癌细胞中 TTF�1的表达 [ J]. 临床与实验病理学杂志, 2004, 20 ( 6 ) : 706- 708. (收稿: 2010�11�15;修回: 2011�01�12 ) (编辑 � 栾 � 嘉 ) 496 第 33卷第 5期 2011年 3月 15日 � � � � � 第 � 三 � 军 � 医 � 大 � 学 � 学 � 报 ACTA� ACADEM IAE� MEDICINAE� M ILITARIS� TERT IAE� � � � � Vo.l 33, No. 5 M ar. 15� 2011