【doc】 两株禽源野生动物冠状病毒分离株S1基因特性的研究

【doc】 两株禽源野生动物冠状病毒分离株S1基因特性的研究 两株禽源野生动物冠状病毒分离株S1基因 特性的研究 第27卷第5期 2005年9月 中国预防兽医 ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine Vo1.27.No.5 Sep.2005 两株禽源野生动物冠状病毒分离株s1基因特性的研究 付家栋,张桂红,廖明,任涛,辛朝安 (华南农业大学兽医学院,广州51064o) 摘要:本研究从野生禽类动物孔雀和鹧鸪的喉气管拭子中各分离到1株冠状病毒,经RT-PCR检测成功扩增出sl基 测序后和GenBank上报道序列进行同源性比较以及系统发育树分析,发现这两株病毒和鸡传染性支气管炎病毒存在密 切的亲源关系. 关键词:离;野生动物;冠状病毒;S1基因 中图分类号:$852.659.7文献标识码:A文章编号:1008—0589(2005)05—0380-,. StudyontheSlgeneofthetwoisolatedstainofcoronavirusfromthewildbirds . 兀JJia—dong,ZHANGGui—hong,LIAOMing,RENTan,XINChao-an (CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUmversity,Gusl/Igzhou510642,China) Abstract:Twocoronaviruswereisolatedfromthelaryngtracheswabsofwildbirdsinthisstudy.S1genewassuccessfullyamplified fromthevirusesafterdetectionofRT-PCRandsequenced.Homologycomparison山sequencespublishedinGenBankandanalysisof sequen~,thephylogenetictreesshowedthatthreewascloserelationbetweenthesetwovirusesandinfectiousbronchitisvirusofchick— ens. Keywords:avian;wildanimal;coronavirus;S1gene *Correspondingauthor 冠状病毒广泛存在于自然界,可感染多种动 物,常引起被感染动物发生明显的呼吸道症状或 呕吐,腹泻等消化道症状,严重的可引起被感染动 物发生死亡l1j.2003年发生在我国的非典型肺 炎病毒(SARS.CoV),传播迅速,波及范围广大,严 重危害人民群众身体健康,给社会,经济带来巨大 影响【2J.经WHO认证SARS病原为一种新型冠 状病毒,通过对SARS基因组进行遗传学分析和 序列对比揭示:它和已知的其它冠状病毒同源性 不高,比较而言,其和牛冠状病毒及鼠肝类病毒同 源性最高,而和人类冠状病毒同源性较低,因而推 测SARS.CoV可能为一种非人源性病毒,其源头 很可能来自于某种动物_3.4j.本研究通过对广东 省多个地区送检的1000多份家禽及禽类野生动 物的喉气管拭子及组织样品进行病毒分离鉴定, 分别从孔雀和鹧鸪各分离到一株冠状病毒.通过 RT.PCR反应并对阳性扩增片段克隆测序,分析其 作者简介:付家栋,男,硕士研究生 *通讯作者 收稿日期:2004—01—12 序列和GenBank上报道序列同源性关系及序列系 统发育树情况,发现这两株病毒和鸡传染性支气 管炎病毒存在密切的亲源关系,现将研究结果报 道如下. 1材料和方法 1.1IBV病毒株孔雀喉气管拭子分离株,简写 为KQ6,鹧鸪喉气管拭子分离株简写为S14,由农 业部养禽与禽病防治国家重点开放实验室分离, 鉴定. 1.2试剂RNA抽提试剂盒?(华美公司), dNTP(1OmoLeach),DEPC(BBI,购自上海生工), AMLV逆转录酶,EXTaq酶,pMD18.T载体,DNA MarkerDI2000(大连Takara公司),3SSpinPlasmid MiniprepKit,3SSpinAgaroseGelDNAPurification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司),其余常用 化学试剂均为国产分析纯产品. 