生化实验报告胰蛋白酶活力测定生化实验报告胰蛋白酶活力测定
胰蛋白酶活力测定
一、实验原理
1、福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸,在碱性条件下极不稳定,易被酚类化合物还原为蓝色化合物(钨蓝和钼蓝)。
2、蛋白质中含具酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸),用胰蛋白酶水解蛋白底物,生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应,生成蓝色化合物,在一定的范围内,蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
二、实验仪器
1、试管
2、7220分光光度计
3、恒温水浴锅
三、实验试剂
1、福林试剂B:见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰...
生化实验
胰蛋白酶活力测定
胰蛋白酶活力测定
一、实验原理
1、福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸,在碱性条件下极不稳定,易被酚类化合物还原为蓝色化合物(钨蓝和钼蓝)。
2、蛋白质中含具酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸),用胰蛋白酶水解蛋白底物,生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应,生成蓝色化合物,在一定的范围内,蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
二、实验仪器
1、试管
2、7220分光光度计
3、恒温水浴锅
三、实验试剂
1、福林试剂B:见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中) 2、0.55mol/L碳酸钠溶液:58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水,稀释并定容至1000ml 3、10%三氯乙酸溶液
4、0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5):
5、0.5% 酪素溶液:称取0.5g酪素,以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润,再加少量0. 2mol/L磷酸缓冲液稀释。在水浴中煮沸溶解,冷却,稀释并容至100ml,冷藏在(冰箱)里。
6、500ug/L酪氨酸溶液
7、胰蛋白酶溶液(冰箱中)
四、实验步骤
1、标准曲线的制作:按下表加入试剂:
管号 1 2 3 4 5 6
500ug//酪氨酸溶液/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水/ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
各管中加0.5%酪素2ml,于37?水浴中反应15分钟,然后加入10%三氯乙酸3ml,过滤除去沉淀,取清液1ml,加入0.55mol/L碳酸钠5ml,再加入福林试剂1ml,于37 ?水浴中显色15分钟,测OD680。
以光密度为纵坐标,酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。
2、样品测定:取干燥的试管2支,按下表加入试剂
管号 备注 7
0.5%酪素溶液 37水浴中酶解15分钟 2.0
2mg/ml胰酶溶液 1.0
10%三氯乙酸溶液 过滤 3.0
上清液 37水浴中显色15分钟 1
0.55mol/L碳酸钠溶液 5.0
福林试剂B 1
OD680
酶活力:在37?下每分钟水解酪素产生lug酪氨酸为一个活力单位。 样品中含酶活力单位=A/15 ?F
A—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数
F—酶液稀释倍数
五、实验结果
管号 7(样品) 1 2 3 4 5 6 酪氨酸微克数 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 ----------- OD680 0 0.157 0.258 0.379 0.499 0.585 0.993 OD680 0 0.156 0.259 0.379 0.496 0.585 0.993 OD680 0 0.157 0.258 0.378 0.497 0.585 0.994 OD680(平均) 0 0.157 0.258 0.379 0.497 0.585 0.993 由上表可作出标准曲线如下:
标准曲线
0.7y = 1.1617x + 0.02220.62R = 0.99430.5
0.4
0.3吸光度
0.2
0.1
0
00.10.20.30.40.50.6
酪氨酸(μg)
由上可知,样品的吸光度y=0.993,则x=0.8μg,即A=0.8μg 故根据
样品中含酶活力单位=A/15 ?F
A—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数
F—酶液稀释倍数
胰蛋白酶活力为:0.8 /15 ?13=0.69
六、实验分析
1. 测定胰蛋白酶活力的原理?
答:蛋白质中含具酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸),用胰蛋白酶水解蛋白底物,生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应,生成蓝色化合物,在一定的范围内,蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
2. 胰蛋白酶的最适PH值多少? PH值对胰蛋白酶稳定性有何影响? 答:胰蛋白酶的最适PH值为8.1。胰蛋白酶的活性在一定的PH值范围内随着PH值的升高而升高,超过最适的PH值时酶活性降低。
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