呼吸道合胞病毒蛋白的研究进展

呼吸道合胞病毒蛋白的研究进展 中国生物制品学杂志2006年9月第19卷第5期 ChinJBiologicalsSeptember2006,Vo1.19No.5?541? 呼吸道合胞病毒蛋白的研究进展 李光综述井申荣审校 【综述】 【摘要】本文对呼吸道合胞病毒基因组编码的病毒蛋白,包括膜蛋白,核蛋白,融合蛋白,基质 蛋白及非结构蛋白的结 构和功能的研究进展进行比较全面的综述. 【关键词】呼吸道合胞病毒;病毒蛋白;结构;功能 呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科肺病毒属 成员,中等大小,有包膜,基因组为非节段性单股负 链RNA,全长为15225个核苷酸,编码11个蛋白. 在RSV负链RNA基因组上从3至5端依次为 NS1,NS2,N,P,M,SH,G,F,M2,L,其中G,F,SH三 种蛋白位于膜上,M基因编码基质蛋白,N,P,L基 因编码的蛋白位于单股负链RNA上.M2—1,M2-2, NS1,NS2编码的蛋白并不出现在成熟病毒颗粒中, 它们为非结构蛋白,只在特殊的阶段出现,发挥特殊 的作用.RSV现出极小的抗原异质性,尽管这 样,RSV还是分为两个亚型:A和B.它们主要的区 别在于G,F,N,P蛋白上的抗原组成不同,其中G 蛋白的可变性最高,A和B亚型中的氨基酸序列只 有53%的同源性,相反,两个亚型间F和P蛋白则 有较高遗传及抗原同源性?. 1.蛋白的结构与功能 1.1G蛋白:G蛋白(Glyeoprotein)属于?型糖 蛋白,含有299个氨基酸,相对分子质量为90000, 包括N一端的胞浆区,疏水的锚定区和外功能区.外 功能区由两个粘液素样区域组成,这两个区域高度 可变,富含Ser,Thr和Pro,并含有大量N一连接寡糖 和O一连接寡糖【2J,同时它们之间有13个氨基酸,其 中含有4个非常保守的Cys残基,它们对G蛋白的 贴附活性并没有影响.G蛋白188位Arg和192 位Tyr可以通过诱导保护性免疫和启动嗜酸性粒细 胞的增殖来抵抗RSV感染,188位Arg周围的序列 对主要保护性表位至关重要,但对188位上游的表 位来说,影响要小一些j. C一端的可变区域存在着许多宿主抗体可以识别 的表位,病毒通过改变这个区域的抗原结构,以逃避 宿主的免疫反应.通过N一端糖基化掩盖抗原表位 作者单位:昆明理工大学生物技术研究中心(昆明65O224). 通讯作者:井申荣,E—mail:jingshenrong@163.eom 可能是病毒逃避宿主免疫应答的另外一种方式.除 了膜G蛋白外,病毒还产生一种N一端截短了的可溶 性分泌型G蛋白,能使受侵染的细胞和释放的病毒 粒子逃避宿主的免疫应答. 最近有实验表明J,不表达膜G蛋白但可以表 达可溶性G蛋白的重组RSV毒株在体外实验中仍 能有效地侵染,在活体实验中,侵染力也仅有轻微的 减弱,这就意味着可溶性G蛋白能促进病毒的侵 染;既不表达膜G蛋白也不表达可溶性G蛋白的 RSV毒株也可以侵染宿主细胞,但这种突变型病毒 在侵染人和小鼠呼吸道上皮细胞时,效率降低很多, 表明G蛋白对病毒进入宿主细胞并不是必需的,但 作为一个辅助蛋白,可以促进贴附过程. 1.2F蛋白:F蛋白(Fusionprotein)对于RSV 来说是不可缺少的,在RSV的生命周期里最关键的 一 步就是进入宿主细胞,而这一步由F蛋白来介导, 所以F蛋白已经成为RSV疫苗的主要候选蛋白. 同许多其它病毒的F蛋白一样,RSV的F蛋白 是一种典型的I型糖蛋白.RSV首先合成F蛋白 前体(FO),为N一端糖基化的蛋白,有574个氨基酸, 相对分子质量为70000.FO没有活性,经过蛋白酶 的切割,形成C一端的F1和N一端的F2,F1和F2通过 二硫键相连.裂解发生在F2的C一端,由宿主细胞 的内源性蛋白酶来切割,该内源性蛋白酶具有胰蛋 白酶样的序列特异性,能暴露融合多肽F1N一端15, 17个疏水氨基酸. F蛋白进入细胞膜的部分位于F1的N一端,而 穿膜部分位于靠近F1的C一端.邻近这两个功能区 的是两段7个核苷酸的重复序列,为HR?C和HR— N,形成保守的三聚体发夹结构,RSV通过改变发夹 结构的构象,来介导病毒与宿主细胞膜的相互融合 及病毒进入,所以这个发夹结构是很好的药物靶点, 与HR—C区域结合的多肽能抑制病毒与细胞膜融合 前的构象改变. ? 542?