1.3引物参考GenBank公开序列设计一对 引物,S1.F:5‟.TIEAAAACTGAACAAAAGACA. 3‟,S1.R:5‟.CATAACI‟AACATAAGGGCAAT. 3‟.由上海博亚公司合成. 1.4参考毒株及其GenBank中的序列号M41 第5期付家栋,等.两株源野生动物冠状病毒分离株s1基因特性的研究381 (M21883),TlX4(AY189157),QXIBV(AF193423),BJ (AY319651),Ca199(AY514485),Cu—T2(L149858), Gray(AF394180),H52(AF352515),Ark99 (M99482). 1.5病毒的增殖取分离纯化后的毒株KQ6和 S14按lO4EIDso/胚,尿囊腔接种各10枚10日龄 SPF鸡胚,37?培养.弃24h内死胚,培养48h后 将鸡胚一20?冻存过夜后,无菌收获尿囊液,分 装成小份后一20?备用. 1.6RNA提取及反转录取100病毒尿囊 液,用RNA抽提试剂盒?抽提病毒RNA,操作按 说明进行.提取的RNA溶于11.5DEPC水 后马上进行反转录.20反转录体系:45× AMVBuffer,2LlOmMdNTP,1L50pmoLpd(N) 6,10UAMVRTase,20URNasin,11.5RNA 液.混匀后42?水浴1h,一20?备用. 1.7反转录产物PCR采用25LPCR反应体 系:0.5上游引物(25pmoL),0.5fL下游引物 (25pmoL),2.5L10×PCRBuffer,2L2.5mM dNTP,1反转录产物,0.5EXTaq酶,最后加 灭菌三蒸水补平到25,混匀后进行PCR反应. 反应程序为94?5min后,94?1min,53? 1min,72?2min.进行30个循环,然后72?延 伸10min,一20?备用. 1.8RT-PCR产物检测取PCR产物5在1% 琼脂糖凝胶(EB浓度为0.5n1IJ)检测结果. 1.9基因克隆,测序经1.7反应验证无误后, 做100反应体系,用3SSpinAgaroseGelDNA PurificationKit试剂盒从胶内回收纯化RT-PCR产 物,然后进行TA克隆.采用10连接体系:1 pMD18一T载体,4回收产物,5连接液,4?连 接过夜.将连接产物转化感受态细胞TOPO10后 接种含100nagAmp的平板培养过夜.取平板上 的阳性菌落,做菌落PCR,方法同1.6.同时在含 100mgAmp的LB营养液中震荡培养.取2 PCR阳性菌用3SSpinPlasmidMiniprepKit抽提质 粒,进行质粒PCR.质粒PCR阳性的,取0.5 菌液送上海博亚公司测序. 1.10序列分析序列结果整理后进行Blast,与 GenBank公开序列进行多序列比较并选取国内外 多株代性毒株采用DNAstar序列分析软件分 析. 2结果 2.1S1基因全序列分析经过测序及序列整理 后得到两株病毒各自的S1高变区,从ATG起到S 前体蛋白裂解位点止的核苷酸序列.Ko6的s1 基因共1611bp,G+C%为35.88%,编码537aa, 18个潜在的N一糖基化位点.S14的S1基因共 1620bp,G+C%为35.49%,编码540aa,19个潜 在的N一糖基化位点.S1基因推导氨基酸序列 亲水性分析发现,两毒株S1蛋白前20个氨基酸 残基构成一段强疏水区域,推测为S前体蛋白信 号序列.两毒株S前体蛋白裂解位点的编码氨基 酸均为RRFRR.KQ6分离株相对于M41只发生 个别碱基的点突变.S14株相对于M41多处发生 了碱基的插入或缺失:在67位插入TCT,216插入 AIrA,245插入ATAATCAA,353位插入A,266位 插入G,350插入A,360位分别插入AG,362插入 TCT,420插入ATGG,429插入CT.在221—233缺 失ATI‟CATGGTGGT,236位缺失T,262位缺失A, 415-421缺失ATGGCC,TlX4和QX[BV也发生相似 突变,只是360位分别插入TC和AG.此外S14 还存在多处发生碱基的点突变.推导氨基酸序列 分析发现,相对于M41的25位点,鹧鸪分离株多 插入一个Ash(N),119位点插入了ely(G)+Ser (S). 