杂合性缺失和微卫星不稳定性的研究

杂合性缺失和微卫星不稳定性的研究 葡萄膜黑色素瘤中 ,, 和 ,,, 基因位点杂合性缺失和微卫星不稳定性的研究石德晶 孙蕾 弥树勇 哈尔滨医科大学附属第四医院 ,,,,,,摘 要 葡萄膜黑色素瘤是成年人中最多见的 性5分钟然后将样品成对 同一患者的葡萄目的 检测葡萄膜黑色素瘤中 ,, 和 ,,, 基因位 一种恶性眼内肿瘤，在国外其发病率占眼 膜黑色素瘤组织与其相应的正常组织 PCR点的杂合性缺失(,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,，,,,)和 内肿瘤的首位，在国内则仅次于视网膜母 产物 加样到6的变性聚丙烯酰胺胶上交微卫星不稳定性(,,;,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,，,,，)情况。 细胞瘤居眼内肿瘤的第二位。 联比为:丙烯酰胺? NN’- 亚甲双丙烯方法 采用 ,,,,,,,,, 银染的方法，各选择 ,, 遗传学的研究明，肿瘤细胞的变异 酰胺 29? 1 变性剂为 7M 尿素1 × TBE和 ,,, 位点三对多态性微卫星标记(人群中的 是一个逐渐积累的过程，这其中涉及细胞 恒电压 500V，电泳 3 小时左右。杂合度在 ,,, 以上) ，对 ,, 例葡萄膜黑色素 生物学作用的方方面面。Rb-pl6-Cyclin 1.6 银染及结果判断:瘤样本进行杂合性缺失和微卫星不稳定的研 D 通路作为细胞周期调控的中心环节，它 银染操作2:? 10 乙醇 5min究。结果 葡萄膜黑色素瘤 ,, 位点 ,,,,,,,、 的变异在人类肿瘤的发生中属于早期事件， ? 1 硝酸 5min? 蒸馏水漂洗 3min?,,,,,,,、,,,,,,, 的 ,,, 发生频率分别为 ,,( Rb-pl6-Cyclin D 通路在葡萄膜黑色素瘤 0.012mol/l 硝酸 0min? 蒸馏水,,、,,,、,,(,,，, 个样本(,,,)出现 ,银溶液 2 ,， 中的作用引起了广泛的关注1。 漂洗 5min? 0.28 mol/l 碳酸钠，0.019现象;,,, 位点 ,,,,,,、,,,,,,、,,,,,, ,,, 本实验选择葡萄膜黑色素瘤为研究对 甲醛溶液显色轻轻摇晃至带型清晰?10的发生频率分别为 ,(,,、,(,,、,,,，,,(,, 象，应用 PCR - SSLP - 银染的方法对 冰乙酸中止反应?蒸馏水漂洗干净。出现微卫星不稳定现象。结论 ,, 位点的 ,,, 葡萄膜黑色素瘤 Rb 和 p16 位点的杂合性缺 结果判定:将肿瘤组织与其相应的正和 , , ， 是葡萄膜黑色素瘤中常见的染色体改 失和微卫星不稳定性进行研究。 常组织微卫星位点 PCR 产物的银染结果进变，,,, 位点(,,, 频率为 ,,(,,)的基因变异 1 材料和方法 行比较若肿瘤某一等位基因条带消失或相需进一步研究证实。关键词 1.1 手术标本取材:本实验共收集 15 对密度减少 50 以上则计为 LOH;如肿葡萄膜黑色素瘤;杂合性缺失;微卫星不稳定 份葡萄膜黑色素瘤患者及其对应外周血标 瘤组织样本出现额外条带，计为 MSI;当性;, , ;, , , 本，为哈尔滨医科大学附属第四医院手术 血液标本微卫星扩增产物仅为 1 条主要条Abstract 室及检验科提供。 带时，称为非信息个体 noninformative，,,,,;,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,, 1.2 基因组 DNA 提取:应用哺乳动物 不能用来判断 LOH。 出现LOH的病例需经(,,,) ,,, ,,;,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, (,,， ),, ,,,,, 基因组 D N A 提取试剂盒 G e n E l u t e T M 再次 PCR 扩增证实。