两种常用纤维素酶活力测定方法滤纸酶活-CMC酶活

两种常用纤维素酶活力测定方法滤纸酶活-CMC酶活 纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(FPA) 滤纸酶活力代了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。 采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活:(简称DNS法) 1、原理:纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即:3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度 据此可以推算出纤维素酶的活力。 范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比， 2、采用的滤纸酶活单位定义: 滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素 能力。是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。在此滤纸酶活单位定义为:以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50?，恒温lh)下， 以水解反应中，1ml纤维素酶液1min催化纤维素生成lug葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。 3、滤纸酶活力(FPA)的测定: ? 取0(5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液lml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml; ? 再加入50?0.5mg滤纸(1cmx6cm)一条，于50?保温酶解反应1小时，(先预热5分钟); ? 加入DNS显色液3ml(曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴lOmin，流水冷却后在540nm下测吸光度; ? 同时用100?煮沸lOmin后失活的酶液做对照，扣除本底; ? 根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。 滤纸酶活按下面公式计算: X=(WxNxlOOO),(TxM) X:为滤纸酶酶活力，单位U,mL。 W: 为从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度。 N: 为酶液稀释总倍数。 T: 为反应时间。 M: 为样品的体积。 4、葡萄糖标准曲线绘制方法 标准曲线绘制:取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为 量为横坐标，绘制标准曲线。 纵坐标，葡萄糖的含 5、3，5二硝基水杨酸(DNS)试剂 称取6.3克3,5-二硝基水杨酸用水溶解，加入21.0克NaOH，182克酒石酸钾钠，加500ml水，加热溶解后再加入5.0克重蒸酚和5.0克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却，定容至1000ml，存于棕色瓶中，放置7天后使用。 纤维素酶活力的测定——CMC糖化力法 1、 定义:1毫升液体酶(或1克固体酶粉)，在40? pH,4.6条件下，每分钟水解羧甲基纤 维素钠(CMC-Na)，产生1.0ug的葡萄糖，即为1个酶活单位，以u/g(u/ml)表示。 2、 原理: CMC-Na在纤维素酶的作用下,水解产生纤维寡糖、纤维二糖、葡萄糖等还原糖，还原 定糖能将3，5,二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，在540nm波长下测 吸光度值A，吸光度与酶活成正比。CMC-Na糖化力主要代表内切β-1.4-葡聚糖的活 力。 3、 试剂: 3.1 0.1mol/LpH,4.6醋酸,醋酸钠缓冲溶液:将49.0ml0.2mol/L醋酸钠溶液和 51.0ml0.2mol/L醋酸溶液混合后加100ml蒸馏水。 注意:0.2mol,L醋酸钠溶液:称取27.22g结晶乙酸钠(AR)定容至1000ml。 0.2mol,L醋酸溶液:称取冰乙酸(AR)11.5ml定容至1000ml。 3.2 3，5二硝基水杨酸(DNS)试剂:称取6.3克3,5-二硝基水杨酸用水溶解，加入 21.0克NaOH，182克酒石酸钾钠，加500ml水，加热溶解后再加入5.0克重蒸酚和5.0 克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却，定容至1000ml，存于棕色瓶中，放置7天后使用。 3.3 葡萄糖标准溶液(1.0mg /ml):称取1.000克葡萄糖(AR)(105?干燥至恒重)用蒸 馏水溶解后定容至1000ml，冰箱保存备用。 3.4 羧甲基纤维素钠溶液:称2.0gCMC-Na溶于200 ml蒸馏水中，加醋酸缓冲溶液 100 ml,混匀后存于冰箱内备用。配后隔天使用。 4、 分析步骤: 4.1标准曲线绘制:取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。 4.2 待测酶液制备:准确称取酶粉1.0克置研钵中，加入pH4.6的醋酸缓冲溶液少量溶解，研 细，将上清液小心倾入25ml刻度试管中，沉渣再加入少量缓冲液,如此捣研3-4次，最 后全部移入试管中并定容至25ml，摇匀，过滤，滤液待测。 4.3 测定:取1.5mlCMC-Na溶液与0.5ml适当稀释的酶液于25ml试管中，40?水浴保温30min 后立即加1.5mlDNS显色剂，沸水浴煮沸5min，取出立即冷却，用水定容25ml，在540n m测吸光度As。 空白样:先加1.5mlDNS试剂，后加0.5ml待测酶液，与1.5mlCMC-Na溶液，于 25ml试管中，沸水浴煮沸5min，冷却后用水定容25ml，在540nm测吸光度Ack。 ?A,As,Ack 根据?A从标准曲线上查得葡萄糖含量P。 5.4 计算 酶活力(u/g)=P*K*1000/0.5*30 k:稀释倍数。 吸光度 0 0.084 0.240 0.537 0.789 1.055 浓度mg/ml 0 0.125 0.25 0.5 0.75 1