冷冻后小鼠卵母细胞的透明带和质膜对体外受精的影响

冷冻后小鼠卵母细胞的透明带和质膜对体外受精的影响 冷冻后小鼠卵母细胞的透明带和质膜对体 外受精的影响 ? ReproductionandPhysiology2008年凳44攀寨11麓 冷冻后小鼠卵母细胞的透明带和 质膜对体外受精的影响 王晓旭,周光斌,李秀伟,闫长亮,朱士恩 (1.中国农业大学动物科技学院,北京100094; 2.中国农业大学农业生物技术国家重点实验室,北京100094) 摘要:以冷冻保存后的小鼠卵母细胞为实验材料,研究其膜对体外受精效果的影响.在室温(25?0.5)?条件 下,以1O%乙二醇(EG)+10%二甲基亚砜(DMSO)为预处理液,EDFS30为玻璃化溶液.将卵母细胞于10% EG+10%DMSO溶液中预处理30s,然后再移入EDFS30中处理25s,以开放式拉长细管(OPS)为承载器投入液 氮中,即两步法玻璃化冷冻保存.结果表明:冷冻卵母细胞受精后的卵裂率(46.67%)显着低于新鲜组的(86.O6%)(P< O.05o冷冻卵母细胞去透明带后质膜上的平均精子结合数(10.70)与对照组(1O,81)无显着性差异(P>0,05),形成雌雄 原核数也无显着性差异(2.49VS.2.59)(P>0.05).冷冻卵母细胞透明带打孔后,其体外受精后卵裂率与新鲜组差 异不显着(84.73%VS.91.19%)(P>O.05).因此玻璃化冷冻保存小鼠卵母细胞透明带的变化是影响体外受精效果 的主要因素之一. 关键词:卵母细胞;OPS;玻璃化冷冻;体外受精;小鼠 中图分类号:S865130,3文献标识码:A文章编号:0258—7033(2008)11-0012—04 配子和胚胎的冷冻保存技术可使胚胎生物技术 不受时间和地域的限制,对基础研究,商业应用以及 建立良种动物的基因库有重要意义.而卵母细胞的 冷冻保存相对于胚胎又有许多优势:(1)可为克隆, 转基因等生物技术的开展随时提供基础材料;(2) 为人类医学建立模型.可延迟妇女生育年龄,如在 癌症治疗之后的生育,因此可以保证更多的生育机 会;(3)建立"卵子库",对于动物的保种,防止优良 品种和濒危动物的灭绝具有重要意义. 近年来,卵母细胞的冷冻保存研究虽然取得了 巨大的进步,但与胚胎冷冻保存相比,其效果依然不 尽人意.由于卵母细胞自身的一些结构特点,仍然 存在冷冻后卵母细胞存活率,受精率较低,发育效果 较差的现象I".而其中受精率较新鲜卵母细胞低是 困扰卵母细胞冷冻保存的一个大问题.一些研究结 果显示,卵母细胞在冷冻后存在透明带变硬I2],质膜 变脆的现象I,这些现象可能是导致受精率下降的 重要因素.但是对于导致受精率下降的具体因素尚 不十分清楚,因此,本实验以小鼠为实验动物模型, 收稿日期:2007—09—19;修回日期:2007—10—23 基金项目:高等学校博士点专项科研基金(20060019031) 作者简介:王晓旭(1982一),男,内蒙锡林郭勒盟人,在读硕士研究生 通讯作者 @中鸯系患 研究OPS法玻璃化冷冻后小鼠卵母细胞的透明带 与质膜对体外受精效果的影响. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1实验动物5,6周龄的昆明白小鼠(军事医 学院实验动物中心,合格证号:SCXK一(军)2002— 001). 1.1.2OPS(openpulledstraw)的制备用自制小酒 精灯,将0.25mL塑料细管(France)加热后拉制成直 径为0.10,0.15mm,管壁厚度约为O.05mm的开放 式小管. 1.1.3预处理液10%EG(ethyleneglycol,Sigma) +1O%DMSO(dimethylsulphoxide,Sigma).基础液为 PBS,充分混匀后按3g/L添加BSA(Roche). 1.1.4玻璃化溶液Fs液:3O%聚蔗糖(Ficoll70. Sigma)和O.5mol/L蔗糖(sucrose,Sigma)于PBS溶液 中充分混匀即可.EDFS液:按EG:DMSO:FS=1.5: 1.5:7()的比例混匀配制成EDFS30玻璃化溶液. 1.1.5解冻液O.5mol/L的蔗糖溶液. 