中国生物制品学杂志2006年9月第l9卷第5期ChinJBiol晒 calsSeptember2006,Vo1.19No.5 F蛋白还与Ras家族的RhoA有关,RhoA是 一 种鸟氨酸三磷酸酶,在RSV侵染的细胞中,RhoA 的表达有利于合胞体的形成.此外,RhoA的衍生多 肽与F蛋白有高度的亲和性,能够阻止病毒自由地进 入宿主细胞.表面蛋白A(sP—A)和乳铁传递蛋白 (Lr)对F蛋白有特异的结合性,能够调节RSV的感 染,在呼吸道粘膜上的天然免疫中起着重要作用. 1.3SH蛋白:SH蛋白(Smallhydrophobicpro— tein)在不同RSV亚型中所含氨基酸数目略有不同: A亚型中含有64个氨基酸,B亚型中含有65个. 尽管观察到SH蛋白在RSV感染的细胞中遍及 整个细胞质,但在富含神经节苷脂(GM1)的膜结构 中的高尔基复合体内积累得特别多,这就意味着在 病毒感染时期,病毒分泌途径上的一些细胞器,如内 质网和高尔基复合体,是SH蛋白的主要积累场所. 有一种假设认为SH蛋白可以形成离子通道. 1997年Perez等在大肠杆菌中表达人RSV的SH 蛋白时,通过大肠杆菌膜渗透压的变化,间接证 明了这一点.另外,还有一些研究说明SH蛋白有 助于维持病毒外壳的稳定性,可能参与编码毒力因 子?引.对RSV重组突变株的功能分析表明:SH蛋 白并不参与结合和感染,而且至少在C蛋白缺失的 情况下,它还能抑制病毒感染细胞的融合以及病毒 在细胞培养物中扩散u?.在RSV侵染的Vero细胞 中发现SH蛋白具有磷酸化位点,MAPKp38的抑制 物SB203580能特异阻断这种磷酸化,表明SH蛋白 磷酸化是通过依赖MAPKp38的途径进行的,在 RSV侵染宿主细胞时,依赖MAPKp38途径的酪氨 酸激酶活性变化导致了SH蛋白的改变,从而影响 SH蛋白在细胞内的分布?引. 1.4M蛋白:M蛋白(Matrixprotein)是基质蛋 白,有256个氨基酸,相对分子质量为28000. 病毒侵染细胞后,M蛋白出现在早期核中,可 以抑制宿主细胞的转录.RSV感染的宿主细胞核 提取物在体外有较低的转录活性,而且还可以抑制 正常细胞核提取物的转录活性?引.M蛋白具有 RNA结合能力,这种结合能力没有序列和长度特异 性.与RNA结合的区域位于120—170位氨基酸残 基之间,Lys(121,130,156和157位)和170位的 Arg在副粘病毒科中是非常保守的,对RNA的结合 能力是必需的.而且,无论M蛋白是否具有RNA 结合活性,都可以形成高分子寡聚物l】引. 1.5M2—1蛋白和M2-2蛋白:RSV的M2基因 处于F基因和L基因之间,编码两种假定的蛋白 (Putativeproteins):M2—1和M2-2. M2—1蛋白含191个氨基酸,由靠近M2mRNA 5端的ORF所编码,与M2-2的ORF有1O个氨基酸 的重叠. M2—1蛋白在RNA转录延伸中起促进作用,减 慢RNA的转录中止,有利于RNA转录时顺利读过 每个基因连接点?. M2—1蛋白有Cys3Hislzinc磷酸化的结合基序, 是其功能所必需的,并且通过该基序与N蛋白相互 作用.其磷酸化位点是位于58位和61位的Ser,这 种磷酸化作用在RNA转录中发挥重要的功能.此 外,在病毒侵染过程中,M2—1蛋白对RSVmRNA的 单顺反子和多顺反子有结合能力?. M2-2蛋白含有9O个氨基酸.通过对M2-2基 因缺失的重组RSV毒株进行分析,M2-2蛋白对于 病毒复制来说可有可无,但在病毒侵染细胞时起很 大的作用,与致病机理也有密切关系?J.也有人认 为,它对整个转录过程起调控作用J. 1.6L蛋白:L基因含有6501个核苷酸,包括 一 个ORF,编码2165个氨基酸的L蛋白(Largepol— ymeraseprotein),相对分子质量为250000,为RNA 聚合酶.通过与副粘病毒科其他成员的氨基酸序列 对比,RSV的L蛋白在N一端多出7O个氨基酸.原 因是L基因和上游M2基因有一段基因重叠,使用 了新的翻译起始位点. 如果L蛋白1049位上Asp突变成Asn,将影响 通读表现型,并特异地影响转录中止,但对整个基因 组的复制没有影响.当1049位表达Asn时,L蛋白 能够在每个基因接头处识别和中止转录,转录活性 明显高于此处表达Asp的L蛋白. 1.7P蛋白:P蛋白(Phosphoprotein)是RSV RNA依赖RNA聚合酶复合体的关键成分之一,有 244个氨基酸. P蛋白在两簇Ser残基处是磷酸化的,一簇位 于[116/117/119],另外一簇位于[232/237].