[word doc]新疆泥火山土壤宏基因组DNA的提取方法研究

[word doc]新疆泥火山土壤宏基因组DNA的提取方法研究 新疆泥火山土壤宏基因组DNA的提取方法 研究 安徽农业科学.JournalofAnhuiAg6.Sci.2010,38(23):12416—12417责任编辑马树梅责任校对傅真治 新疆泥火山土壤宏基因组DNA的提取方法研究 李建辉,路盼盼,张亚平(石河子大学生命科学学院,新疆石河子832oo3) 摘要[目的]寻找一种有效的泥火山土壤宏基因组DNA的提取方法.[方法]分别采用CTAB法,SDS加酶法,实验室改进法,试剂盒 法提取泥火山土壤宏基因组,比较4种方法的提取效果.[结果]试剂盒法的提取效率最高,纯度最好;实验室改进法次之;SDS加酶法 提取量最多.实验室改进法获得的DNA稀释10倍可直接用于PCR扩增.[结论]从经济和DNA质量的角度考虑,实验室改进法可作 为新疆泥火山土壤宏基因组DNA提取最有效的方法. 关键词泥火山;宏基因组DNA;新疆 中图分类号TD951文献标识码A文章编号0517—6611(2010)23—12416—02 StudyonExtraetionMethodofMetagenomicDNAfronlMudVolcanoi11Xi njiang LIJian.huietal(CollegeofLifeScience,ShiheziUniversity,Shihezi,Xi~iang 832003) Abstract 『0biectiveIrI’}leaimwastoseekaneffectiveextractionmethodofmetagenonficDNAfromMudVolcano.IMethodlrr}lemet. agenomicDNAfromMudVolcanowasextractedbyCTABextractionmethod,SDS.enzymemethod,improvedmethod,reagentsetsmethod. respectively.Theextractionoffourkindsofmethodswerecompared.1ResuhITheextractedrateandpurityinreagentsetsmethodweretlle enzyme highest.nextwasimprovedmethod,theextractedquantityinSDS— methodwasmaximum.TentimesdilutedDNAwhichextractedby theimprovedmethodcouldbeusedforPCR.1ConclusionlConsideringeconomyandDNAquality,theimprovedmethodcouldbeusedasan effectiveextractionmethodofmetagenomicDNAfromMudVolcano. KeywordsMudvolcano:MetagenomicDNA;Xinjiang 环境微生物宏基因组是一个巨大的基因资源库,但由于 受到常规培养条件的限制,许多未培养微生物基因资源难以 被开发利用.科学界普遍认为,未培养微生物在自然界土壤 栖息群中占99%以上的资源,并且逐渐成为微生物学的研究 热点].利用非培养依赖的分子生物学方法对环境中的微 生物进行研究可突破传统方法的限制.Handelsman等于 1998年提出了建立未培养微生物宏基因组文库的设想,把对 未培养微生物的研究引入到一个新的层次.直接提取纯化 宏基因组文库是从分子生物学角度研究微生物基因资源的 重要途径』.宏基因组DNA是进行PCR扩增,变性梯度凝 胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE),单链 构象多态性(single—strandconformationpolymorphism,SSCP) 等微生物多样性研究的基础,因此找到一种有效的宏基因组 提取方法尤为重要.鉴于此,笔者分别采用CTAB法,SDS 加酶法,实验室改进法及试剂盒法提取泥火山土壤宏基因 组,并比较其提取效果,以期获得有效提取泥火山土壤宏基 因组DNA的方法. 1材料与方法 1.1材料土壤样品于2009年8月份采自新疆乌苏泥火山 区,按5点采样法取0,10cm土样. 1.2方法 1.2.1宏基因组DNA提取. 1.2.1.1CTAB法.称土样5.0g,加入13.5mlDNA提 取液(100.0mmoL/LTris,100.0mmol/LEDTA,100.0mmol/L NaP0,1.5mol/LNaC1,1%CTAB,pH值8.0),振荡5min; 加入1.5ml10%SDS后,65?水浴2h,期间每隔15min上 下颠倒晃动几次;6000r/min离心10min,取上清液,用等体 积苯酚和氯仿/异戊醇(24:1)各抽提2次,12000r/min离心 基金项目 作者简介 收稿日期 国家自然科学基金项目(30860001). 李建辉(1984一),男,山西运城人,硕士研究生,研究方向 土壤生物与生物化学.通讯作者,教授. -29 2010-04 15min;取上清,加入2倍体积无水乙醇,4?放置2h(或者 加入0.6倍体积的异丙醇,室温放置2h或过夜),12000 r/min离心15min,弃上清;沉淀加入5ITIl预冷的70%乙醇, 12000r/min离心20min,收集DNA沉淀,风干,用适量双蒸 水溶解. 1.2.1.2SDS加酶法.