右归饮含药血清对人骨髓基质干细胞诱导为成骨细胞的影响

右归饮含药血清对人骨髓基质干细胞诱导为成骨细胞的影响 右归饮含药血清对人骨髓基质干细胞诱导 为成骨细胞的影响 江西中医药2006年7月第7期总37卷第283期 1材料和方法 1.1主要仪器及试剂 二氧化碳培养箱,超净工作台,StatFax一2100型酶标仪, Olympus.倒置显微镜+Image—Pro-Plus图像分析系统; DMEM,胰蛋白酶,M,rT,I)MF4O,胎牛血清,碱性磷酸酶试剂 ,甘油磷酸钠,维生素C. 盒,地塞米松 1.2实验药物 右归饮制剂:熟地15g,枸杞子15g,山茱萸10淮山 药15杜仲15g,制附子10g,肉桂5炙甘草5g,加蒸馏 水500mL低温浸泡12小时,取出放置室温,煮沸后文火煎 30分钟,纱布过滤,药渣加水300mL,煮沸后再文火煎30分 钟,滤液合并,90?水浴浓缩至1:1(相当于生药1g/mL), 4?冰箱冷藏备用. 1.3实验方法 1.3.1右归饮含药血清的制备含药血清制备:以SD大鼠 10只,每日给右归饮9g/(kg?d)灌胃lj,另设5只对照组, 以牛理盐水灌胃,连续7天,于最后一次灌药后1小时(灌药 前禁食,不禁水12小时),麻醉后腹主动脉取血并分离血清 (取血5,l0mL,静0.5小时后,1000r/rain离心15分 钟),经56?,30分钟灭活,无菌过滤后,置一20?冰箱保存 备用. 1.3.2M,的分离和培养实验用骨髓取自12例健康成 人,取材前均说明并经本人同意志愿捐献,其中男9例, 基中,以1.0×106/an2密度接种于25cm2的培养瓶中,置于 37?,5%032培养箱中,3,5天后换液,去除未贴壁的细 胞,每3天换液1次,每天观察细胞形态,贴壁及生长情况. 待细胞融合达80%--90%,用0.25%胰蛋白酶消化,传代. 1.3.3体外成骨的诱导根据实验设计,当第3代的Ms 细胞贴壁生长达到70%,80%融合时,加入含地塞米松(5 nmol/L),磷酸甘油钠(10mmol/L)和维生素C(50~mol/ L)的DMEM成骨条件培养液,制成细胞悬液,按1×10/am2 的密度接种75cm的培养皿,置37?,5%(的培养箱培 养.右归饮组,加入右归饮含药血清培养液;对照组只加含 血清培养液.收集第15天细胞培养上清,用于AIP的检 测.每次每组设8孔,重复上述实验4次. 1.4成骨细胞的鉴定 1.4.1碱性磷酸酶(ALP)染色取诱导培养2周后的细 胞,PBS冲洗后,丙酮固定10分钟后,蒸馏水冲洗.人孵育 液中,37?孵育5小时,自来水冲洗后,用2%硝酸钴中浸透 5分钟,蒸馏水洗数次,再用1%的硫化铵(现配)中浸2,3 分钟,自来水冲洗,自然干燥后封固.对照组用未诱导的同 组细胞. 1.4.2钙结节染色(VonKossa法)细胞爬片用PBS冲2 次,经冷丙酮固定10分钟后,蒸馏水冲洗,放人2%硝酸银内 置暗处1小时,蒸馏水洗3次,5%硫代硫酸钠还原1小时 (硫代硫酸钠5g,0.1mol/L,氢氧化钠0.2mL,蒸馏水100 ? 57? JIANGXIJOURNALOFTRADITIONALCHINESEMEDICINE mE);干燥,封片. 1.5含药血清对成骨细胞作用的定量分析 1.5.1细胞内ALP含量检测取生长状态良好的第3代 细胞,按2×10/mL密度接种于2个24孔板内,分别采用普 通培养基培养,条件培养基诱导培养以及条件培养基诱导后 加入含右归饮血清培养,分别于第2,4,6,8天各取6孔细胞 用0.196TritonX一100裂解后,收集裂解液按ALP检测试剂 盒的说明进行加样操作,用分光光度计检测各管OD,然后按 公式计算出的含量:ALP(金氏单位/100mL)=测定管 吸光度/管吸光度X标准管含酚量×100ml/0.05ml 1.5.2MTT法将细胞以5×103/ml细胞数接种于96孔 板中,选择6孔细胞,每孔加入MTT溶液20止,37?孵育 4小时后终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,每孔加入150 LDMSO,振荡15分钟裂解细胞,使沉淀物充分溶解.