1.1.6培养液均为HTF溶液『7]. 1.2方法 1.2.1卵母细胞的采集饲喂于控光(光照14h) 条件下的5,6周龄雌性小鼠,隔日腹腔注射PMSG 2008年繁44卷粲{1瀚 和hCG(宁波市激素制品厂)各10Iu,于hCG注射 后13,16h由输卵管中采集卵丘卵母细胞复合体 (COCs).将其移人含300IU/mL透明质酸酶的M2 溶液中,(37?0.5)?恒温台上处理3,5min,收集形 态正常,有第一极体的卵母细胞于M2溶液中洗净 后供实验使用. 1.2.2卵母细胞的OPS法玻璃化冷冻保存冷冻: 实验前2h将室温调至(25?0.5)?,将实验所需溶 液及器具于(37?0.5)?操作台上充分平衡.用OPS 将卵母细胞移人预处理液中平衡30S,然后移人玻 璃化溶液中平衡25S后再吸人OPS中,直接投人液 氮中冷冻保存.解冻:OPS由液氮中取出后,迅速浸 人置于(37?0.5)?恒温台上含有0.5mol/L蔗糖溶 液的表面皿中,解冻后在实体显微镜下回收卵母细 胞,并将其移人相同浓度的蔗糖溶液中平衡5min, 脱去内部的抗冻保护剂后,移人HTF培养液,洗净后 挑选形态正常的卵母细胞置于CO:培养箱(37?, 5%CO2,湿度100%)中培养. 1.2.3卵母细胞的去透明带将卵母细胞移人pH 调至2.5的M2溶液中约30S,至透明带即将消失, 移至M2溶液中稍加吹吸,透明带即脱落,再用M2 溶液洗3,4次待用. 1.2.4卵母细胞透明带打孑L卵母细胞洗净后放人 M2溶液中.利用piezo对卵母细胞透明带打孑L,洗净移 至平衡好的受精液中"孵育"10min后进行体外受精. 1.2.5体外受精精子获能:取雄鼠附睾尾,于平 衡过夜的受精用HTF中剪开后,继续放人培养箱中 培养1h使精子充分获能. 有透明带(包括透明带打孑L)卵母细胞的体外受 精:将卵母细胞移人受精用HTF液中,用移液器吸 ReproductionandPhysiology?繁燕狸 取精子悬浮液加人含有卵母细胞的液滴中,使精子 密度为5X10个/mL.6h后于培养用HTF中洗涤 卵子,继续培养,24,72h和120h分别记录2一细 胞,桑椹胚及囊胚的发育情况. 去透明带卵母细胞的体外受精:受精操作同上, 受精后3h用培养用HTF洗涤,吸取部分卵子,用 Hochest33342染色,在荧光显微镜下统计结合在每 个卵母细胞质膜上的精子数;其余的受精卵继续培 养,再经培养3h后用Hochest33342染色,统计卵母 细胞内的原核数.对照组为新鲜卵母细胞,操作同 上. 1.2.6统计分析用SAS数据统计分析系统进行 统计分析,卵裂率,发育率使用x独立性检验分 析,精子结合数,雌雄原核形成数使用非配对设计两 样本平均数的差异显着性检验分析. 2结果 2.1OPS法冷冻对卵母细胞体外受精效果的影 响由表1可见,使用EDFS30为冷冻液,OPS两步 法冷冻后小鼠卵母细胞的2一细胞发育率为 46.67%,显着低于新鲜卵母细胞(86.06%)(P< 0.05),同时桑椹胚和囊胚发育率(40.74%和37.78%) 也显着低于新鲜组(83.64%和82.42%)(P<0.05). 表1OPS法冷冻卵母细胞解冻后体外受精结果 组别荔胫囊胚数,枚 OPS法玻璃化冷冻组13563(46.67%)55(40.74%)51(37.78%) 新鲜对照组165142(86.06%)138~3.64%1136(82.42%)t 注:同列数据肩标不同小写字母表示差异显着(P<0.05),下表同. 2.2OPS法冷冻卵母细胞去除透明带后体外受精 效果由表2可知,OPS法冷冻的卵母细胞去除透 表2OPS法冷冻卵母细胞去透明带后体外受精结果 注:精子结合数包括卵子质膜表面结合精子数及穿入卵子精子数;原核数为卵子内 雌雄原核总数 明带后,体外受精3h后卵子质膜上平均精子结合 数为10.70,与对照组的10.81无显着性差异(P> 0.05).受精后6h每卵平均雌雄原核数也无显着性 差异(P>0.05). 2.3透明带打孑L对OPS法冷冻卵母细胞体外受精 效果的影响由表3可见,透明带打孑L后的冷冻卵 母细胞体外受精后2一细胞发育率(84.73%)与新鲜 对照组(91.19%)无显着性差异(P>0.05).