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糖皮质激素下调microRNA--155发挥抑炎作用的机制研究(可编辑)

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糖皮质激素下调microRNA--155发挥抑炎作用的机制研究(可编辑)糖皮质激素下调microRNA--155发挥抑炎作用的机制研究(可编辑) 复旦大学 博士学位论文 糖皮质激素下调microRNA--155发挥抑炎作用的机制研究 姓名:郑一诫 申请学位级别:博士 专业:免疫学 指导教师:储以微 2012-04-01糖皮质激素调.发挥抑炎作用的机制研究 中文摘要 糖皮质激素下调.发挥抑炎作用的机制研究 中文摘要 关键词:炎症,糖皮质激素,巨噬细胞,小分子,.,内毒素, 地塞米松 中图分类号: 糖皮质激素是治疗炎症及自身免疫性疾病的常见药物。内源性及 外源性合成 的糖皮质...
糖皮质激素下调microRNA--155发挥抑炎作用的机制研究(可编辑)
糖皮质激素下调microRNA--155发挥抑炎作用的机制研究(可编辑) 复旦大学 博士学位论文 糖皮质激素下调microRNA--155发挥抑炎作用的机制研究 姓名:郑一诫 申请学位级别:博士 专业:免疫学 指导教师:储以微 2012-04-01糖皮质激素调.发挥抑炎作用的机制研究 中文摘要 糖皮质激素下调.发挥抑炎作用的机制研究 中文摘要 关键词:炎症,糖皮质激素,巨噬细胞,小分子,.,内毒素, 地塞米松 中图分类号: 糖皮质激素是治疗炎症及自身免疫性疾病的常见药物。内源性及 外源性合成 的糖皮质激素均能有效抑制炎症反应,纠正炎症反应的失衡,避 免过度或持续炎 症所引起的组织损伤。『由于疗效显著,糖皮质激素数十年来一直 应用于临床一 线,广泛用于败血症性休克、哮喘、炎性肠病、类风湿性关节炎 和多发性硬化症 等炎症相关性疾病的治疗。然而,由于长期使用所带来的副作用及日益增加的耐 药性,糖皮质激素的临床效能正面临前所未有的挑战。因而,深入研究和进一步 阐明糖皮质激素的作用机理是一项重要的科学问。 长期以来广为人们认可的糖皮质激素作用机制是基因组学说,即:通过与糖 皮质激素受体 结合形成复合物,转位进入细胞核 后,与靶基因启动子区域糖皮质激素反应元件 , 结合或者与转录因子相互作用,从而直接或间接调控靶基因的转录。以往 的研究主要聚焦在信号分子及炎症介质等蛋白编码基因上,而对于与基因表达异 常关系密切的非编码序的作用则知之甚少。 近年来,己成为基因表达调控的“明星”分子。它们由细胞内核基因 组转录为,经过酶剪切』口工后,成为成熟的。成熟 的种子序列可与靶基因的’端非编码区互补结合,导致降解或者蛋白 翻译抑制。越来越多的证据表明:是机体内各种生理及病理活动 的关键调节因子,并参与固有免疫应答及适应性免疫应答。样受体 ,是固有免疫细胞重要的识别受体,可结合病原体的特定结构成 分,从而激活免疫细胞。其中,信号通路的活化,诱导大量不同的, 和 表达上调等;而这些 例如~,一,一, 又可靶向抑制某些信号传导蛋白的表达,反馈调控‘信号通路的强度,从而促 进或者抑制炎症应答。这些研究结果提示:狗炎症应答中扮演着重要角色。 那么,糖皮质激素是否调控的表达是否参与糖皮质激素的抑炎作 复口.人学卜海医学院博论文中文摘要 发挥抑炎作用的机制研究 糖皮质激素卜调. 用作用机制又如何目前,均未见系统的研究报道。 有鉴于此,我们以脂多糖,诱导的巨噬细胞炎症反 应模型为研究对象,利用基因芯片等技术系统分析了糖皮质激素地塞米松对 表达谱的改变情况,并对糖皮质激素调控表达的机制、参 与糖皮质激素抑炎的作用及分子机制展开研究,以期阐明糖皮质激素抗炎的非编 码机制,为后续的药物开发提供理论和实验基础。 第一部分糖皮质激素影响在炎症反应中的表达 巨噬细胞是天然免疫系统的重要组成部分,在炎症反应中起十分关键的作 用。巨噬细胞等炎症细胞渗出是炎症反应最主要的特征。渗出的巨噬细胞是一柄 双刃剑,一方面,巨噬细胞被激活后,释放炎性介质,激活免疫系统,有效地杀 伤病原体,构成炎症反应的防御环节;另一方面,巨噬细胞过度激活则释放过量 炎性介质、蛋白水解酶及氧自由基等加重组织损伤并延长炎症过程。. 细胞是小鼠来源的单核巨噬细胞系,在受到刺激时,可模拟机体炎症细胞 的反应状态,已成为一种常见的炎症反应细胞模型被广泛应用于炎症领域的相关 研究。 据此,我们首先以刺激.细胞建立炎症反应模型,加入糖皮质 激素地塞米松后,用 检测细胞炎症介质表达水平的改变,并 用检测细胞外炎症介质的释放情况,结果发现:地塞米松可在水 平下调.、.及的表达,抑制?、.及的合成及释放, 提示糖皮质激素可显著抑制所介导的巨噬细胞炎症反应。 为了进一步研究糖皮质激素对表达谱系的影响,我们以上述炎症模 型为基础,利用基因芯片技术,系统分析了糖皮质激素对表达的调控作 用,结果发现:可上调巨噬细胞内个的表达,下调个 的表达;在加入地塞米松后,与组相比,可上调巨噬细胞内个 的表达量,而下调的数量则为个。通过生物信息学分析,我 们挑选了其中部分与炎症密切相关的及表达差异较大的进行 的验证,结果显示:糖皮质激素可显著下调一、一、 一、一、一、一及一的表达,而对一及。 的表达无明显影响。 本部分实验结果表明,糖皮质激素除了调控编码蛋白基因表达外,对蛋白非 编码的亦具有明显的调控作用。 