在酶 联免疫检测仪上测定每孔的OD490值. 1.6统计学处理 各数据均以均数?标准差(?s)示,用SPSS10.0进 行t检验分析. 2结果 2.1含药血清对成骨细胞增殖的影响 2.1.1细胞形态学观察(1)原代培养:细胞接种5,7天 后,可见贴壁的细胞中有大量圆形细胞,其中有少量呈成纤 维细胞样外形的贴壁细胞;(2)传代培养:传代培养细胞. 2.1.2^仉vI,法测定细胞增殖右归饮对成骨细胞增殖的 影响.由表1可知,右归饮组肼值与正常组比较有显着 性差异(P<0.05),表明右归饮对成骨细胞的增殖有促进作 用,与上述形态学观察结果一致. 表1右归饮含药血清对成骨细胞增殖及成骨省活力的影响 与正常相比,右归饮组P<0.05,?与正常相比,右归饮组P< 0.05. 2.2含药血清对成骨细胞生物活性的影响 2.2.1钙结节染色条件培养基培养组细胞呈集落生长后 开始形成钙结节,细胞间出现的致密的圆形不透光团块呈现 片状的棕染,着色区域范围广,面积大.条件培养基诱导加 含右归饮血清培养组细胞,上述表现更为明显.普通培养基 组细胞未见典型钙结节形成. 2.2.2细胞内ALP含量测定右归饮对成骨细胞内ALP 含量影响由表1可知,右归饮组细胞内值与正常组比 较有显着性差异(P<0.05),表明右归饮对成骨细胞的活性 有促进作用,与上述形态学观察结果一致. 3讨论 3.1骨髓基质干细胞成骨 正常骨髓组织分为造血系统和基质细胞系统,基质细胞 系统是指骨髓腔内为造血系统提供结构和功能支持的结缔 组织,造血细胞可以释放某些因子,刺激基质细胞生长…1. 基质细胞具有多方向分化的潜能,在不同条件下分化为成骨 细胞,肌细胞,脂肪细胞等多种细胞系统2.Long等推测骨 髓基质干细胞分化为成骨细胞的顺序为:克隆形成细胞—— 簇状形成细胞——成骨前细胞——成骨细胞L2J. ALP是鉴定成骨细胞的生化和组织学标志,并可用来评 价骨发生.我们观察到,体外培养的细胞集落中央最早出现 阳性表达,染色也较深.此处细胞密集,细胞分裂受到接触 抑制,细胞最早开始向成骨细胞分化,然后周边细胞ALP染 色出现阳性,进入细胞分化阶段J. 钙钴法是利用碱性磷酸酶在pH9.4的环境下,以镁离子 为激活剂,能使甘油磷酸钠水解出磷酸,再与高浓度钙盐 结合形成无色磷酸钙.磷酸钙与硝酸钴结合形成磷酸钴,经 过硫化胺处理后形成棕黑色沉淀于酶活性处,并随酶活性增 加而颜色加深.改良的Gomori钙钴法可较好的显示碱性磷 酸酶在细胞中的存在.碱性磷酸酶是成骨细胞的一种细胞 表面标志性酶.随着成骨分化程度的增加,碱性磷酸酶表达 增强引. 3.2右归饮对成骨细胞的影响 根据中医"肾主骨"理论,右归饮是温补肾阳的经典名 方,本研究通过右归饮对体外培养的成骨细胞的作用,观察 到右归饮对成骨的作用,为临床治疗提供了新思路. 在本实验中,通过确定碱性磷酸酶的活性来判定右归饮 的成骨作用,笔者认为右归饮可以通过增加碱性磷酸酶的活 性促进钙沉积,从而引起成骨,这与激素降低碱性磷酸酶的 活性,刺激破骨细胞活动,引起钙流失的作用相抵消.同时 右归饮含药血清可以促进成骨细胞增殖,从而进一步引起成 骨作用. 参考文献 [1]陈奇.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社, 1993.33,34 [2]LongMW,RobisonJA,AshcraftEA,ata1.Regulationofhuman bonemarrow-derivedosteoprogenitorcellsbyosteogenicgrowthfac— tor[J].JOinInvestigation,1995,95:881--887 [3]王敏,翁雨来,胡晓洁,等.犬骨髓基质干细胞诱导为成骨细胞的 实验研究[J].上海口腔医学,2002,l1(4):327,331 [4]康新勤,臧伟进,胥晓丽,等.大鼠骨髓问充质干细胞定向成骨细 胞分化中碱性磷酸酶的变化[J].西安交通大学(医学版), 2004,25(4):366,368 (收稿日期:2006—09—06) ? 58?