结果经χ 2 检验。,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,, ,,, ,,, ,,,, ,,;,( Mammalian Genomic DNA mini prep,,,,,,, ,,, ,,, ,,， ,, ,, ,,, ,,, ,,,, ,,; , ,,,, kit Sigma 公司，按试剂盒操作说明提取,,,,,,, ,, ,,, , ,,,, , ,,,,,, ,,,,, ,,,,,, ,, ,, 葡萄膜黑色素瘤组织及对应血液标本DNA;,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,,,, ,,,,, ,,,,, ,,,,, ,, 紫外分光光度计检测 D N A 的浓度和纯,,;,,,,,,,,,,,,( ,,,,,,, ，, ,, ,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,, 度，-80?保存备用。,,, ,,,,, ,,,,,, ;,,,,,, ,,,,,,， ,,, ,,, ,,,,;,,, ,, 1 . 3 微卫星选择:选择位于 R b,, ,,,, ,,;,, ,,, ,,,,,,,(,,(,,)， ,,,,,,, (13q14)基因内部的 D13S153 及位于其两(,,,)， ,,,,,,, (,,(,,) ,,, ,,， ,,, ,,,， 侧的 D13S118 和 D13S119 微卫星位点;选,,, ,, ,,, ,,,, ,,;,, ,,, ,,,,,,(,(,,)， ,,,,,, 择可代表 p169p21基因多态性的 D9S171 ,,, ,,(,,( 及(,(,,) ,,,,,,(,,,) ,,, ,,， 位于其基因两侧的 D9S157、D9S942 微,,,;,,,,,,, ,,, ,,, ,,， ,, ,, ,,,, ,,;,, ,,,, 卫星位点，引物由 invitrogen 公司合成。;,,,,, ;,,,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,,,， ,,,,, ,,, 1.4 PCR 反应体系和条件:PCR 总反,, ,,, ,,,, ,,;,, ,,,, ,,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,;,(Key words 应体积为 50ul，反应条件:95? 预变性,,,,,, ,,,,,,,,; ,,,; ,,，; ,,; ,,, min;95? 30 ,，57,59? 90 ,72? 延伸 1min，总共 30 个循环;最后 72? 10min，结束反应。扩增产物经 2,琼脂糖 图 1 15 例葡萄膜黑色素瘤患者 Rb 和 p16 位点LOH和MSI情况 凝胶电泳检测。 1 . 5 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳:将 5ulPCR 产物与 5ul 上样缓冲液混合煮沸变 下转第 ,, 页 -, , - 基础及前沿研究 中国科技信息 2009 年第 22 期 CHINA SCIENCE AND TECHNOLOGY INFORMATION Nov.2009 常用统计方法 在 ,, 小组活动中的应用 李艳霞 冀中能源集团通方机械制造有限公司 ,,,,,, 摘 要 证据:Q C 小组活动要求以事实为依据， 运用分层法可以使表面杂乱无章的数 质量管理小组(简称 ,, 小组)活动是企业组 用数据说话，如果没有对数据的统计分析 据和错综复杂的因素系统化、条理化，便 织中的群众性质量管理活动，在改进质量、降 就不能提供活动的证据。 