人脐带间充质干细胞操作规范

人脐带间充质干细胞操作规范 一、人脐带间充质干细胞的分离和培养 1. 准备4~5个培养皿，打开放在超净台中，将消毒过的平剪×1，弯剪×2，有齿镊子×4，放入超净台，紫外照射30 min，通风10 min; 2. 在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水，在2#培养皿倒入25 ml酒精; 3. 将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台，用弯嘴钳取出脐带放入1#培养皿，清洗残留血渍，用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血; 4. 将脐带转移至2#培养皿，完全浸泡，计时1 min; 5. 将脐带转移至3#培养皿，用平剪剪成3 cm左右的小段，清洗脐带内的积血(如果积血较多，可再次转入另一加盐水的培养皿); 6. 用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉，剥离华尔通氏胶，放入4#培养皿; 7. 将剥离的胶体转移至50 ml离心管中，2000 rpm离心5 min; 8. 弃上清液，将胶体倒入干净的培养皿中，用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中; 9. 以0.5 ml/瓶的量将胶体组织块接种至T75培养瓶，每瓶加入4 ml脐带有血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/ml bFGF)，水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀; 10. 第2天观察是否有污染，每3天换一次液，并观察细胞爬出情况(过程中须注意平稳地拿放培养瓶，避免组织块发生移动); 11. 培养14天左右，倒去上清培养液，加生理盐水(3 ml/瓶)洗涤，用0.25%胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及组织块，并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化; 12. 收集细胞及组织块悬液，2000 rpm离心5 min; 13. 弃上清液，加入适量生理盐水混匀，用70 μm滤网过滤去除组织块，即得到P0代脐带间充质干细胞; 614. 细胞计数，按10/瓶接种，每瓶加入10 ml脐带无血清培养液(UltraCULTURE + 2% Ultroser G + 1% Glutamine + 1% MEM NAA)，每3天换一次液; 15. 细胞融合率达到80%左右时，加胰酶消化，按1: 3传代。 二、细胞传代 1. 观察细胞融合率在80%以上时，进行传代; 2. 将培养瓶依此排好，取10~20瓶放入超净台，同时进行操作; 3. 依次倒去上清液(预留10~20 ml作终止液)，每瓶加入3 ml生理盐水，洗涤细胞后弃去; 4. 每瓶加入2 ml胰酶，消化2~3 min，镜下观察，待细胞收缩变圆，加入1 ml终止液终止消化; 5. 轻轻拍打培养瓶底面，收集消化液，再用10 ml生理盐水逐瓶洗涤，并收集洗涤液，混合消化液和洗涤液，2000 rpm离心5 min; 66. 弃上清液，加入适量脐带无血清培养液重悬细胞，按10/瓶接种，每瓶培养液终体积为10 ml。 三、细胞冻存 1. 预先配置细胞冻存液(FBS + 10% DMSO):取50 ml离心管，加入FBS，然后逐滴加入DMSO并摇匀，放入4?C培养箱冷藏; 72. 将消化得到的细胞悬液2000 rpm离心5 min，按10/ml密度重悬于细胞冻存液，分装入冻存管，每管装量不超过1 ml; 3. 将冻存管置入预先放置室温下的梯度降温盒后，放入-80?C冰箱; 4. 24 h后，将冻存管放入冻存盒内，继续于-80?C冰箱内保存，或转移至液氮罐中，长期储存; 5. 梯度降温盒每使用5次更换一次异丙醇，每次加液量为250 ml。 四、细胞复苏 1. 取冻存细胞，置于37?C水浴至基本融化，用酒精消毒冻存管管壁和管口，放入超净台; 2. 将冻存液转移至50 ml离心管，逐滴加入20~30 ml生理盐水并摇匀，2000 rpm离心5 min; 3. 弃上清液，加入30 ml生理盐水，重悬细胞，2000 rpm离心5 min; 64. 弃上清液，加入适量脐带无血清培养液重悬细胞，按10/瓶接种，每瓶培养液终体积为10 ml。 五、细胞出库 1. 复苏或消化得到的细胞在出库前需用生理盐水洗涤3遍，每次洗涤2000 rpm离心5 min; 2. 加入适量含10%人血清白蛋白的生理盐水，重悬细胞; 3. 按规格要求分装细胞，粘贴标签并做好记录; 4. 如需运输，建议用泡沫盒加若干冰袋包装出库; 5. 冻存细胞如需出库，必须在泡沫盒内放入适量干冰，将冻存管置于干冰内部，装箱出库。