动物遗传学第3章第7节 人类基因组的染色体作图

null第七节 人类基因组的染色体作图 第七节 人类基因组的染色体作图 一、人类基因定位 二、人类染色体作图 三、人类基因组的物理作图法 一、人类基因定位方法**一、人类基因定位方法(一)家系与基因定位 (二)基因剂量效应法 (三)体细胞遗传学与细胞学图的制作 (四)DNA介导的基因定位（核酸探针方法）一、人类基因定位方法**一、人类基因定位方法（一）系谱分析定位法一、人类基因定位方法 (一)家系分析与基因定位**一、人类基因定位方法 (一)家系分析与基因定位一、人类基因定位方法 (二)基因剂量效应法一、人类基因定位方法 (二)基因剂量效应法基因的数量与基因产物的相关关系 21三体，超氧化物歧化酶，×1.5 2p23缺失，红细胞酸性磷酚酶 Southern杂交，基因的拷贝数 XY,XXY,XXXXY 例外 剂量补偿效应 基因互作一、人类基因定位方法 (三)体细胞杂交定位法**一、人类基因定位方法 (三)体细胞杂交定位法体细胞遗传学（somatie cell genetics） 是以高等生物的体细胞为实验材料，采用细胞离体培养，细胞融合以及遗传物质在细胞间转移等方法，研究真核细胞内基因的结构、功能及其达规律和条件等的遗传学分支学科。 意义： 可以绕过减数分裂过程，应用细胞培养方法，研究体细胞融合、突变、分离以及连锁和交换等等。把基因定位在染色体上，作成细胞学图。一、人类基因定位方法 (三)体细胞杂交定位法**1、体细胞杂交 利用遗传互补选择杂种细胞 （1）HAT选择系统 HGPRT-(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 )或TK- (胸腺嘧啶核苷激酶) 淋巴细胞—更换培养基洗脱 成纤维细胞—鸟本苷敏感 （2）营养缺陷型标记系统 在培养基上添加某种营养物一、人类基因定位方法 (三)体细胞杂交定位法一、人类基因定位方法 (三)体细胞杂交定位法**一、人类基因定位方法 (三)体细胞杂交定位法2、人类染色体鉴别 应用荧光染色法和其他特殊的染色技术，可使染色体纵长上呈现各种不同的分带(bands)， 这些分带的位置、宽狭和浓淡等随染色体号码的不同而不同，但就某一种分带技术来说，每一染色体的分带模式（banding pattern）是高度专一和稳定的。因而可用于人类染色体识别，追循染色体丢失过程。 人类染色体分带**人类染色体分带一、人类基因定位方法 (三)体细胞杂交定位法**一、人类基因定位方法 (三)体细胞杂交定位法3、染色体定(配)位(chrmosomal assignment) 同线分析 利用人体染色体和标记基因，或两个基因是否同时是否存在来定位基因 需要检测基因产物 适合定位具有调节功能的基因 诱导产生活性的基因 根据选择性标记基因互补的原理 利用鼠营养缺陷型或某些抗性的标记基因 举例：人17号染色体，胸苷酸激酶基因TK表12－1杂种细胞中标记基因的存在与人体染色体间的关系**表12－1杂种细胞中标记基因的存在与人体染色体间的关系一、人类基因定位方法 (三)体细胞杂交定位法**一、人类基因定位方法 (三)体细胞杂交定位法4、区域定(配)位（regional assignment) 应用一系列有染色体畸变的特殊克隆（如用染色体易位，缺失作图） 最小重叠区SRO（smallest region of overlap) 染色体介导的基因转移 chromosome-mediated gene transfer,CMGT 将分离到的中期染色体导入杂种细胞 染色体的某些片断保留与丢失一、人类基因定位方法 （四）DNA介导的基因定位 (核酸探针方法)**一、人类基因定位方法 （四）DNA介导的基因定位 (核酸探针方法)1、克隆基因定位法 采用已克隆基因的cDNA探针与保留在杂种细胞内的人染色体DNA酶切序列进行分子杂交，来确定克隆基因所在的染色体。 [举例] 以人体白蛋白基因cDNA为探针的克隆基因定位法 null[举例] 以人体白蛋白基因cDNA为探针的克隆基因定位法一、人类基因定位方法 （四）DNA介导的基因定位 (核酸探针方法)**一、人类基因定位方法 （四）DNA介导的基因定位 (核酸探针方法)2、原位杂交法 以标记的探针（同位素、生物素或荧光染料）直接同中期染色体进行原位杂交。