于分析影响产品质量原因，找出主要矛盾 低消耗、提高效益等方面发挥了很大作用。要 其次，统计技术的运用是正确判断的 和采取相应的技术。因此常用在 QC 想使 ,, 小组的活动充分发挥作用，科学的统 基础:没有准确的统计分析有可能做出错 活动的选、现状调查、确定要因等步骤 计技术的正确运用尤为重要。本文就 ,, 小组 误的判断，导致下一步行动的决策错误。 中 。 活动中常用统计方法的概念及主要用途以及 另外，统计技术还是QC小组活动有效 使用分层法时要注意，在同一层内， 在 ,, 小组活动中正确运用统计技术的注意事 : 性和积极开展的基础 对策实施时， 正确运 波动度要尽可能的小，而在层与层之间， 项做了简要论述，希望对 ,, 小组活动的有效 用统计工具可确保实施效率和有效性。如 差异性要尽可能的大，这是进行数据分层 开展有所帮 助。 不进行数据分析 QC 小组活动往往会走弯 的关键。 关键词 路，影响小组的活动效率及小组成员的积 4、 因果图:又称因果分析图， 树枝图、 ,, 小组;统计技术;统计方法;用途 极性。 鱼刺图等，是表示质量特性与原因关系的 下面简要介绍一下 QC 小组活动中常 图 。 用统计方法的概念及主要用途，希望对 它针对质量问题，采取顺藤摸瓜，步 QC 小组活动的有效开展有所帮助。 步深入的方法来定性地分析问题原因，直 1、调查表:又称检查记录表、统计分 至找到具体根源为止。它首先分析哪些是 析表， 是为分层收集数据而设计的图表， 是 大原因， 然后寻找大原因背后的中原因， 再 现场收集记录数据的一种好形式。 从中原因找小原因和更小的原因，最终查 在各种统计方法中，调查表法在 QC 明和确定出主要原因。使人们清楚地看出 小组活动中最为常用，在选题、现状调 “原因——结果” “手段——目标”的关系。 查、设定目标、确定要因、制定对策、 在QC小组活动中， 经常在因果分析时 按对策实施、检查效果、制定巩固措施等 使用因果图。 : 在使用因果图时需注意 一个 多个环节都有应用。用的较多的调查表有 结 QC 小组)是在 不良果只能画一个因果图，不能把两个结果 质量管理小组(简称 项目调查表、不良原因调查表、质量 混合在一起。另外，绘制因果图归纳意见生产或工作岗位上从事各种劳动的职工， 分布调查表等。 时，要重点突出， 主次分明，防止事无巨细，围绕企业的经营战略、方针目标和现场存 2、排列图:也叫主次因素分析图，是 胡子眉毛一把抓。在的问题， 以改进质量、降低消耗、提高效 用来从影响产品质量的许多因素中找出主 5 、直方图:又称质量分布图，是益为目的组织起来，运用科学质量管理的 要因素的一种有效方法。根据“关键的少 数据分布的一种表现形式，它把数据进行理论和方法，开展现场地质量管理活动的 数，次要的多数” 的原理， 把影响产品质量 整理后，通过图形更加直观地表现出来。群众性基层组织。 QC小组活动在促进企业 的各种缺陷、 问题，按其不同类别整理出数 具宓厮担 褪嵌陨 ば蚣庸こ隼吹牟 慕 柿俊?降低消耗、提高效益等方面发挥 据，然后将数据按不良品数目多少 (或金额 品，根据抽样原理，从中抽出一定量的样着很大作用。 多少) 顺次排列作图，以直观的柱条形高低 品，经过测量，取得一批数据，然后把 目前，我国的 QC 小组活动已经程序 及其累计频率 (百分比) 的大小，来表明主 这些数据加以系统整理，进行适当分组和化，基本上按(P) 、检查 、实施(D) 次因素。 计算，绘制成图表。(C)、处理(A)的科学管理方法(简称 在 QC 小组活动中，排列图常被用来 在 QC 小组活动中，选题、现状调查PDCA 法)循环开展活动。 指出主要因素或用来改进工作质量或用来 和检查效果阶段，直方图是一种常用的统 要想使 QC小组的活动充分发挥作用， 确认改进措施后的效果。 计方法。