复口.人学海医学院博论文糖皮质激素下调. 发挥抑炎作的机制研究 中文摘要 第二部分糖皮质激素下调.发挥抑炎作用 第一部分的结果表明糖皮质激素可以明显影响的表达谱系的变化, 那么一、一、.、一、.、一 及. 等这些变化的在糖皮质激素抑制炎症反应中的作用如何为此,我们 首先采用电转染的分别转染.】、一、一、一、 一、.及一模拟物以上调这些在巨噬细 胞内的表达;其后,再进行地塞米松处理及刺激。结果发现:过表达. 可显著拮抗地塞米松对?、一及等炎症介质的抑制作用,提示一 参与糖皮质激素抑制诱导的巨噬细胞炎症反应的作用。 为了进一步探讨这种下调的.表达对诱导巨噬细胞炎症反应的 影响,我们利用。抑制剂干扰.巨噬细胞内一 的表达后,再进行刺激,结果发现:一表达的下调可削弱诱导 的巨噬细胞炎症反应。该作用与糖皮质激素的作用一致,表明下调一的表 达是糖皮质激素抑制诱导的巨噬细胞炎症反应的重要分子机制。 发挥作用的经典模式是与靶基因的’端非编码区互补结合,导 致蛋白翻译抑制。为进一步探讨一参与糖皮质激素抑制巨噬细胞炎症反应 的分子机制,我们利用生物信息学对其叮能的靶基因进行科学预测和初筛,结果 及等三个数据库信息搜寻及交集运算分析发 发现:, 现了个.潜在靶基因;在这些靶基因中,是具有显著抑炎功能 的分子,因此我们进一步对其进行分析及实验验证。双荧光素酶报告基因检测发 现: 一可抑制含 ’序列报告基因质粒的荧光素酶活性; 一 可显著下调 检测亦发现,在.细胞 蛋白水平的表达。这些结果表明,是.的靶基因。此外,我们还 进一步研究了地塞米松对基因表达的影响,刺激的.细胞炎 症反应模型,经糖皮质激素地塞米松干预石, 检测.细胞中 蛋白水平的表达,结果发现地塞米松可上调的表达。 本部分结果表明,.参与糖皮质激素抑制诱导的巨噬细胞炎症反 应;下调一的表达从而上调其靶基闪的表达,是糖皮质激素发挥 抗炎作用的重要机制之一。 复.人学:海医学院博卜论义中文摘要 糖皮质激素调. 发挥抑炎作用的机制研究 第三部分糖皮质激素对.的调控机制研究 为进一步明确糖皮质激素对一表达的调控作用,我们在诱导的 原代小鼠腹腔巨噬细胞及人.单核细胞炎症模型基础上进一步验 证糖皮质 激素对. 表达的影响。结果发现,与在.细胞中的研究结果一致, 糖皮质激素地塞米松对原代巨噬细胞及人单核细胞中诱导的一 表达 亦有显著抑制作用。此外,我们进一步以建立动物炎症模型,经地 塞米松 处理后,检测脾脏及肝脏中.的表达情况。结果发现,与对照组相 比,地 塞米松处理组小鼠脾脏及肝脏中一的表达量亦发生下调。这些结果提示: 糖皮质激素对. 的调控作用具有一定的广泛性,而非单一的细胞依赖性。 糖皮质激素发挥作用主要通过经典的受体依赖途径及受体非依赖途径。为进 一步探讨糖皮质激素对一 表达调控的机制,我们以糖皮质激素受体阻断剂 预处理.细胞后,再加入地塞米松及,结果发现:可 完全阻断地塞米松对. 表达的影响。结果提示,糖皮质激素对. 表达的调控作用具有受体依赖性。 及.通路是激活后发挥功能的重要信号传导途径。 为研究糖皮质激素对一 表达调控的分子机制,我们首先探讨糖皮质激素对 及.通路的影响。结果发现,地塞米松可显著抑制所介导的 家族中的磷酸化,而对及的磷酸化无明显影响;此外,地 塞米松亦可抑制所介导的核转位。为进一步探讨及.通路在 诱导的.表达中的作用,我们采用抑制剂阻断通 路后,仍可上调.的表达,且表达量未见明显改变;相反,采用. 抑制剂 阻断.通路后,所诱导的一表达量发生下 降,提示?通路而非通路参与所介导的一表达上调。因此, 这些结果表明:地塞米松主要是通过抑制.通路的激活从而影响所介 导的.表达。 ?一及?一是成熟一的前体,我们在诱导的巨 表达的影 噬细胞炎症反应模型上检测糖皮质激素对?. 及?. 响,结果发现:地塞米松可显著下调所诱导的?一及?. 表达。这提示,地塞米松对一的抑制作用可能发生于转录起始水平。因而, 我们对一 宿主基因? 的启动子序列进行分析。 对的转录起始位点上游至下游的区域的分析的结果显 示,在该区域不含糖皮质激素的直接结合位点;相反,在该区域里存在 ?、一及一等结合位点;当?位点发生突变时,地塞米松对一 复口.人学:海医学院博:论文糖皮质激素调. 发挥抑炎作用的机制研究 中文摘要 表达的抑制作用消失。这些结果表明,上.结合位点以及?通路 是地塞米松是于诱导的巨噬细胞炎症反应模型上调控. 表达的关键 位点及关键信号分子途径。 综上所述,我们首次系统分析了糖皮质激素对表达谱系的影响,发 现.参与糖皮质激素抑制诱导的巨噬细胞炎症反应;糖皮质激素可 通过受体依赖途径及.通路抑制诱导的.转录,下调一 的表达,进而发挥抑制炎症反应的作用。 的表达水平,从而上调其靶基因 该研究结果进一步丰富了糖皮质激素的作用机制,为后续药物的开发提供了新的 靶点及实验基础。 复口.人学:海医学院博卜论义发挥抑炎作用的机制研究 英文摘要 糖皮质激素’卜.调. .: , , , , ,, :, .., , ,, ,., . ?, . ?, ?.? ,. ? , ? . , , ? , ., , ? , . . ’ , . 复口.人学:海医学院博士论文塑鏖堕塑耋塑竺竺垦型垒:垄堑塑 壅堡旦盟塑型婴至???????????』整墅堕兰,, ., 一, 一 ,一 ,.,. 锄.. , , , . ? ,., . ? ..? 一 一., ? 。. . . ’ , ., . .锄 。 , ‘. 士 .一【,一, ‘ 一【. ., 。 。 。 复旦人学.海医学院博论文糖皮质激素卜调. 发挥抑炎作用的机制研究 英文摘要 , . , ..一 ?. ? . . ?,. 一 一,一, ,一 , .一,一 ,., ? . 一 , 一,一,一,一,., ., . .. . .?. 一,.,一,.,一,.. ? ,. . . ?,一? . ?,一, . .. ? . 一 , ? . 一. ? . 一仅,一, . . 一 ? 复口.人学:海医学院博卜论文英文摘要 糖皮质激素下调.发挥抑炎作用的机制研究 ? . ’ ,, 一. , ’ 一. ?, . .. . . 一 .一 . 一 ..... ’ 一 , , . . 一 . 一 一. 一 , . , . 一 . 一 ., , .. ,, 复口.人学:海医学院博论文糖皮质激素调.发挥抑炎作用的机制 研究 英文摘要 一 . . 一 . ,一 . ? , .. . . 一. . ,.?. .? . 一.. ...,一 ? . . . . . , 一 ., . . .一 . .. ?一 ?一 . ? .,一 ? , 一 ., . ..,.,。. 复咀火学:海医学院博.论文‘糖皮质激素下调.发挥抑炎作用的 机制研究 英文摘要?. ? ? 一 ., ? , ?. 一.,. ,? . 复口.大学:海医学院博论义英文缩略词 缩写 英文名称 中文名称 ’ ’. ’端非编码区微小核糖核酸 . . 微小. .? . 初始微小. ?.. 前体微小一 .细胞集合簇 糖皮质激素受体 糖皮质激素反应元件 脂多糖 ?. 肿瘤坏死因子一 . . 白介素. 一氧化氮合酶 一氧化氮 ? 丝裂原活化蛋白激酶 ? ? 核因子. . . .试剂盒 互补脱氧核糖核酸 一一 ’,.联脒.一苯基吲哚二 盐酸盐二乙基焦磷酰胺 ’达尔伯克氏培养基 二甲基亚砜加强型化学发光 .流式细胞仪聚合酶链反应 ? . 诱导的沉默复合体 逆转录十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰氨凝胶电 泳?尊一。的盐缓 冲液 复口.人学卜海医学院博士论文糖皮质激素下调.发挥抑炎作用的机制研究 日鬲 ?上.?? 日 舌 糖皮质激素是由肾上腺皮质束状带细胞合成和分泌的一种甾体激素,其特征 是具有个碳原子组成的典型固醇结构,主要成分为皮质醇。。内源性 的糖皮质激素具有广泛的生理作用,可调节糖、蛋白质和脂肪代谢,维持机体生 命活动。临床工作中,给予超过生理剂量的外源性合成糖皮质激素,则可发挥抗 炎、抗休克、免疫抑制及抗过敏等药理作用’。 炎性细胞的活化,迁移及浸润至组织局部,导致炎症的发生及发展 在 这过程中,炎症因子的激活及大量分泌扮演着十分重要的角色。当外界刺激 因素与炎症细胞表面受体结合后,激活下游的信号传导通路,促进?和. 等转录因子结合至核基因组上,染色质发生重塑,从而促进了炎性基因的转录和 翻译。炎症本身是人体对感染、外界刺激及损伤的一种自我调控的反应过程。 适度的炎症是应激状态的一种表现,对人体有益;而过度或持续性的炎症反应则 会导致组织损伤,并诱发炎症相关性疾病 糖皮质激素可以纠正炎症反应的 失衡,控制炎症反应的强度 。数十年的临床应用业已证明,糖皮质激素具有 良好的抑制炎症细胞激活、炎性介质释放及炎症细胞趋化反应的功能 因而, 糖皮质激素广泛应用于各种急慢性炎症及自身免疫性疾病的临床治疗工作中。 深入阐明糖皮质激素的作用机制,是重要的科学问题,也是近年来的研究热 点和难点四。随着分子生物学技术的发展及新方法的应用,对糖皮质激素抑炎机 制的研究已经深入至分子水平。长期以来广为接受的糖皮质激素作用机制是基因 组学说,即:通过糖皮质激素与结合形成复合物,转移至细胞核后,与启动子 区特定的反应元件结合或者与其它转录因子相互作用,从而直接或问接调控 靶基因的转录’。 分为【和二种亚型。 ?结合糖皮质激素,是的配体结合蛋白, 在绝大多数细胞中均存在表达。在静息状态下,以受体复合物的形式存在于 细胞浆中‘。当与结合后,复合体中的热休克蛋白 ,等抑制性分子伴侣的构象发生改变并发生解离, ?复合物进入 细胞核,以同型二聚体的形式与激素应答基因启动区的结合,并招募辅助激 活因子,导致染色质重塑及解聚,从而调节靶基因的转录活性,上调抗炎分 子女一及脂皮质素一一等的表达。 。是重要的磷酸 酶,可使活化的去磷酸化而失活,抑带,通路的激活;一亦可抑制 .通路的活性,从而抑制相关炎症因子的表达;而脂皮质素可抑制磷酸酶 复口.大学,:海医学院博卜论文糖皮质激素下凋.发挥抑炎作【的机制研究 前言 ,影响花生四烯酸的代谢反应,进而抑制前列腺素和白三烯等炎症介质的合 成川。此外,?复合物还可与负性应答元件结合,抑制炎性因子女?、一 及一等的转录。但在一些情况下, 复合物通过作用于一及一 等转录因子来问接抑制炎性基因的表达以及转录后调控。一或?可与形 成复合物,当?复合物在核内与结合,可同时干扰一或?结合。这 样就可抑制?和?诱导的基因转录,进而调控?、一、 工一、 一、一及一等炎性因子的表达”。, 但是,以往的研究主要聚焦在信号分子及炎症介质等蛋白质编码基因上,而 对于与基因表达异常关系密切的非编码序/女的作用则知之甚少。随着 人类基因组的完成,人类全基因组测序图谱表明,蛋白质编码基因仅占所有 基因序列的%,而在整个人类基因组中存在大量的非编码序列。