原位荧光杂交过程图示**原位荧光杂交过程图示原位荧光杂交染色体**原位荧光杂交染色体FISH**FISH二、人类染色体作图**二、人类染色体作图二、人类染色体作图ASSIGNMENT OF GENE(S) TO A CHROMOSOME Linkage In situ hybridization Cell hybrids PFGE(脉冲场凝胶电泳分型技术) Rearrangement break pointsCHROMOSOME MAPPING Recombination Radiation hybridsRESTRICTION MAPPING Long cutters (sites) PFGEPHYSICAL MAPPING YAC$ Cosmids Alignment tags (I)Cloned fragments二、人类染色体作图**二、人类染色体作图1、限制性长度多态性 (restriction fragment length polymorphisms, RFLPs) 利用限制性内切酶将DNA分子切割成许多长度不等的限制性片段，这些具有长度不等的限制性片段类型在人群中呈现的多态分布现象就称为限制性长度多态性。 （1）作为遗传界标(landmark) 用一组随机克隆的基因组片段作为探针，检测 （2）鉴定待测基因与界标的连锁关系。二、人类染色体作图（2）**二、人类染色体作图（2）2、数目可变的串联重复序列 (variable number tandem repeat,VNTR) 不同数目的33bp的串联重复DNA，分布在整个基因组的不同位点。 DNA指纹：限制性酶消化产物在southern杂交中的一系列带纹 不同带纹代表了在染色体不同位置上的不同长度的DNA序列。如果双亲在某一特定带纹上表现不同时，这种差异即变成了杂合位置并可用来作图。二、人类染色体作图（3）**二、人类染色体作图（3）12345显性表型（P基因）父母标记ABCDEFGHI12345三、人类基因组的物理作图法 **三、人类基因组的物理作图法 以特定的DNA序列为界标直接排列在基因组DNA分子上，这些特定的DNA序列可以是多态的，如RFLPs，但主要是非多态的，如STS、STR、EST和特定的基因序列等。图上界标之间的距离以物理长度来表示，即以核苷酸对的数目来表示。最精细的物理图（physical map）就是基因组的全序列图。 (一)DNA分子标记 (二)物理作图基本方法 (三)DNA序列的测定 三、人类基因组的物理作图法**三、人类基因组的物理作图法(一)DNA分子标记 遗传标记是可以追踪染色体，染色体的某一节段、某一基因或某一特定DNA序列在家系中传递轨迹的任何一种遗传特性。 分子标记（molecular marker）： 特点: 是符合孟德尔分离定律，高度多态性和共显性，大多数个体是杂合基因型，基因型可直接从表型确定。 1．RFLP标记 限制性片断长度多态性 （restriction fragment length polymorphism） 三、人类基因组的物理作图法(一)DNA分子标记(2)**三、人类基因组的物理作图法(一)DNA分子标记(2)2．VNTR标记 数量可变串联重复序列 (variable number of tandem repeat)，1985年。 重复单位6-12个bp（33个bp）。 在DNA的某些位置上这种串联成簇的重复单位数目不同,因此，用在串联重复序列两侧的限制内切酶酶切后，就会产生重复数目不等到的片段。 探针Ⅰ：位于此特殊VNTR独有的DNA片段。 探针Ⅱ：根据VNTR多态性本身，可检测到所有相关的谱带。可做为DNA指纹分析。三、人类基因组的物理作图法(一)DNA分子标记(3)**三、人类基因组的物理作图法(一)DNA分子标记(3)3．STR标记 短串联重复序列（short tandem repeat） 2-6bp重复单位 特点： ①  高度多态。 ②  高频率性、分布广、平均分布。 ③  STR两侧有特异性单拷贝顺序。 ④  相对容易进行PCR 微卫星已成为取代RFLP的第二代分子标记三、人类基因组的物理作图法(一)DNA分子标记(4)**三、人类基因组的物理作图法(一)DNA分子标记(4)4．SNP（single nucleotide polymorphism） SNP就是指基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的核苷酸，且其出现频率大于1%（也有人提出为2%）。 这种界标在人基因组中可多达300万个，平均1300bp就会有一个。