但是桑 椹胚和囊胚发育率(74.81%,57.25%)显着低于对 照组(86.79%,83.65%)(P<0.05). 表3OPS法冷冻卵母细胞透明带打孔后体外受精结果 囊胚数做 OPS法玻璃化冷冻组131111(84.73%)98(74.81%)75(57.25%) 新鲜对照组159145(91.19%)138(86.79哟133(83.65%) 中鸯牧强惫嘲 ? ReproductionandPhysiology 3讨论 胚胎的冷冻保存已经获得了较大的成功,相比 之下,迄今卵母细胞的冷冻保存仍未获得理想的效 果.本实验结果显示,在本实验条件下OPS法冷冻 的小鼠卵母细胞的体外受精效果,无论是卵裂率,还 是桑椹胚和囊胚发育率都显着地低于新鲜卵母细 胞.也就是说冷冻保存对卵母细胞产生了较大影 响,即卵母细胞的受精能力下降. 针对卵母细胞冷冻保存后受精能力下降这一问 题,本实验首先在透明带上寻找突破点.透明带是卵 母细胞的包被物,在正常的受精过程,精子穿过透明 带,与卵子质膜结合引发皮质反应,将皮质颗粒从卵 母细胞的皮质胞吐到卵周隙,并且释放皮质颗粒酶. 这些酶通过改变透明带,质膜或是两者,阻止多精受 精.而有研究表明,在卵母细胞的慢速冷冻过程中,于 DMSOI4]和丙二醇f5l溶液中暴露会引起皮质颗粒的提前 释放,因此不利于精子的穿人和受精.另外,牛体外成 熟卵母细胞玻璃化冷冻保存后,在0.1%蛋白酶中消 化透明带时间为477.5S,而对照组只需372.5S,可见 冷冻解冻后卵母细胞的透明带增强了对蛋白酶溶解 的抵抗力[61.而在本实验中,将冷冻卵母细胞和新鲜卵 母细胞透明带去除后暴露出质膜,再进行体外受精, 其受精效果相似,即OPS法冷冻后,卵母细胞的质膜 对于受精率的影响并不明显,精子对冷冻与新鲜的无 透明带卵母细胞的质膜的结合能力,以及它们形成雄 原核的能力也无显着性差异. Vincent等发现冷冻过程会引起哺乳动物卵母 细胞皮质颗粒的提前释放,导致透明带硬化,不利于 精子穿卵及受精.而当冷冻保存导致卵母细胞的受 精能力下降时,可以利用卵母细胞部分透明带切开 (PZD)及piezo辅助透明带开口(ZIP)llo的方法辅 助受精.另外,Anzai等…]介绍了激光辅助透明带打 孔(ZD)辅助受精技术,该技术一次可以处理大量的 卵母细胞.其中,PZD及激光辅助ZD方法需要使用 高浓度的蔗糖对卵进行预处理,使卵收缩,避免操作 损伤.并且PZD方法虽然可以显着提高冷冻精子的 受精能力,但操作过程中透明带开口过大,进行2一 细胞胚胎移植后易导致卵裂球损失,产仔率下降,因 此需要体外培养至桑椹胚或囊胚期后移植比较适 宜.而ZIP方法对卵损伤小,超过95%的胚胎经ZIP 操作后存活,单位时间内处理卵的效率显着高于 @中固螽絮患 2008颦第44卷纂{1麓 ICSI方法.为此,本实验将对卵母细胞进行透明带打 孔(ZIP)后再进行体外受精,结果OPS法冷冻组与 对照组在2一细胞发育率上无显着性差异,即透明带 打孔可大大提高冷冻卵母细胞的体外受精率.因 此,本实验可以认为,透明带的变化是造成小鼠卵母 细胞冷冻后受精率下降的主要原因. 因此,小鼠卵母细胞经OPS两步法冷冻保存后 受精率下降与质膜的关系并不明显,而主要是由透 明带的变化引起的. 参考文献: [1]孙青原,秦鹏春,徐立滨.哺乳动物卵母细胞的冷冻保存方 法[J1.生物技术,1993,3(1):5-9. [2]WiningerJD,KortHI.Cryopreservationofimmatureandnla— turehumanoocytes[J].SeminarsReprodMedi,2002,20:45—49. [3]DidionBA,PompD,MartinMJ,eta1.Observationsonthe coolingandcryopreservationofpigoocytesatthegerminalvesi— clestage]J].JAnimSci,1990,68:2803—2810. [4]PicketingS,BraudeP,JohnsonM.Cryoprotectionofhuman oocytes:inappropriateexposuretoDMSOreducesfertilization rates[J].HumReprod,1991,6:142—143. [5]SchalkoffME,OskowitzSP,PowersRD.Ultrastructuralobser- vafionsofhumanandmoHseoocytestreatedwithcryopreserva— tives[J].BiolReprod,1989,40:379—393. [6]冯怀亮,孙青原,李子义.