它们虽不 翻译成蛋白质,但越来越多的证明表明非编码在蛋白质合成中具 有重要的调 控功能’。显然,非蛋白质编码序列不可能如传统观点所认为的那样,是没有 功能的辅助结构序列。相反,这些非编码序列极有可能决定着细胞组织机能状态, 维持细胞的生命活动过程。因此,非蛋白质编码『引起人们的关注和重视。 是近年来研究较多的“明星分子”。这类卜的非编码,首先由 核基因组转录,形成带帽状结构和多聚腺苷尾巴的初级。 ?经核酸酶处理后形成约的含茎环节后的前体 ?,其后又经核酸酶剪切为成熟的。通过碱基非完全配 对与靶基因’序列结合,引导沉默复合体? ,降解或抑带的翻译,从而调控基因的表达。一个 可结合多个靶基因,而一个也可由多个共同调节,从而形 成复杂的网络调控系统 ‘。研究证明,广泛参与细胞活动的一系列生 理及病理活动过程,包括细胞发育、细胞凋亡、细胞代谢、肿瘤形成、病毒感染 及免疫应答等. 作为调控细胞功能的关键因予,在细胞受到病原体感染或者外界刺激 后,发生炎症反应时,的表达谱发生改变,介导促炎因子及抑炎因 子的 表达,参与调控炎症的发生及发展过程。司有免疫系统是机体抵御病原体入侵 的第一道防线,可对外界刺激作出免疫应答。以样受体为代表的模式识别受 体. ,识别相应配体后,可启动固有免 疫反应,导致炎症因子的活化及释放叭。相?。信号通路的活化过程中,可诱导 大量不同的表达,例女一, ,一,一;手? 等;而这些又可靶向抑制某些信号传?手蛋白的表达,反馈调控信号通 复口.人学:海医学院博】:论文糖皮质激素调.发挥抑炎作用的机制研究 前言 路的强度,从而促进或者抑制炎症应答书。当结合后,通过途径, 激活及.通路,上调?、一及一 的合成及释放,同时伴随着 .的表达的上调,而.的作用靶点正是通路中的重要分子一.受体相关激酶. ,、.受 体相关激酶.,及肿瘤坏死因子 ?受体相关因子 一可通过抑制 、及的表达,负反馈调控信号通路的反应强度叫。 、及激活后,可通过依赖或依赖途径,激活? 或,诱导一的表达。而上调巨噬细胞内.的表达量可抑制 、及所介导的炎症因子释放,相反,抑带.的表达量则可 促进相应炎症因子的合成,提示.亦是通路的重要负性调控分子。 ~一可靶向作用分子,从通路的上游直接影;通路的活 性,从而影响炎症应答厶。而一是通路的正向调控分子。在一 的转基因小鼠中,当给予外源性束激时,体内产生.远高于工常小鼠; 当巨噬细胞受到束激时,一的表达量急剧升高,并通过靶向抑带 等负性调控分子的表达,促进炎症介质的释放舛?。可见,正成为炎症调控 分子家族的重要成员。与其他调节机制不同的是,只需通过几个碱基的 互补影响靶基因水平,进而在免疫应答各个水平发挥作用。 作为如此重要的基因表达调控新分子,刃;可能参与糖皮质激素的抑炎 作用。但是,目前该领域仍缺乏系统的研究报道。有鉴于此,我们以诱导的 巨噬细胞炎症反应模型为研究对象,利用基因芯片全面分析糖皮质激素对 表达谱系的改变情况,并就糖皮质激素调控表达的机制、 参与糖皮质激素抑炎的作用及机制展开研究,以期阐明糖皮质激素抗炎的非编码 新机制,为后续的药物开发提供新的靶点和理论依据。 复口人学海医学院博卜论文糖皮质激素影响在炎症反应中的表达 第一部分 第一部分糖皮质激素调控的表达 糖皮质激素具有广泛的生理和药理学作用,数十年来一直被应用于临床一 线,但是其作用机理一直是生命科学研究的重点和难点。近年来,随着分子生物 学技术的发展及其新方法的应用,糖皮质激素的生理药理作用研究取得了较大的 进展 一及皮质素等新作用靶点的发现,不仅丰富了糖皮质激素的临床 药理学机制,还加深了对疾病发生发展过程的认识。然而,糖皮质激素的作 用涉及复杂的多层次调控网络,并非单纯某个基因、某条信号通路或者某一类别 分子所能阐明。迄今为止,人们对其作用机理的认识仍然只是“冰山一角”。 在以往的糖皮质激素作用机制研究中,人们关注的焦点主要集中在蛋白质编 码基因与蛋白质的结构和功能上。但是,传统以蛋白质为中心的“蛋白质一蛋白 质”或者“蛋白质一”作用模式,并不能很好的解释糖皮质激素复杂的生 物学功能。近年来,一类非蛋白编码,因其强大的生物调控功能 ’ 而成为生物医学领域的研究热点。如前所述,通过与靶基因 非编码区域之间的配对结合而调控基因的表达,一个可以调控数十甚至 数百个,而同一个也可由多个所调控,由此形成一个复 杂而精细的调控网络,在多种组织和细胞中协同调控基因表达。 然而,到目前为止,对于这一功能强大的新调控分子在糖皮质激素 功能发挥中的作用却知之甚少。为了探索在这一过程中所扮演的角色, 我们首先需要明确:糖皮质激素是否调控的表达对表达谱发 生怎样的影响基于此,在本部分实验研究中,我们以诱导的巨噬细胞炎 症反应为模型,利用基因芯片技术,系统分析糖皮质激素对表达谱的调 控作用。 复.人学卜海廷学院博二论文糖皮质激素影响在炎症反应中的表达 第一部分材料与方法 材料与方法 一、 实验材料 .细胞系 小鼠 .细胞株来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库, 并 由本系细胞库长期保存。 .主要试剂与材料 培养基 公司,美国 胎牛血清 公司,美国 青霉素/链霉素双抗 公司,美国 孔细胞培养板 公司,美国 孔细胞培养板 公司,美国 孔细胞培养板 公司,美国 管,,. 