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土壤中微生物主要类群的分离

2017-10-14 13页 doc 108KB 39阅读

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土壤中微生物主要类群的分离土壤中微生物主要类群的分离 土壤微生物主要类群的分离、记数及形态特征比较 学院:生命科学与技术学院 专业:生物工程 学号:2009316007 姓 名:董鹏宇 指 导 教 师: 徐 军 韩 炎 摘要:本实验是微生物学综合性实验项目,包含了微生物学实验中的微生物的分离和纯化、微生物的选择性培养、平板菌落计数(即活菌计数)、培养基的制备、高压蒸汽灭菌、微生物主要类群的 [1]培养特征和形态特征、制片染色技术等。 本文记录了对采自校园附近农田的土样中微生物主要类群的分离和纯化等试验操作方法和结果。所采每克土样中几种不同类群微...
土壤中微生物主要类群的分离
土壤中微生物主要类群的分离 土壤微生物主要类群的分离、记数及形态特征比较 学院:生命科学与技术学院 专业:生物工程 学号:2009316007 姓 名:董鹏宇 指 导 教 师: 徐 军 韩 炎 摘要:本实验是微生物学综合性实验项目,包含了微生物学实验中的微生物的分离和纯化、微生物的选择性培养、平板菌落计数(即活菌计数)、培养基的制备、高压蒸汽灭菌、微生物主要类群的 [1]培养特征和形态特征、制片染色技术等。 本文了对采自校园附近农田的土样中微生物主要类群的分离和纯化等试验操作方法和结果。所采每克土样中几种不同类群微生物的含量分别为:细 866菌6.53×10个、放线菌7.79×10个、霉菌1.23×10个、自生固氮菌个,土壤中微生物种类的繁多和数量的庞大。培养基的种类和组分的不同可用于分离或富集不同的微生物。 关键词:分离 纯化 平板菌落计数 微生物的形态 1. 前言: 土壤中所含的微生物数量很大,尤以细菌居多。据估计,在每亩耕作层土壤中,约有霉菌150kg,细菌75kg,原生动物15kg,藻类7.5kg,酵母菌7.5kg。在每克耕作层土壤层,各种微生物含量之比大体有一个10倍系列的递减规律:细菌(,108)>放线菌(,107,孢子)>霉菌(,106,孢子)>酵母菌(,105)>藻类(,104)>原生动物(,103)。土壤中不同类型的细菌有不同的作用。有的能够固定空气中的氮元素,合成细胞中的蛋白质;有的能够分解农作物的秸秆,它们大多是异样菌。 微生物的稀释平板计数是根据在固体培养基上所形成的一个菌落,即是由一个单细胞繁殖而成,且肉眼可见的子细胞群体这一生理及培养特征进行的。也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时,首先将待测样品制成均匀的一系列不同稀释液,并尽量使样品中的微生物细胞分散开来,使成单个细胞存在(否则一个菌落就不只是代表一个菌),再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中,使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后,由单个细胞生长繁殖形成菌落,统计菌落数目,即可计算出样品中的含菌数。 在实验中通过配置不同浓度的培养基,用于所采集土壤样品中微生物的接种,经过培养后,进一步使用选择培养基对培养菌种进行培养,以达到分离各种微生物的目的。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。进行分离时常用的方法有:简易单细胞挑取法,平板分离法。本实验采用的是平板分离法,其是普遍用于微生物的分离与纯化的方法。