称土样5.0g,加入13.5mlDNA 提取液(100mmol/LTris,100mmol/LEDTA,100mmolfL NaPO4,1.5mol/LNaC1,l%CTAB,pH值8.0),振荡5min; 加500Ixl溶菌酶(50mg/m1),振荡30s,37oC水浴30min;~JI] 人20l蛋白酶K(20mg/nf1),振荡30s,37oC水浴30min; 加入1.5ml10%SDS,65?水浴2h,期间每隔15min上下 颠倒晃动几次;6000r/min离心10min,取上清液,用等体积 苯酚和氯仿/异戊醇(24:1)各抽提2次,12000r/min离心15 min,取上清;加入0.6倍体积异丙醇,室温放置2h或过夜, 12000r/min离心15min,弃上清;沉淀加入5?d预冷的 70%乙醇,12000r/rain离心20min,收集DNA沉淀,风干,用 适量双蒸水溶解. 1.2.1.3实验室改进法.称取充分研磨的土样5.0g,加入 l3.5mlDNA提取液(100mmol/LTris,100mmol/LEDTA, 100mmol/LNaPO,1.5mol/LNaC1,1%CTAB,pH值8.0) 和20颗直径为3inin左右的玻璃珠,振荡3min;加500l溶 菌酶(50mg/),振荡30s,37?水浴30min;加入20l蛋 白酶K(20mg/ln1),振荡30s,37?水浴30min;加入1.5ml 10%SDS后,一20?放置1h;65?水浴1h(期间每隔15 min上下颠倒晃动几次),重复2次;6000r/min离心10min, 取上清液;用等体积苯酚和氯仿/异戊醇(24:1)各抽提2次, 12000r/min离心15min,取上清,加入0.6倍体积的异丙 醇,室温放置2h或过夜,12000r/min离心15min,弃上清; 沉淀加5rI1l预冷的70%乙醇,12000min离心加min,收集 DNA沉淀,风干,用适量双蒸水溶解. 1.2.1.4试剂盒法.采用天泽基因DNAout提取试剂盒,按 照操作说明进行. 38卷23期李建辉等新疆泥火山土壤宏基因组DNA的提取方法研究 1.2.2宏基因组DNA质量检测.采用HD一21C—B型核酸蛋 白检测仪直接获取不同方法提取的DNA的OD吸光值 (A:与A/A3.)及提取量. 1.2.3宏基因组电泳检测.采用0.7%凝胶电泳检测提取 的宏基因组. 1.2.416SrDNA的PCR扩增.将4种方法提取的宏基因 组稀释10倍后作为模板,引物为27F/1492R,扩增体系参见 文献『6]. 2结果与分析 由表1可知,从纯度角度考虑,试剂盒法提取纯度最高, 其次是改进法;从产量看,SDS加酶法产量很高,但要进一步 纯化产物,纯化过程较复杂,且效率不佳;从经济角度出发, CTAB法最实惠,次之为改进法和SDS加酶法. 表1不同方法提取的DNA的产量和纯度比较 Table1ThecomparisonofoutputandpurityofDNAextractedby djfferentmethods 由图1可知,试剂盒法和实验室改进法可以获得DNA 条带,CTAB法和SDS加酶法只能获得DNA碎片.将宏基因 组稀释10倍后的PCR产物如图2所示,试剂盒法和实验室 改进法获得较好片段,CTAB法和SDS加酶法仅能获得模糊 条带. 1234 注:1.改进法;2.试剂盒法;3.CTAB法;4.SDS加酶法.下图同. Note:1.hnprovedmethod;2.Reagentsetsmethod;3.CTABmethod:4. SDS-enzymemethod.ThesRnleasbelow 图14种提取方法电泳结果 Fig.1Theelectrophoresisresultsbyfourkindsofextraction method 2000bp 1000bD 750bt3 500bp 250bp 100bO M 图216SrDNA的PCR扩增产物 Fig.2PCRamplificationproductsof16SrDNA 综合以上因素,该研究选取实验室改进法为泥火山土壤 宏基因组最有效的提取方法. 3结论与讨论 由于土壤本身及其中微生物的复杂性,传统的微生物学 方法如平板计数,生物量测定等的准确性受到了极大限制. 从土壤微生物群体基因组的角度研究其多样性及功能是一 种可行方法,并已在国内外受到广泛关注.从DNA角度 分析土壤微生物,关键是DNA的提取. 该研究中CTAB法和SDS加酶法提取效率不高的可能 原因为:?泥火山土壤为高盐碱环境,大量离子对溶菌酶, 蛋白酶存在抑制作用;?土壤中存在腐植酸等抑制Taq酶 活性的物质,影响PCR扩增效果;?细胞破壁不完全,CTAB 法只用化学方法(SDS)进行破壁;SDS加酶法用到化学法和 酶法2步破壁;而改进法则综合利用化学法,酶法,物理法 (玻璃珠振荡,反复冻融)进行细胞破壁,使得破壁更完全. 因此,改进法可以获得优质的宏基因组DNA,且这种方法获 得的基因组经稀释后可直接用于后续分子操作. 参考文献 [1]AMANNRI,LUDgqGW,SCHLEIFERKH.Phylogeneticidentification andinsitudetectionofindividualmicrobialcellswithoutcultivation[J]. 169. 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