公司,美国 头,, 公司,美国 及培养皿 公司,美国公司,日本公司,瑞士 公司,美国 氯仿 国药集团,中国 异丙醇 国药集团,中国 乙醇 国药集团,中国 丙烯酰胺 公司,美国 ,’一亚甲基甲叉双丙烯酰胺 公司,美国 上海生工,中国 过硫酸胺 公司,美国 四甲基乙二胺 公司,美国 复口人学卜海医学院博:论文糖皮质激素影响在炎症反应中的表 达 第一部分材料与方法 公司,美国 甘氨酸 公司,美国 检测试剂盒 广州锐博生物,中国 裂解液 碧云天生物,中国 公司,美国 水 上海生工,中国 抗体 公司,美国 抗体 公司,美国 ? 公司,美国试剂 公司,美国 . 检测试剂盒 公司,美国 一 检测试剂盒 公司,美国 检测试剂盒 碧云天生物,中国 公司,美国 地塞米松 公司,美国 .主要仪器及器材 仪器名称 仪器来源 . 垂直电泳仪及电转移系统 ?,美国 荧光定量仪 ,美国 微量紫外分光光度计 公司,美国 一。超低温冰箱公司,美国 .公司,美国 自动酶标仪型 细胞培养箱 ,美国 立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂,中国 净化工作台 卜海净化设备厂,中困 水平电泳仪 北京六一实验仪器厂,中国 超声波细胞粉碎机 宁波新芝实验仪器厂,中国 水平摇床 北京六一实验仪器厂,中国 复口人学:海医学院博?诊文。第一部分材料与方法 糖皮质激素影响在炎症反应中的表达 一 ,美国 高速低温离心机 二、 实验方法 .细胞培养 /青霉素、 /链霉素及 .细胞接种于含%、 谷氨酰胺的培养基中,并常规培养于。、%、饱和湿度的 培养箱中;每更换培养液一次,于%左右的细胞密度时进行传代培 养。 .诱导巨噬细胞炎症反应模型的建立 。预处理后,加入 .细胞经 /刺激, 收集细胞进行 检测细胞因子的表达水平;收集蛋白检测相关 蛋白分子的改变;收集细胞上清进行检测细胞因子的蛋白含量。 .抽提 提取根据试剂公司进行,主要步骤包括: 取..×培养细胞,加入 充分裂解,每 加入 氯仿,充分混匀,于室温静置,?×。 将上层水相移至. 管酶中,加入等体积异丙醇后, 振荡混匀;?静置以沉淀,。 ×。 弃上清,加入 %预冷乙醇处理水配制洗涤一次, ×。 弃上清,真空室温干燥.。 加适量处理水完全溶解。 分光光度法检测浓度及纯度。 .. 检测普通基因表达量 逆转录反应 进行逆转录反应,将逆转 采用公司 录为。反应体系及反应条件均按说明书进行操作。 复口.人学:海医学院博十论文糖皮质激素影响在炎症反应中的 表达 第一部分材料与方法 反应条件为: 。 . 采用 试剂盒进行 反应, 并按照说明书进行操作。 反应体系为: 反转录反应条件如下: 。 复口.人学.海医学院博论义糖皮质激素影响在炎症反应中的表 达 第一部分材料与方法 . 检测表达 逆转录反应逆转录反应采用公司. ,按说明书进行操 作。反应体系如下: ×× . ?砌硒磊话苫嗍??” “ 复口.火学:海医学院博卜论文糖皮质激素影响在炎症反应中的表达 第一部分材料与方法反应按试剂盒说明书进 行操作。反应体系同普通基因检测,扩增循环数增加至个循环,引物采用广 州锐博生物公司的检测试剂盒。 .蛋白样品制备:细胞经预冷的漂洗次,在培养板上直接加入 裂解液,反复吹打后,细胞刮刀收集,用移液器转移至离心管中,至于冰上 后,。 ×,收集上清液。 模具组装:按电泳仪说明书组装好灌皎模块; 按以下配方制备%分离胶,并进行灌注,凝固后备用; . %丙烯酰胺 ./ . ?.. % . . % . . . %丙烯酰胺 . ./ ?,. . % . % . 上样:将蛋白质样品浓度调整为/,并加入等体积的×上样缓 冲液,煮沸,冷却后上样。 电泳:加样完毕后,接通电源,进行恒流电泳每块胶,当染料, 沿到达凝胶底部时停止。 复口.人学:海医学院博论艾糖皮质激素影响在炎症反应中的表 达 第一部分材料与方法 转膜:采用三明治法于冰上进行恒压电转,,将蛋白转移至 膜上。 封闭:将膜置于封闭液含%脱脂奶粉的中,室温封闭 。 一抗孵育:弃去封闭液后,用少许润洗一次;采用封闭液按一定比 例配制一抗孵育液:.,?孵育过夜。 洗涤:采用于摇床上洗膜次,每次;加入二抗孵育液: ,封闭液稀释,室温湿盒中孵育。 洗涤:洗膜次,每次。 观察结果:加入试剂孵育;光胶片曝光,进行显影和定影, 最后进行光胶片的扫描和图像数据化分析。 .检测 检测主要采用碧云天公司的检测试剂盒,步骤参照说明书进行, 主要包 括: 取出 和,室温水浴,使之回复室温。 按“/孔,在孔板中加入品及样品。 。 按“/孔,在各孔中加入 。 按/孔,在各孔中加入 测定吸光度。 .检测细胞因子的含量 包被:用包被液将抗体稀释至合适的浓度。在每个反应孔中加.,。 湿盒过夜。次日,弃去孔内溶液,用冲液洗×。 封闭:每个反应孔中加.封闭液,置室温孵育,弃去孔内溶液,用 冲液洗×。 加样:加待检样品.于反应孔中,置室温孵育,置室温孵育,弃 复口.人学:海医学院博卜论文糖皮质激素影响在炎症反应中的 表达 第一部分材料与方法 去孔内溶液,用冲液洗×。 加酶标抗体:用封闭液稀释酶标抗体,于各反应孔中,在每个反应 孔中加 .,室温孵育.,弃去孔内溶液,用冲液洗×。 显色:于各反应孔中加入临时配制的底物溶液.,室温孵育~ 。 终止反应:于各反应孔中加入硫酸.,终止反应。 结果判定:在酶标仪上,于及检测值。 .基因芯片分析本研究采用 .;, 进行基因芯片分析,主要步骤包括:样品提起、荧光标记探针制 备、芯片杂交、图像采集及数据分析。本部分的实验工作由康成 生物公司完成。 .统计学分析 软件进行数据统计, 采用 .