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件,如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长,而抑制其他微生物生长的环境,从而淘汰一些不需要的微生物。 在进行纯化及培养后,对其所形成的菌落形态进行观察,发现许多菌落呈现的颜色、形态、透明程度,均有所不同,从而进一步进行革兰氏染色后观察,确定微生物的种类,可见培养菌种既有阴性又有阳性,从菌落计书数的结果来看,每种平板中的菌落数值均较大,由此可见土壤中微生物种类繁多。 2.材料与方法 2.1材料 2.1.1土样:以无菌方式采于学校内小园林,置于无菌容器中,待检 2.1.2培养基 [1]2.1.2.1营养琼脂(牛肉膏蛋白胨固体培养基,培养细菌): 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g 琼脂 15-20g 水 1000ml 1 PH 7.0-7.2 121?灭菌20min。 [1]2.1.2.2高氏一号固体培养基(培养放线菌): 可溶性淀粉 20g KNO 1g 3 NaCl 0.5g KHPO 0.5g 24 MgSO 0.5g 4 FeSO 0.01g 4 琼脂 20g 水 1000mL PH 7.2-7.4 配制时,先加少量冷水,将淀粉调成糊状,倒入煮沸的水中,在火上加热,边搅拌边加入其他 成分,溶化后,补足水分至1000mL。 121?灭菌20min。 灭菌后,在100ml培养基中加入10%酚溶液5滴(作为抑制剂,以抑制细菌的生长),制备平板 备用。 [1]2.1.2.3查氏固体培养基(培养霉菌): NaNO 2g 3 KHPO 1g 24 KCl 0.5g MgSO 0.5g 4 FeSO 0.01g 4 蔗糖 30g 琼脂 15-20g 水 1000mL PH 自然 121?灭菌20min。 [1]2.1.2.4马丁氏培养基(分离真菌): 葡萄糖 10g 蛋白胨 5g KHPO 1g 24 MgSO?7HO 0.5g 42 33.4mg/L孟加拉红 100mL 琼脂 15~20g PH 自然 蒸馏水 800mL 121?灭菌30min。 临用前加入0.03,链霉素稀释液100mL,使每毫升培养基中含链霉素30ug。 2.1.2.5无菌水:装有90ml蒸馏水和数拾粒玻璃珠的250ml锥形瓶一只,装有9ml蒸馏水的 18×180mm试管数支;121.3?,20分钟灭菌,备用 2.1.3染色液 [1]2.1.3.1革兰氏染色液 草酸铵结晶紫染液,卢戈式碘液,95,乙醇,番红复染液。 2 [1]2.1.3.2 0.1%美蓝(用于放线菌菌丝形态观察) [1]2.1.3.3乳酸石炭酸棉蓝液(用于霉菌形态观察) 石炭酸 10g 乳酸(相对密度1.21) 10mL 甘油 20mL 蒸馏水 10mL 棉蓝 0.02g 将石炭酸加在蒸馏水中加热溶解,然后加入乳酸和甘油,最后加入棉蓝,使其溶解即成。 2.2方法 2.2.1制备土壤稀释液(细菌的分离) 以无菌操作,称取样品1g,加入装有99mL无菌水的锥形瓶中,振荡10-20min,使土样与水 -2-3充分混合,即成10土壤稀释液,然后用无菌移液管吸取9mL无菌水的试管内,制成10的稀释液将此移液管在试管内反复吸冲三次,然后取出移液管,并将其通过火焰,再插入原来包移液管的纸 -3套内,以备再用,振荡10的稀释液试管,再从纸套取出原来的移液管插入已混匀的试管内,再吹 -3-4洗三次,然后吸出1mL10的稀释液至另一只装有9mL无菌水的试管中,制成10稀释液。用同样方 -5-6-6法再制成10、10的稀释液,稀释完毕后,可用原来的移液管,从菌液浓度最小的10的稀释液开 -6-6-5-4始吸取1mL10的稀释液,加到相应编号10的无菌培养皿内,以相同方法分别吸取1mL10、10 -5-4的稀释液加到相应编号为10、10的无菌培养皿内,整个分离过程见下图: 2.2.2制备及涂布平板 将灭菌后的培养基趁热倒于平板中,约15-20mL即可,平置于桌面上使其冷却,整个过程要在火焰边进行,防止杂菌污染。