牛体外成熟卵母细胞冷冻保存的 研究[Jl_畜牧兽医,1995,26(6):481—486. [7]QuinnKerinJF,WarnesGM.Improvedpregnancyrateinhuman invitrofertilizationwiththeuseofamediumbasedonthecomposi— tionofhumantubalfluid]J].FertilSteril,1985,44:493—498. [8]VincentC,PicketingSJ,JohnsonMH.Thehardeningeffectof dimethylsu】phoxideonthemousezonapellucidarequiresthe presenceofanoocyteandisassociatedwithreductioninthe numberofcorticalgranulespresent]J].JReprodFertil,1990,89: 253—259. [9]NakagataN,OkamotoM,UedaO,eta1.Positiveeffectofpartial zona-pellucidadissectionontheinvitrofertilizingcapacityof cryopreservedC57BL/6Jtransgenicmousespermatozoaoflow motility]J].BidReprod,1997,57:1050-1055. [10]KawaseY,1wataT,UedaO,eta1.Effectofpartialincisionof thezonapellucidabypiezo—micromanipulatorf0rinvitrofertil— izationusingfrozen——thawedmousespermatozoaonthedevelop—— mentalrateofembryostransferredatthe2-cellstage]J].BiolRe— prod,2002,66:381—385. [11]AnzaiM,NishiwakiM,YanagiM,eta1.Applicationoflaser—as— sistedzonadrillingtoinvitrofertilizationofcryopreserved mouseoocyteswithspermatozoafromasubfertiletransgenic mouse[J].JReprodDev,2006,52:601—606. 2008年第44卷第11期ReproductionandPhysiology?繁鞴篷 阿特拉津对雄性大鼠生殖机能的影响 周博,舒小琼,栾新红,刘梅,姜丽,刘贺 (沈阳农业大学畜牧兽医学院,辽宁沈阳110161) 摘要:研究阿特拉津对雄性大鼠血清睾酮及精子畸形率的影响,为探讨其他环境激 素(如二嗯英,二氯二苯氯 乙烷等)对动物的作用机理奠定基础.选取WISTER雄性大鼠75只,随机分成5组 (3个处理组,空白对照组和阳 性对照组),处理组和空白对照组分别按225.5,111.5,55.625,0mg/kg腹腔注射阿特 拉津,阳性对照组按0.5 mg/kg腹腔注射苯甲酸雌二醇,并于注射后3O,60d和90d采样测定大鼠血清睾酮 的含量和精子畸形率.结果表 明:阿特拉津对大鼠血清睾酮水平和精子畸形率均有影响,使血清睾酮水平下降,精子畸形率增加,从而影响雄性 大鼠的生殖机能,且随着作用时间的延长,这种效应表现得越明显. 