或.视为具有统计学差异。 复目.人学海医学院博卜论义第一部分结果 糖皮质激素影响在炎症反应中的表达 结 果 一、 糖皮质激素抑制诱导的巨噬细胞炎症反应 巨噬细胞是天然免疫系统的重要组成部分,在炎症反应中起十分 关键的作 用。.细胞是小鼠来源的单核巨噬细胞系,在受到刺激时,可模拟 机体炎症反应状态,己成为一种炎症细胞模型被广泛应用于炎症 领域的研究 ”。,因而,本研究以该炎症模型为基础开展相关实验。 .细胞经。预处理后,加入/刺激, 收集,采用 检测细胞炎症介质的改变,如图?所示:当 刺激后,.细胞内促炎因子?、一及的表达量急剧增加; 而经处理后,?、.及的表达发生下调;此外,我们收 集细胞蛋白进行的蛋白水平检测;收集细胞培养上清,采用检测 细 胞外炎症介质的释放情况,如图.及.所示:与水平一致,可 抑制?及.的释放,并抑制蛋白水平的表达及细胞的含量。 结果提示,糖皮质激素可显著抑制所介导的巨噬细胞炎症反应。 皿;;一薹一 善咖 芒 珊. 日 厂 芒 图.糖皮质激素抑制诱导的巨噬细胞炎症反应?. . ?、 /. ?【, ,. . 复口.人学..海医学院博:论文糖皮质激素影响在炎症反应中的 表达 第一部分结果 . 木.,料. . 喇黼簟麟黔渊黧麟黔镧?鬻醚 图卜糖皮质激素抑制诱导的表达 . . . ? 、. / . 二、 糖皮质激素调控的表达 既然糖皮质激素可显著抑制所介导的巨噬细胞炎症反应,那么, 糖皮质 激素对的表达是否也有影响为此,我们以上述模型为基础,提取 后,首先利用基因芯片技术,系统分析了糖皮质激素对表达谱的 调控作 用。将差异表达的阈值设置为.倍,如图.所示:可显著上调巨噬细 胞内个的表达量,下调个的表达量;在加入地塞米松后, 与组相比,可上调巨噬细胞内个的表达量,而下调的 数量则为个。我们挑选了其中部分与炎症密切相关的及表达 改变较大的进行后续的研究,这些包括:一、一、 .、.、一、.、一、.及.图? 复旦大学,:海医学院博:论文糖皮质激素影响在炎症反应中的表 达 第一部分结果 一辱 工 至 . . . 加 .. . . ? 与 . / 图.糖皮质激素对表达谱的影响. .. . ‘ / . 】丁 . 南 ,? ?.. . 复旦大学二海医学院博士论文。’ 垫鏖堕塑鲞星堕竺在炎症反应中的表达 第一部分结果? ??????????????????????????????????????????????????????? ?????????????????????????????????一 然后,我们对所挑选的表达进行进一步 认证,结果显 示,糖皮质激素可显著下调.、一、.、.、一、 一及的表达,而对.及一的表达无明显影响图?。 . . .曼 芑 警 .兰 . 一 芑 胃 ?芑 墨 墨图糖皮质激素下调.、一、.、.、.、 .及.的表达一、一,一、一、一、. . . . . .?、./ ? . . . 半.,料. 复口.人学海医学院博卜论文第一部分讨论 糖皮质激素影响在炎症反应中的表达 讨 论 当受到外界因素刺激,机体免疫细胞产生应答及活化,浸润至组 织局部,导 致炎症的发生及发展。在这过程中,炎症因子的激活及其表大量 释放扮演着重要 巨噬细胞是天然免疫系统的重要组成部分,在炎症反应中起十分 关 的角色, 键的作用。静息状态的巨噬细胞被激活后,经过复杂的信号网络调控,释放大量 的炎性介质,有效地杀伤病原体;而过度的巨噬细胞活化及其产生的过量炎症介 质,会引起组织损伤、水肿甚至休克。糖皮质激素可以纠正炎症反应的失衡, 控制炎症反应的强度。数十年的临床实践证明,糖皮质激素具有良好的抑制炎症 细胞激活、炎性介质释放及炎症细胞趋化反应的功效,因而,一直被广泛应用于 临床各种急慢性炎症及自身免疫性疾病的治疗.”。在本研究中,我们以诱导 的巨噬细胞炎症应答为体外实验模型,发现糖皮质激素可在及蛋白水平抑 制巨噬细胞?及.等炎症介质的释放,并且降低的表达及的合成, 本文实验结果与前期的研究报道一致,表明糖皮质激素对巨噬细胞的炎症反应具 有显著的抑制功能。 细胞的炎症反应受到多种复杂机制的调节。与巨噬细胞表面的受体 结合可激活样信号通路,活化,并利用死亡作用域 ,导致 募集含相似区域的丝/苏氨酸蛋白激酶一 结合, 磷酸化;磷酸化的脱离,并与.活化? 家族成员. ? ;后者的激活后会进一步活化激酶 ,,导致 泛素化而降解,使?.从静息状态下受.结合的抑制状态中得以解 除,游 离的.转位到胞核,启动炎症相关基因的表达’,’。此外,信号通 路 也可通过激活通路,导致.等转录因子的活性增加,进而调控基因 的转 ., 立 近年来的研究表明,亦参与样受体所介导的信号传导通路。 等发现束激后人类单核细胞株.释放?、一及一等炎症 因子的同时,表达谱也发生改变,.和一表达量明显上调; 此外,诱导的.及.等炎症因子也可上调巨噬细胞中一的表 达,可见,对一的调控作用存在直接作用及间接作用两个方面。 信号通路中的关键分子、及均是一的靶基因,因此诱 导表达的一可负反馈调控炎症反应‘;相反,一的靶基因则为 等负性调控因子,因而起『向调控炎症反应作用。.。此外,等发 复口.人学:海医学院博论文糖皮质激素影响在炎症反应中的表达 第~部分讨论 现,激腹腔巨噬细胞时,除了上调一及.表达外,还可上调 一的表达,并且及的活化均可上调.的表达;过表达巨噬 细胞内一的量时,可抑锘、及所介导的炎症因子释放,因 而认为.是通路中关键的负性调控分子。