每种培养基平板各需九个。高氏一号固体培养基用于分离放线菌,在其中三个培养基平板中各加入0.2mL10-6浓度的土壤稀释液,再取三个平板各加入0.2mL 10-5浓度土壤稀释液,另外三个加入0.2mL 10-4浓度土壤稀释液。 培养及冷却后即可用移液管加土壤稀释液,加好土壤稀释液后将浸泡于95%酒精中的涂布棒取出,灼烧灭菌,冷却后将土壤稀释液均匀涂布于培养基表面,静置10-15min。标签上要写明培养基名称,土壤稀释液浓度,小组,实验日期。 2.2.3培养 3 平板准备好后将其倒置于培养箱中进行培养。营养琼脂固体培养基平板倒置于37?培养箱中培养2,3天,高氏一号固体培养基平板倒置于28?培养箱培养5,7天,查氏固体培养基平板和马丁氏固体培养基平板倒置于28?培养箱培养3,5天 2.2.4菌落计数 培养结束后,根据不同类群的微生物的菌落特征,分别在不同的培养基平板上统计相关类群的微生物菌落。营养琼脂固体培养基平板统计细菌的菌落;高氏一号固体培养基平板统计放线菌的菌落;查氏固体培养基平板和马丁氏固体培养基平板统计霉菌的菌落。 由下式计算每克土壤中相关微生物的菌落形成单位(cfu): 个/克=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5 2.2.5挑单菌落 从不同的培养基平板上,选取细菌、放线菌和霉菌各三个菌落分别转接到营养琼脂、高氏一号、查氏培养基斜面中,每个菌落接两支斜面试管,编号标记,分别置培养箱培养,备用 2.2.6细菌的革兰氏染色和形态观察 对从2.2.5中选出的细菌分别做革兰氏染色,观察记录三株细菌的革兰氏染色结果和个体形态 2.2.7放线菌的插片培养和形态观察 对从2.2.5中选出的放线菌分别做平板划线、插片培养,培养后观察记录三种放线菌的菌丝形态。每个平板中,以约45?角将1-2片无菌盖玻片斜插入平板上第一次划线的部位。 2.2.8霉菌的点植培养和形态观察 对从2.2.5中选出的霉菌分别做点植培养,每个平板上点植接种三个点,培养后制片,观察、记录三种霉菌的菌丝和产无性孢子的子实体的形态 3.结果 3.1土壤样品中细菌、放线菌、霉菌的菌落形成单位(cfu)见表1、表2、表3: 表1 细菌 -5-6-7稀释度 10 10 10 1 74 50 24 各重复的2 83 舍 40 菌落数 3 96 67 30 789cfu/克 4.22×10 2.93×10 1.62×10 8平均(cfu/克) 6.53×10 表2 放线菌 -4-5-6稀释度 10 10 10 1 23 4 3 各重复的2 22 7 舍 菌落数 3 38 6 舍 667cfu/克 1.38×10 7×10 1.5×10 6平均(cfu/克) 7.79×10 表3 4 霉菌 -3-4-5 10 10 稀释度 10 培养基 2.1.2.3 2.1.2.4 2.1.2.3 2.1.2.4 2.1.2.3 2.1.2.4 1 80 2 18 0 1 各重复的2 165 3 22 3 8 菌落数 3 135 3 23 0 3 55566cfu/克 6.33×10 1.33×10 1.05×10 5×10 2×10 3.2分离的三株细菌的革兰氏染色结果及形态见表4: 表4 菌株编号 革兰氏染色结果 菌体形态 X-C-4-01 G,(红色)短棒状 X-C-4-02 G,(紫色)杆状 X-C-4-03 G,(红色)短棒状 3.3分离的放线菌的形态见图1: 图1 3.4分离的霉菌的形态见图2: 5 图2 土壤中的霉菌 4.讨论 4.1结果 土壤中微生物以细菌数量最多,为几百万个/克土至几亿个/克土,有各种生理类群,营养类型多属异养型,鉴别染色多为革兰氏阳性。放线菌含量为几万个/克土至几百万个/克土,但其生物量不比细菌低,因为菌丝体积较大。