5O瑚t26l柏l752?脚瑚2湖326硒D3枷嵇.5o蠡oo啪 图1S1基因推导氨基酸序列亲水性分析 Fig.1analysingtheinducinga/llinoacid.sequence 2.2S1基因核苷酸序列和GenBank公开序列核苷酸序列比较分析如图4所示,可以发现各毒 382fl【颅防兽l . 株s1基因核苷酸序列普遍存在碱基置换,插入或 缺失突变,推导氨基酸序列分析发现变异最集中 N端前26,52.148,246.293位氨基酸残基区域. KQ6和GenBank注册序列M41,H52,Ark99, Gray,QXIBV,Lx4,Cu.I”2,Ca199,BJ株S1基因核苷 酸序列同源性分别为99.6%,97.2%,74.8%, 78.8%,75.1%,74.9%,77.0%,76.9%, 74.3%,推导氨基酸序列同源性为98.7%, 95.0%,75.2%,76.5%,75.6%,74.7%, 74.9%,76.2%,73.6%,其和M41同源性最高; $14和上述毒株核苷酸序列同源性较低,依次为 79.8%,80.0%,74.6%,73.9%,85.0%, 2005年 84.3%,74.5%,73.5%,77.1%,推导氨基酸序 列同源性依次为78.8%,79.0%,75.6%, 72.0%,86.3%,85.2%,74.1%,76.1%, 77.0%,在其和QXIBV同源性最高;KQ6和S14 间的核苷酸序列同源性为80.1%,推导氨基酸序 列同源性为78.8%. 根据DNAstar分析,以上病毒大致可以分为 两个进化群系:Ark99,Cu.T2,Ca199为I群,其他 毒株为?群.?群又可进一步细分为A,B两个 进化亚群,其中KQ6,M41,H52为A亚群,QXIBV, Lx4,BJ,S14为B亚群. 17.9 1614121086420 图2sl基因核苷酸序列系统进化树分析 Fig.2PhylogenefictreeofaminoacidsofS1gene 3讨论 冠状病毒的S蛋白通常由两个亚基构 成[5,63,靠近N端的部分是形成球状结构的s1亚 基,靠近C端的为棒状结构的s2亚基.s蛋白主 要和病毒侵入宿主细胞的过程密切相关.S蛋白 前体在宿主细胞质中合成并被裂解成s1,s2两个 亚基,其裂解位点为保守的结构RRXRR[.S1亚 基主要诱导产生中和抗体,血清型特异性抗体和 血凝抑制抗体.因此s1亚基在冠状病毒研究中 具有重要意义. 本研究通过将KQ6和S14的S1基因和Gen. Bank上发表序列BLAST比较,发现与鸡传染性支 气管炎病毒具有高度同源性而和其他冠状病毒同 源性很低,特别与SARS.CoV更具有明显差异. 同时结合生物学特性鉴定结果(未发表),推测这 两株冠状病毒在基因型上应为鸡传染性支气管病 毒. 根据亲水性分析可以看出,两病毒株S1基因 前20个氨基酸都构成一段强疏水的区域,在推导 的信号肽切点上游一1位和一3位分别是中性的 小氨基酸A和c,这些结构符合传染性支气管炎 病毒信号肽的共同特征,因而可以推断:两毒株的 s蛋白前18个氨基酸残基为信号肽:KQ6信号肽 MIIvIPULV11JCVsAlALYD;S14信号肽ML GKSIk‟LVTILCALCSAlNIk3).信号肽主要作用是 引导新转译的S蛋白插入到内质网膜. IBV研究表明,其抗原变异部位主要集中在 S1糖蛋白,由于在S1蛋白前300个氨基酸残基最 易发生碱基的置换,插入或缺失突变,因而此区又 称为高变区_8J.在高变区内的变异主要集中在3 个区域:HVRI区N端第37,81氨基酸处,内有 两个亲水区,I-IVR?区第117,160氨基酸处为一 个疏水区,HVR?区第269,298氨基酸处,为一 个强亲水区,根据以前的研究推断这些区域都可 以成为S1蛋白的抗原决定簇,而抗原决定簇的特 异结构依赖于其中某些氨基酸,如果这些氨基酸 中一个发生改变就可以产生一个新的变异株.本 研究发现各毒株的S1基因核苷酸序列普遍存在 碱基置换或插入,缺失突变,推导氨基酸序列分析 一,一一呻 镐5 9: 0 9 1oo 0 0 -‟ 0 - : : 9 付家栋,等.两株源野L动物冠状病毒分离株sl基因特性的研究 V!K..一0×i ..As....….誓矗:…..F.S譬宰艚霉..L..LIpsGYI.IA…H.SRTPGH...TK.R. 