这种界标数目极多，覆盖密度大，可以大大提高基因组作图和基因定位的精度。 SNP可人为地划分为两种，一种是遍布在基因组非编码序列中的单核苷酸变异；另一种则是分布在基因编码序列中的SNP，称之为cSNP(coding SNPs) 1996年美国E.S.Lander提出，称为第三代DNA遗传标记。三、人类基因组的物理作图法(一)DNA分子标记(5)**三、人类基因组的物理作图法(一)DNA分子标记(5)5．非多态的短单一序列 单拷贝的，长度为300bp左右（200-500）的单一序列。 分为: ①标定位置序列（sequence tagged site ,STS） 是基因组中的单一DNA序列，只出现一次，易于PCR扩增和检测。 ②表达序列标签（expressed sequence tags,EST） 是某一cDNA分子的特有的一段DNA序列，可作为遗传标记和检测检测基因组中的编码序列。三、人类基因组的物理作图法**三、人类基因组的物理作图法(二)物理作图基本方法 [例]一个线状DNA分子，用两种限制性内切酶酶切，结果如下： BamHⅠ 8.0, 7.5, 4.5, 2.9 Kb BglⅡ 13, 6, 3.9 Kb BamHⅠ+ BglⅡ 7.5, 6, 3.5, 2.9, 2, 1 Kb 请画出这个线状DNA的限制酶谱三、人类基因组的物理作图法(二)物理作图基本方法 **三、人类基因组的物理作图法(二)物理作图基本方法 BamHⅠ 8.0, 7.5, 4.5, 2.9 Kb BglⅡ 13, 6, 3.9 Kb BamHⅠ+ BglⅡ 7.5, 6, 3.5, 2.9, 2, 1 Kb分析：三、人类基因组的物理作图法（二）**三、人类基因组的物理作图法（二）（二）物理作图基本方法 1．由长到短作图（top-down maping） (1) 完全酶切 (2) 先长切，用识别顺序少的限制酶，100Kb-1000 Kb 再短切，用识别顺序多的限制酶，酶切长片段。 (3)连接 优点：汇成的图谱比较完整 缺点：不够精细，分辨率较低三、人类基因组的物理作图法(二)物理作图基本方法 **三、人类基因组的物理作图法(二)物理作图基本方法 2.由短到长作图（bottom-up maping） 用有很多识别序列的限制性内切酶通过减少酶量，缩短反应时间，作部分酶切（partial digestion）。 特点是一些片段相互之间有重叠部分，因此部分酶切的片段两两连接，逐渐延长片段。 优点：分辨率较高，比较精细； 缺点：断片段易丢失，连接时可能出现空挡（gap） 叠连群是彼此间可通过重叠序列而连接成较长片段的一组短片组。三、人类基因组的物理作图法(二)物理作图基本方法 **三、人类基因组的物理作图法(二)物理作图基本方法 部分酶切三、人类基因组的物理作图法**三、人类基因组的物理作图法 (三)DNA序列的测定 1.化学测序法 (chemical method of DNA sequencing) 又称Maxam-Gilbert法, 先要获得单链DNA片段，100～200核苷酸，待测的5'末端用32P标记，然后分成4份，分别以4种化学方法部分降解DNA，使DNA片段在含特定碱基处切断，产生四组随机片断，然后各个处理所产生的DNA随机片段混合物分别用同一聚丙烯酰胺凝胶电泳，把不同长度的片段分开，根据所得的电泳的放射自显影，从底部最短的条带向上,一条条依次地读取，即可得碱基顺序。三、人类基因组的物理作图法(三)DNA序列的测定**32P—C—C—C—G—A—T—T—A—G—C—T—T—G—三、人类基因组的物理作图法(三)DNA序列的测定样品分成4份32P—C—C—C—G—A—T—T—A—G—C—T—T—G—分别作部分化学降解C+T 专一反应C 专一反应G+A 专一反应G 专一反应G T T C G A T T A G C C C三、人类基因组的物理作图法(三)DNA序列的测定**三、人类基因组的物理作图法(三)DNA序列的测定2．双脱氧法（dideoxy technique） 又称链终止法(chain terminator technique) 是英国Sanger发明的，又称Sanger法三、人类基因组的物理作图法(三)DNA序列的测定**三、人类基因组的物理作图法(三)DNA序列的测定2．双脱氧法（dideoxy technique） 单链DNA模板→寡核苷酸DNA引物→分成 4份，加入dATP，dGTP，dCTP，dTTP其中一种有放射性，分别加入双脱氧核苷酸 （ddATP， ddGTP，ddTTP，ddCTP）, 双脱氧核苷酸可以替代脱氧核苷酸掺入模板的DNA的互补链中，使DNA合成终止。