在病 毒复制中,这5个Ser残基降低了磷酸化电势;敲除 了5个磷酸化位点时,基因的表达量减少了 20%.将敲除了2个磷酸化位点(S232A/S237A [PP2])和5个磷酸化位点(S116L/S117R/S119L/ S232A/S237A[PP5])的突变基因分别导人有侵染 性的RSVA2毒株中,对?P同位素标记的两种侵染 细胞进行免疫沉淀分析,发现P蛋白的磷酸化在前 者(rA2一PP2)中减少了80%,在后者(rA2一PP5)中减 少了95%,N蛋白和P蛋白的相互作用也分别减少 中国生物制品学杂志2006年9月第l9卷第5期 ChinJBiologicalsSeptember2006,Vo1.19No.5?543? 了30%和60%.两种突变株在Vero细胞中复制良 好,突变株rA2一PP2在Hep-2细胞中也能最大限度 地复制,而rA2.PP5在Hep-2细胞中几乎不能复制. 病毒在被侵染的Hep-2细胞中出芽生殖依赖于P蛋 白去磷酸化,因为大多数rA2一PP5仍然包含在细胞 里面.此外后者(rA2.PP5)在小鼠和棉鼠呼吸道上 的复制活性也比前者(rA2一PP2)低.这些实验说 明,虽然体外实验中P蛋白的磷酸化对于病毒的复 制是非必需的,但体内和体外实验均表明P蛋白的 磷酸化对于复制的效率有很大促进作用?引. 1.8N蛋白:最近几年对N蛋白(Nucleoprote— in)研究很少.N蛋白的突变可以影响其与RNA的 结合能力以及病毒的一些功能,如复制.开发一些 病毒(如麻疹,RSV,埃博拉和流感病毒)的减毒活疫 苗时,通过插入,缺失,替换和破坏N蛋白的磷酸化 位点来构建,也可以通过改变N蛋白的其他部分来 构建,例如在第389个氨基酸上,把丝氨酸替换掉, 最好是中性氨基酸,丙氨酸最为合适. 另外,在细菌表达N蛋白的研究中,1—92位的 氨基酸序列对核衣壳的结构形成是必需的,121— 160位的序列对维持基因组螺旋状稳定性非常重 要.进一步分析表明,在N一端存在一个潜在结构 域,可能参与同P蛋白的相互作用,对核衣壳的组 装是必要的?. 1.9NS蛋白:NS蛋白(Non.structureprotein) 有两个成员:NSI和NS2,分别含136和124个氨基 酸.NS蛋白一般出现在侵染的宿主细胞中,在成熟 病毒粒子中没有发现,所以称为非结构蛋白. NS蛋白对宿主的IFN有抑制作用,但机制尚不 清楚].RSV如果缺少NS蛋白,病毒的毒性会减 弱,宿主细胞也会减少一些激动素和调理素的分泌, 如IL.8,TNF.d等?. 非节段负链RNA病毒往往通过转录梯度 (Transcriptiongradient)来控制转录,靠近启动子的 基因(Promoter.proximalgenes)转录梯度高于其下游 的基因.而NS1基因就是由靠近RSV启动子的基 因所编码的,丰度较高.在一些副粘病毒中,由不同 基因末端信号引起的转录中止效率的差异可以调节 基因表达水平.NS1和NS2中止效率很低,在增加 NS1和NS2,或单独增加其中一个基因末端信号中 止效率的重组体内,发现相关多顺反子的通读mR— NA产量有所减少,这是由于RNA聚合酶对基因末 端信号识别失败造成的.在这个过程中,还伴随着 单顺反子NSI和NS2mRNA的小幅度增加;相反, 在减少NS1基因末端信号的中止效率时,发现多顺 反子的通读mRNA产量有所增加,但单顺反子的 NS1和NS2mRNA和蛋白量减少了.这些重组体在 Vero和Hep一2细胞中表现出与野生株一样的生存 能力.此外,重组体在BALB/c小鼠的上呼吸道和 下呼吸道的感染过程中,只在复制方面表现出轻微 的减弱,表明由NS1和NS2基因末端信号所引起无 效的转录中止,并没有在控制RSV基因表达强度和 病毒复制的效率方面起很大的作用.这种基因末端 信号中止效率变化可以影响自身基因乃至下游基因 转录,但不会对整体转录梯度造成明显影响. 2.结语 综上所述,蛋白的研究在呼吸道合胞病毒研究 中具有重要的地位,无论在开发诊断试剂,治疗性药 物,还是在研制改进疫苗方面,都是不可或缺的,所 以对于蛋白结构以及结构与功能的关系还需要进一 步深入研究. 参考文献 [1】OgraPL.Respiratorysyncytialvirus:therims,thediseaseandthe immunelx.~sponse.PaedlatrRespirRev,2004,5(SupplA):119一 l26. 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