关键词:阿特拉津;精子畸形率;睾酮;大鼠 中图分类号:$865.P20.3文献标识码:B文章编号:0258—7033(2008)11-0015—03 阿特拉津(Atrazine)又名莠去津,全称为2一氯 _4一乙胺一6一异丙胺一1,3,5一三嗪,属均三氮苯类 农药,是一种选择性内吸传导型苗前,苗后除草剂, 也是一种世界公认的类雌激素类物质.由于阿特拉 收稿日期:2007—12—05;修回日期:2008一O1—28 基金项目:辽宁省教育厅资助项目(05IA09) 作者简介:周博(1981一).男,在读硕士 通讯作者 津的广泛使用,加之其在土壤中存留期长达4,57 周[1-4】,该化合物及其降解产物已在地表水,地下水, 雨水,大气中被检测出来,其浓度远远超过美国环保 局规定的安全浓度,造成对环境的污染.有人提出, 阿特拉津具有环境雌激素的特性,可通过食物链或 直接接触等途径进入人或动物体内,干扰机体的内 分泌系统功能?^3],但也有人认为阿特拉津威胁并非 很大.为此设计本试验,着重研究除草剂阿特拉津 EffectsoftheMembranesofVitrificatedMouseOocytesoninvitroFertilization WANGXiao-xu.,ZHOUGuang-bin,LIXiu-wei,YANChang—liang,ZHUShi—en, (1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing10009 4,China; 2.StateKeyLaboratoryforAgrobiotechnology,ChinaAgnculturalUniversity,Beijing1000 94,China) Abstract:ToinvestigatetheeffectOthemembranesofmouseoocyteonfertilizationnvitroasa modelusingoocyteof mouseaftervitrification.Underroomtemperature(25? 0.5)oc,oocyteswerevitrifiedinOPSbytwostepsvitification methodwithcryprotectantsolutions— thatiS.10%EG+10%DMSOandEDFS30.Oocyteswerefirstlypretreatedin10% EG+10%DMSOfor30S.thenexposedtoEDFS30for25S.Theresultsshowedthatthecleavagerateofvitrificated oocytesweresignificantlylower(46.67%VS.86.06%)(P<0.05)thanthatofcontrols.Theaveragenumberofsperm combinedonthesurfaceoftheoocytes(10.70vs.10.81)andtheaveragenumberofpronuclearsinoocytes(2.49VS.2.59) wereallsimilar>0.05)betweenvitrificatedandno— treatedoocytes.Afterpartialzonapellucidaincisionbypiezo micromanipulation(ZIP),thecleavagerateofthevitrificatedoocyteswassimilar(84.73%VS.91.19%)>0.05)withthat ofcontrols.Inconclusion,thechangeofthezonapellucidaofvitrificatedmouseoocyteswasoneofthemostimportant reasonstoreducethefetilizationrate. Keywords:oocytes;openpulledstraw;vitification;invitrofetilization;mice 固鸯牧东是@