乙...H........F..GY.E.,a00 .. K.......…P...I...FAN”?S..L..PI的.HI.I...R..…?F...7.L.H........P..Q.ib‟ .. ? 从........TNIV........SGSgS..L..FI.8GYI.:....~~CSGPSe.....!.S...R.L.....Y..,.... .F.Q..-,l‟ .. TAB........TS~I......F.SGFtS..L..LIFSGYI.1A...HS.~4FGH.P:.R:.H......... F...=:.,w--一:. ..V 口.........THF.......F.VGAGL.LP.L~G@I.:...RSVNSRPH..,....0.........FS..:0: a .…...Y…...........I{V.一.SL...QHS!.......…”...........,一?-.-.??一-一 .. K….S...0..EI........SSGSGS....:ABGHI.I......…‟S;:.F‟,.!.日 .................,......R.............I........‟.,,.P.......】{...........?q6 .. K....S......EI….....S$,3SGS.....IP?HI.I.....”“噶....,F....,F,...,‟ 8cA‟ljP?fK‟IRK‟.‟KAAfF‟ 88......?N.NI.KEF.?.... 4e qq 4ql 40— 40 q9l 91 48: 8‟ 日8j 488 5:OD‟,D:PE3LLATOY!:7‟31SDGF‟-‟PINS2LV~@ETIVY~%NS们盯 T跗LHN订TNNETC,KNPNPi ........N..........T..T..RE…....5…..LA.T....T.VSN.?..S口ibv . }:..D7......T.T.I..e......S „T口.. .....HS H『‟ .....i...HS. LS0 L.KE... - L? T ?m L „ t—1 ..…..????....???.????? qD ..…...L..T.Y..Y.V.N.S..Rsl‟ F0 ..?K 图3sl基因核苷酸序列比较.”*”代表碱基的缺失 Fig.3HomologyofthenucleotidesequenceofSIgene*deletionoftmse ....D..RA ?R块对这 两个分离株和GenBank上发布的国外株代表性毒 株S1基因进行同源性比较,发现KQ6相对M41 株没有任何碱基的插入或缺失,仅仅发生个别碱 基的突变,推测为M41的变异病毒.而S14则和 国内分离株QXIBV,Lx4,BJ处于同一进化群且亲 源性最高,而和M41为代表的Massachusetts(Mass) 血清型的毒株同源性较远.因而推测S14可能为 中国的IBV地方分离株. 参考文献: [1]殷震,刘景华.动物病毒学[M].第2版,北京:科技出版社. 1998. [2]狄飚,何丽娟,周端华,等.冠状病毒t571起广州地区严重急 性呼吸综合征(SARS)的主要病因[J].病毒,2003,19 (3):199.202. [3]秦鄂德,祝庆余,于曼,等.SARS相关病毒(BJOI株)的全序 列及其比较分析[J].科学通报,2003,48(11):l127.1134. [4]Coronavirusneverbefores帆inhumansistheCallseofsARs[J/ OLJ,2O03.hup://www.who.int/mediacentre/releases. [5JBinnsMM,BanmellME.Ca哪D,ela1.Cloningandse— queueing0fthegeneencodingthespikeproteinofthecoronavirus mv[jJ.JGenVirol,1985,66(4):719.726. [6]Cav日nagIID.StructuralcharacterizationofIBVglycoproteins[J]. 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