土壤中真菌含量为几千个/克土至几十万个/克土,而其生物量常比细菌的大。酸性土壤中真菌较多。藻类在土壤中的含量不及微生物总数的1,,生长在潮湿土壤 6 的表层。原生动物在富含有机质的土壤中较多。 土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说,在土壤表面,由于日光照射及干燥等因素的影响,微生物不易生存,离地表10 cm,30 cm的土层中菌数最多,随土层加深,菌数减少。 微生物的生长繁殖受外界环境因素的因素的影响,环境条件适宜时微生物生长良好,环境条件不适宜时微生物生长受到抑制,甚至导致微生物死亡。物理、化学、生物及营养等不同环境因素影响微生物生长繁殖的机制不尽相同,而不同类型微生物对同一环境因素的适应能力也有差別。选用不同的培养基含有微生物生长所需的不同营养物质,从而分离出不同种类的微生物。 4.2结果 培养基中的某些组分对富集、分离和纯化特定的微生物有较重要的作用,不同种类的培养基中,一般应含有水分、碳源、氮源、无机盐和生长因子等。不同微生物对PH要求不一样,霉菌和酵母的培养基的PH一般是偏酸性的,而细菌和放线菌培养基的PH一般为中性或微碱性的。 牛肉膏蛋白胨固体培养基中的牛肉膏为微生物提供碳源、磷酸盐和维生素,蛋白胨主要提供氮源和维生素,而NaCL提供无机盐;高氏一号固体培养基中加入的抗菌药物酚可分离各种放线菌;而马丁氏培养基中加入的孟加拉红能有效的抑制细菌和放线菌的生长,而对真菌无抑制作用,从而达到分离真菌的目的。在配制固体培养基时琼脂作为凝固剂。 4.3 实验的结论性的小结 土壤是微生物生存的大本营,所含微生物无论是數量还是种类都是极其丰富的,是微生物多样性的重要场所。培养基的种类和组分的不同可用于分离或富集不同的微生物 。菌落呈现的颜色、形态、透明程度,均有所不同,从而进一步进行革兰氏染色后观察,确定微生物的种类及阴性和阳性,从菌落计书数的结果来看,每种平板中的菌落数值均较大,由此可见土壤中微生物种类繁多。 4.4 成功掌握了微生物学实验中的微生物的分离和纯化、微生物的选择性培养、平板菌落计数、培养基的制备、高压蒸汽灭菌、微生物主要类群的培养特征和形态特征、制片染色技术等的原理和操 7 作方法。在实验中的不足之处是接种时无菌操作不时有杂菌污染,会对菌形态观察及实验結果产生影响;通过实验让我知道成功与否关键在于细节,如在倒平板时由于菌易吸附到玻璃器皿表面,所以菌液加到培养皿后,应尽快倒入熔化并已冷却至45 ?C左右的培养基,立即搖匀,否则,菌将不易分散或菌落连在一起,影响计数。 4.5放线菌菌落特征 F003圆形,较规则,直径3—5mm,菌落干燥、不透明,表面呈致密的丝绒状,中央呈蓝色四周白色,边缘光滑,菌落和培养基连接紧密,难以挑取,其正反面颜色不一致,正面白色,背面深蓝色,。在菌落边缘的琼脂平面有变形现象。 根霉菌落 不定形,正反面均为白色,半透明,菌丝发达,表面干燥 黄曲霉菌落 菌落无定形,直径3—5cm,为絮状,高度很高,覆盖整个培养皿,质地疏松,外观干燥为褐色、不透明,边缘有缺刻。菌落与培养基连接紧密,不易挑取。 曲霉菌落特征:菌落较大,质地疏松,外观干燥而不透明,菌落与培养基连接紧密,不易挑取,其正反面颜色不同,边缘不整齐,其正面为淡黄色,反面为黄色。高度较高,隆起。 土壤菌菌落 不规则圆形,直径2—3cm,正面黄色,反面棕色,不透明,表面隆起,干燥,边缘缺刻,菌丝不发达。 参考文献 [1] 沈 苹 范绣容;《微生物学实验》 (第4版) 北京 高等教育出版社 2007. [2] 周德庆《微生物学教程》(第三版) 北京高等教育出版社 2011. [3] 池振明 《现代微生物生态学》 北京 科学出版社 2005 [4] 韦革宏 王卫卫 《微生物学》 (第1版)北京科学出版社 2008 8
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