等对激的一 细胞进行表达谱分析,发现存在明显表达差异的达到个。 .是受调控的分子,可通过激活途径上调一的表达,而一 则可靶向作用于分子,实现对炎症反应强度的控制。在本研究中,我们以 诱导的.细胞炎症应答模型为基础,采用基因芯片的方法检测糖皮质 激素对表达谱的影响,结果发现,兰激后,巨噬细胞内个 的表达量发生上调,而个的表达量则出现下调,这说明对 表达谱的调控作用主要以上调表达为主;与前期的研究报道一致,幕激后 .、.、一及.的表达量均发生上调如卜。 .亦是通路的一个关键调控分子,直接靶向调控蛋白的表达。 当人胆道上皮细胞发生隐孢子虫.感染时,隐孢子虫可通过细胞壁中 成分激活通路,下调细胞内一的水平,从而上调蛋白的表达, 促进炎症的发展,。但最新的研究则发现,束激细胞时,一的表达量 并未发生下调,相反,还出现上调。本研究亦发现,激.巨噬细 胞时可诱导.的表达,该实验结果与细胞上的趋势一致。可见,对 表达的调控作用,可能受到细胞类型的影响,存在某些细胞特异性的现 象。 除了参与细胞的生理及病理活动外,其药理学功能亦开始受到关注。 越来越多的证据表明,及其所介导的信号通路在多种药物的作用机制中 扮演着重要的角色。姜黄素是一种从生姜中提取的天然活性物质,具有抗肿瘤效 果‘。等发现,姜黄素可影响细胞的表观遗传学特征,改变基因的表达状 态,导致.的启动子区域甲基化水平降低,从而使.转录增加。致癌 基因在通路中起正向调控作用,其翻译水平受。的调控。因此, 姜黄素促进.的表达后,可下调蛋白水平,抑制信号传导通路, 从而抑制肿瘤细胞的增殖,促进细胞的凋亡。姜黄素类似物 。则可通过上调.,靶向抑制组蛋白甲基转移酶 矛细胞表面粘附因子彭表达,抑制肿瘤细胞的生长及转移。其他 受姜黄素调控的还包括:.、一及一刺卜一。二甲双胍 是治疗糖尿病的临床常用药物,近年来也用于治疗胰腺癌。 ?等发现经:二甲双胍处理后的一细胞,具有抑癌作用的一表达量则出现下调;:二甲 及.表达量显著上调,而具有促癌作用的一 复口.火学.海医学院博论文第一部分讨论 糖皮质激素影响在炎症反应中的表达 双胍还可抑?对. 表达的上调作用,从而削弱?对肿瘤的浸润 转移的影响。因而,二甲双胍对一、一及一表达的调控可能是其 抑癌的新机制。此外,也是泰素、.氟尿嘧啶、喜树碱 、白藜芦醇绿茶提取物、格拉默 等药物发挥作用的重要途径引垲。 在以往的糖皮质激素作用机制探讨中,研究主要集中在一些信号分子及转录 因子等蛋白编码基因上,而对于等非编码基因关注较少。等采用基 因芯片的方法,分析糖皮质激素在体外对淋巴瘤细胞株及在临床上对急性淋巴细 胞白血病患者治疗前后表达谱的变化,发现糖皮质激素可诱导.及 一的表达;抑制细胞一及一的水平,则可削弱糖皮质激素诱导 凋亡的作用,因而认为.及一 是地塞米松抑制肿瘤细胞增殖的重 要靶点 蹦。而在的研究中,则认为?.家族是糖皮质激素诱导淋巴细胞瘤 凋亡的重要靶点。.细胞经糖皮质激素处理后,可上调一.表达, 抑制其靶基因,从而诱导细胞凋亡。是糖皮质激素发挥作用的重要受 体。上调【的表达有利于发挥糖皮质激素的作用,相反,【表达的下调则可 降低糖皮质激素的效能,甚至引起耐受。对的’序列进行生物信 息学分析发现,.、一及一与的具有潜在的结合 靶点,且在糖皮质激素敏感的.骨髓瘤细胞株及耐受的.细胞株中存在表 达差异。后续的靶基因认证及功能学实验证明,是.的靶基因。过表 达一可抑制的蛋白水平,同时抑制糖皮质激素诱导.细胞凋亡 的作用。这些研究表明,多希参与糖皮质激素的抗肿瘤作用,并通过调 控影响糖皮质激素的功能。 在糖皮质激素的抑炎机制上,等发现,糖皮质激素可抑锘一的表达, 上调一的蛋白水平,从而调控炎症反应的强度。我们进一步在诱导的 巨噬细胞模型上,利用基因芯片的方法全面探讨糖皮质激素对表 达谱的 影响,结果发现,经地塞米松处理后,与组相比,可上调巨噬细胞 内个的表达量,而下调的数量则为个,提示糖皮质激素对 的表达具有广泛的作用。这进一步说明,糖皮质激素除了作用于编码蛋 白外,亦对非编码的具有重要的调控作用。 此外,我们进一步选取了与炎症相关的一、一、一、一、 .以及表达差异较大的一、.、一、一及一进 行 验证分析,发现在诱导的巨噬细胞炎症应答模型中,糖皮质 激素可显著下调一、一、.、.、一、.及 复口人学卜海医学院博论义糖皮质激素影响在炎症反应中的表达 第一部分讨论 一的表达,与基因芯片检测结果一致,而对一及.的表达无明显影 响。 这些结果也提示,网络对外界刺激具有高反应性。可使表达 谱发生显著的改变,而糖皮质激素又可部分拮抗对的影响,恢复部分 的表达水平。那么,这种谱系的变化是否只是细胞状态及功能改变或 者是糖皮质激素发挥作用所导致的一种表型变化抑或这种表达 谱改变功能性 参与糖皮质激素的抑炎作用又有哪些 参与其中如何发挥作用糖皮质 激素又是如何对的表达进行调控本文后二部分将对上述问题进行研究 和探索。 复口.人学海医学院博:论义一 第二部分 发挥抑炎作用 糖皮质激素‘ 第二部分糖皮质激素下调.发挥抑炎作用 越来越多的证据表明,作用广泛,调控着细胞内众多的信号传导通 路,影响炎症介质的合成和释放,是细胞炎症反应的新调控分子。探讨 的功能及其作用机制已成为生命科学领域的研究热点。我们在第一部分的实 验发现,糖皮质激素可下调一、.、一、.、一、 及.等的表达,那么哪些参与到糖皮质激素的 炎症调控作用这也是本部分研究旨在探讨的科学问题。 