有效地达到目标， 起到归纳、分析问题和显 3 、分层法:又叫分类法，就是把 : 、 使用直方图时应注意 1)收集数据应示事物的客观规律作用的科学的统计技术 收集来的数据按照不同的目的和要求，把 适当， 既不应过少而不便于判断分布状态，的正确运用尤为重要。 性质相同，在同一生产条件下收集的数据 也不应过多而浪费人力和时间。 、 2) 分组数 首先，统计技术为QC小组提供活动的 归纳在一起，然后分析其规律性的东西。 目应适当，防止分组过疏或过密而不易掌 -, , -握分布情况。 3、重视对所搜集的数据进行现场跟 正常组织与某些异常组织之间，微卫星位 6 、散布图:又称相关分析法，是 踪验证，注重对数据的分析，充分利用数 点的重复单位氖 坎煌 ,胝 ,橹 嘤美捶治龃 砀鞅淞恐 浯嬖诘南喙毓叵?据分析的结论，指导小组的活动。 比较，若某一等位基因条带消失或相对密的一种工具。把有相关关系的变量变化趋 4、注意统计工具的正确应用。避免由 度减少 50 以上，记为杂合性缺失若等位势用图来表示，就称为散布图。 于统计工具选择不准确或应用不正确而影 基因条带增多或大小有改变则记为微卫星 在 QC 小组活动中，散布图常被用在 响整体的分析效果，导致不能获取最佳结 不稳定性 4 。确定要因和检查效果阶段，用以从一组实 果。 本实验研究发现，葡萄膜黑色素瘤患测数据出发，确定这些随机变量之间的定 者有 10 例66.7 在 RB 位点出现 LOH量关系。或从影响着某一指标的许多变量 和 MSI 变异，其中 8 例53.3在 Rb 基因中，判断出哪些变量的影响是显著的，哪 内的 D13S153 位点出现 LOH，而在 Rb 基些是不显著的。然后用所求得的关系，对 因两侧的 D13S118 位点和 D13S119 位点生产过程进行预测和管理。 LOH 频率在 20 左右 (一般文献认为 LOH 7、 : 矩阵图 就是从作为问题的事件中， 在 20 以上可以认为是高发频率，统计学找到成对的因素进行行与列的排列，然后 表明，LOH 只有在 30 以上才有统计学意根据交点处所表示的各因素间的关系和关 参考文献 义5 );有 4 例(26.7)在 p16 位点出系程度来探索二元排列中的问题所在和问 〔, 〕普济( 质量管理与统计技术方法 现 L O H ，其中位于 p 1 6 基因位点外的题形态，再从二元关系中得到解决问题的 〔,〕 (中国质量(,,,,，,( D9S942 LOH 频率最高，为 20。这些启示。 〔, 〕邵艳萍( 全 , 次质量管理小组 提示我们在葡萄膜黑色素瘤的发生过程中， 矩阵图在 国第 , QC 小组的活动中，常被用 代表会议发表成果点评〔,〕 (中国质量( Rb 抑癌基因的缺失参与其中，而 p16 抑癌在制定对策和对策实施阶段。 ,,,,，,,( 基因的作用需要进一步研究确定，很可能 8 、头脑风暴法:又叫畅谈法、集 作者简介 在D9S942位点附近还存在其它的抑癌基因思法。它是采用会议的方式，利用集体的 李艳霞，女 , , , , 年出生，学士学位 工程 (如 p 1 4 6 )参与肿瘤的发生。 师，现在河北冀中能源机械装备集团通方机思考，引导每个参加会议的人围绕某个中 本实验中，由于葡萄膜黑色素瘤标本 械制造有限公司质量检查部工作。心，广开言路、激发灵感，在自己的头 数量有限， 很难作出十分确定的结论， 因此脑中掀起风暴，毫无顾忌、畅所欲言地发 还将进一步收集更多的临床标本进行相关表独立见解的一种创造性思考的方法。 问题的研究分析。 头脑风暴法在 QC 小组活动中的用途很广，选题、分析原因、制定对策及实 参考文献施对策过程中都有应用。可以用来识别存 〔,〕吕霞，郭希让( 脉络膜黑色素瘤的分在的质量问题并寻求其解决的办法，还可 子遗传学研究进展( 河南医学研究(,,,,用来识别潜在质量改进的机会。 ,,(,) :,,,,,( 9、水平对比法:就是组织将自己的 .