三、人类基因组的物理作图法(三)DNA序列的测定**三、人类基因组的物理作图法(三)DNA序列的测定4种处理，对应4种终止方式+ddATP+ddCTP+ddATP+ddGTPG T T C G A TT A G C C C—C—C—C—G—A—T—T—A—G—C—T—T—G— C C C G A T T A G C T T GKlenow酶+4NTP+1ddNTP 使引物延伸 —T—T—T—A—G—C—C—G—A—T—C—C—A—模板链互补链 终止三、人类基因组的物理作图法(三)DNA序列的测定**三、人类基因组的物理作图法(三)DNA序列的测定3． DNA自动测序 同Sanger法，不同的是用4种不同的荧光染料标记引物，分别对应4种双脱氧核苷酸，把4种反应物混合后，走聚丙烯酰胺凝胶电泳，激光照射，荧光检测器。 本节结束本节结束链接到 第一～三节 性别决定与分化 第四节 剂量补偿效应 第五节 连锁基因的交换与重组 第六节 真菌类的遗传学分析HAT培养基 （HAT medium）HAT培养基 （HAT medium）HAT系次黄嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin)，HAT培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基。对具有合成DNA原料的核苷酸的形成上，在细胞内具有起始合成途径(de novo pathway)和中间合成途径（salvage pa-thway)。由于氨基蝶呤可阻碍起始合成途径，所以培养基中含有它时，细胞便只有中间合成途径，所以必须供给核苷酸。至于缺失中间合成途径的细胞，可失去增殖能力臻于死亡。根据这一点，不仅把混存于细胞群中的正常细胞，通过试管内培养进行选择，例如嘌呤的中间合成途径缺失株和嘧啶的中间合成途径缺失株，由于可以互补，所以两者的杂种细胞，即使在氨基蝶呤的存在条件下也可以增殖。在这种情况下，利用HAT培养基可对杂种细胞进行选择。次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷可作为中间合成途径的原料而进行添加。次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT) 胸苷酸激酶（TK）次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT) 胸苷酸激酶（TK）在培养细胞药物抗性突变型中研究得最为广泛的药物抗性是氮鸟嘌呤抗性。氮鸟嘌呤是一种鸟嘌呤类似物，当培养基中含有这一药物时，细胞就会由于其结构与鸟嘌呤类似而利用这一药物，将它掺入到细胞自身的DNA中，最终导致细胞死亡。 细胞内参与这一反应的一个重要酶称为次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(简称HGPRT,hypoxanthine guanine phosphoribosyl-transferase)。HGPRT是细胞内嘌呤合成应急途径中的一种酶，它的作用是将次黄嘌呤和鸟嘌呤转变成次黄嘌呤核苷酸或鸟嘌呤核苷酸，从而使后者参与DNA合成过程。哺乳动物细胞中核苷酸合成的不同途径，氮鸟嘌吟抗性突变缺失HPRT酶，因而不能通过补救途径掺入DNA。从头合成途径利用HGPRT与嘌呤类似物之间的这种特殊关系，可以通过嘌呤类似物来筛选HPRT-细胞，这种选择方法称为正向选择(forward selection)。 相反，如果HPRT-细胞发生回复突变(reverse mutation)，恢复为HPRT＋ 。对于这类回复突变型(revertant)的选择可在HAT选择培养基上进行的。HAT选择培养基含次黄嘌呤、氨基蝶呤(aminopterin）和胸腺嘧啶(thymidine）三种重要成分。氨基蝶呤可阻止从头合成途径的过程，所以细胞内HPRT活性必须恢复，细胞才能存活。对于这类回复突变型的选择称为反向选择(reverse selection)。胸苷酸激酶(TK)也可成为选择标志。5-嗅尿嘧啶(BrdU)为嘧啶类似物，掺入DNA可导致细胞致死。而TK– 细胞中因BrdU不被利用，故可在含高BrdU的培养基中生长。这类抗性细胞称为BrdU抗性细胞（例如LMTK– 细胞系）。 null