成熟发挥作用主要是通过在转录后水平负性调控靶基因表达,引起 靶基因及其下游信号传导通路的变化,从而导致细胞生理及病理 状态的改变 。主流的观点认为,调控靶基因的作用模式主要包括三种:其一是 通过碱基的不完全互补结合到靶基因的’,引导蛋白复合体的结合, 抑制靶基因的蛋白翻译;其二是不完全互补与靶基因结合后,通过类似于 的作用,介导靶基因降解;三是由以上两种模式的共同参与,发挥协同 作用 。可见,靶基因是发挥作用的载体和重要途径。 寻找靶基因的方法,当前应用较多、效率较高的是利用生物信息学 分析进行靶基因的预测。生物信息学方法主要基于特定的数学模型和运算方法开 发出来的软件系统,通过计算机对靶基因样本进行对比查找及数学评分,然后根 据所设定的阈值进行筛选。为此,我们将利用生物信息学及分子生物学等实 验技术对的靶基因进行科学预测和验证,力图阐明参与糖皮质 激素抑制巨噬细胞炎症反应的作用机制。 复口.人学:海医学院博论文糖皮质激素卜.调. 发挥抑炎作朋 第二部分材料与方法 材料与方法 一、 实验材料 .细胞系及实验动物 小鼠 .细胞株、人一单核细胞株及人细胞株来源于中国 科学院典型培养物保藏委员会细胞库,并由本系细胞库长期保 存。 /小鼠,雌性,?周龄,体重?,购白中国科学院实验动物中 心,饲养于复旦大学实验动物科学部级。 .主要试剂与材料 公司,美国 ? 公司,美国公司,同本 检测试剂盒 广州锐博,中国广州锐博,中国广州锐博,中国公司, 德国 公司,日本 小量抽提试剂盒 世纪康为生物公司,中国 提取试剂盒 世纪康为生物公司,中国 天根生物公司,中国 凝胶回收试剂盒 公司,日本 抗体 公司,美国 公司,美国 化学发光试剂 公司,美国 膜 公司,美国 公司,美国 一 公司,美国 限制性内切酶 公司,美国 限制性内切酶 复口.人学:海医学院博:论义第二部分材料与方法 发挥抑炎作用 糖皮质激素卜.调. 赛百盛公司,中国 ?公司,美国 ? ? 公司,美国 地塞米松 公司,美国 公司,美国 .主要仪器及器材 仪器来源 仪器名称 公司,美国 荧光定量仪 公司,美国 扩增仪 公司,奥地利 多功能酶标仪 微量紫外分光光度计 公司,美国 上海复同科技有限公司,中国 凝胶成像系统 莱卡公司,德国 荧光显微镜 ?公司,美国 蛋白电泳仪 .超低温冰箱 公司,美国 低温高速离心机 公司 ?公司,美国 自动酶标仪 细胞核转染仪 公司,德国 二、 实验方法 .细胞培养及诱导巨噬细胞炎症反应模型的建立 详见第一部分的实验方法。 .瞬时转染 在孔板中加入无抗生素培养液,并置于细胞孵箱中孵育,备用。将 培养液进行温育。 收集细胞并进行细胞计数,取×细胞,加入.无菌管中。 复口.人学:海医学院博士论义糖皮质激素。调一 发挥抑炎作用 第二部分材料与方法 离心×,弃上清,并用移液枪尽量吸干液体 取的、“的及.?的 加入新管中,混匀后,加入细胞中。 将细胞转移至转染杯。 采用.程序进行电转。 转染结束后,加入“温育的培养液终止反应。 将细胞及所有液体,转移至孔板中。 第二天进行换液。 转染后,进行刺激建立模型及进行相关实验。 .检测 详见第一部分的实验方法。 . 检测表达 详见第一部分的实验方法。 .腹腔巨噬细胞的分离培养 /小鼠腹腔注射培养基,并轻柔腹腔。 后,断颈处死小鼠,%酒精浸泡。 剪不腹部皮肤及腹膜,用吸管吸出腹腔液体,并用培养基反复冲 洗吹 打腹腔,收集灌洗液,×,弃上清。 收集细胞调整细胞浓度至×/,接种至孔板,每孔,。培养 箱孵育小时,弃上清,用培养基吹洗次,去除非贴壁细胞,加入完 全 培养基,放回培养箱中培养。 .诱导的急性炎症动物模型的构建 /小鼠腹腔注射/,后,尾静脉注射/。 复口.大学二海医学院博士论文蔓三塑坌塑型皇查鲨 糖皮质激素卜调. 发堑塑錾堡旦 一 ??????????????????????????????????????????????????????? ??????????????一 后,处死小鼠,取血液、肝脏及脾脏进行相关实验。 .检测细胞因子的含量 详见第一部分的实验方法。 . 详见第一部分的实验方法。 ..靶基因预测 三个数据库分别对靶基因进 利用、及 行预测分析。 将预测结果导入软件,并对三个数据库的预测数据进行运算,查 找三个数据库重叠的基因。这样可以缩小数据范围,提高靶基因 预测精度。 ..’质粒的构建、鉴定及纯化 .引物设计 在中,查找靶基因的序列,在其与预测结合位点 的两端设计引物,引物序列为: 上游:’一 ??鳗一’; 下游:’一??鱼 鱼?一 . 扩增 从小鼠组织中提取,并逆转录为,并以此为模板,扩增序 列片段。 反应体系为: 复】.人学上海医学院博上论文糖皮质激素下调一发挥抑炎作用 第二部分材料与方法 . 产物鉴定 取的扩增产物,用.%琼脂糖凝胶进行电泳。取凝胶在成像系统 上检测和拍照,观察条带的数量及大小。 . 产物的凝胶回收纯化 采用电泳凝胶回收的方法进行产物的纯化,按照说明书进行操作, 大 致步骤包括: 液, 电泳后,在理论条带部位进行割胶,称重,按每加 ?水浴融化凝胶。 。 将液体加入吸附柱, 。 洗液,静置后, 加“ 。 加 洗液, 去液体后,空管离心。 室温放置。 . 缓冲液洗脱,×,管中液体即回收纯化的。 .酶切和连接 和 进行酶切?过夜。 产物及一质粒以内切酶 复.大学上海医学院博卜论文
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