全反式维甲酸对球囊损伤大鼠胸主动脉内皮后P16及增殖细胞核抗原表达的影响

全反式维甲酸对球囊损伤大鼠胸主动脉内皮后P16及增殖细胞核抗原达的影响 全反式维甲酸对球囊损伤大鼠胸主动脉内 皮后P16及增殖细胞核抗原表达的影响 CN43.1262/R中国动脉硬化杂志2004年第l2卷第2期l73 [文章编号]1007—3949(21304)12—02—017304 全反式维甲酸对球囊损伤大鼠胸主动脉内皮后 P16及增殖细胞核抗原表达的影响 ? 实验研究? 张先明,董果雄,张社华,褚现明,张斌,李宁 (青岛大学医学院1.附属医院心内科,山东省青岛市266003;2.中心实验室,山东省青岛市266021) 【关键词]药理学;全反式维甲酸对P16及增殖细胞核抗原表达的影响;免疫组织化学法;球囊损伤;内 膜增生;血管再狭窄:大鼠 【摘要]为研究全反式维甲酸对球囊损伤大鼠胸主动脉内皮后内膜增生过程,P16及增殖细胞核抗原表达的影 响,球囊剥脱大鼠胸主动脉内皮,并随机将大鼠分为手术组,全反式维甲酸治疗组及对照组,各组均于术前4天灌 胃至实验结束,除对照组于术后14天处死大鼠外,全反式维甲酸治疗组和手术组分别在术后2天,7天,14天和28 天处死大鼠并摘除大鼠胸主动脉,通过组织学检查和免疫组织化学技术术后14天和28天的内膜增生情况及 术后2天,7天,14天和28天PI6和增殖细胞核抗原的表达及全反式维甲酸(每天30mg/kg)灌胃对它们的影响.结 果发现,对照组及内皮损伤后2天均无血管内膜增厚,7天内膜开始增生,28天血管平滑肌细胞增殖减弱,但细胞外 基质增加.在手术组各时间点P16的表达变化不显着,增殖细胞核抗原于球囊损伤 后2天在中膜明显表达,术后7 天表达达到高峰,且主要在内膜表达,14天后逐渐下降.使用全反式维甲酸治疗后, 内膜增生程度及增殖细胞核抗 原的表达明显降低,而P16的表达在术后2天开始升高,14天达高峰.以上结果提示, 全反式维甲酸可有效抑制血 管内皮损伤后内膜的增生,其机制可能与促进P16表达和抑制增殖细胞核抗原表 达,从而抑制血管平滑肌细胞的 增殖有关. [中图分类号]t/96[文献标识码】A Effects0fAll—transRetinoicAcidonExpressionofP16andProliferationCellNuclearAn. tigenafterThoracicAortaBalloonInjuryinRats ZHANGXian-Ming.DONGGuo-Xiong,ZI-L~,_NGShe—H ?,CHUXianMing,ZHANGBin,andLINing (Depanm~of,AffirmedHospitalofO0~daoUnitersit)MedicalCollege,咖0266003;? CentralLaborataD,ofqZ~&oUniver一 ,MedicalCollege.@,gdoo266021,Chma) [KEYWORDS]BalloonInjury;B1oodVesselRestenosis;IntimalProliferation;Rats;RetinoicAcid;P16;Pro— lfferationCellNuclearAntigen [ABtAcr]AimToinvestigatetheeffectsofall— transretinoicacid(ATRA)onintimalproliferation,expressionofsup— pressorgeneP16andproliferationcellnuclearantigen(PCNA)after"qascularinju~inrats.MethodsRatswererandomly dividedintothreegroups:Group1(n=24)weregivenvascularballooninjury,Group2(n=24)weregiven30mg/('d) ATILA.intostomachfrom4daysbeforeinjuryto28daysafterinjury,Group3(n=6)servedascontrolswerekilledat14thday afteroperation.Neoinfimaareawerec~culatedmorphologicallyatday14,28afterinjury.TheexpressionofP16andPCNA weremeasuredbymeansofimmunokistoche?miealtechniqueandimagineanMy~ratday2. 7,14,and28afterinjury.Re— suitsThemigrationandproliferationofvaseUlarsmoothinusclecells(VSMC)hadnotexistedatday2afterballooninjuryincon tmlgroup.111ethickeningofinfimahadbegunatday7afterinjury.andtheywereinoresignificantatday14.Theproliferation ofvascularsmoothmusclecellsdecreasedatday28,butextracellularmatrixincreasedandtheintimalthickningcontinued.The positiveexpressionofPCNAwerefoundatday2andreachedmaximumatday7andbegundecreasingatday14afterballooninju— ry,buttheexpressionchangesofP16wasinapparentwhengivenATRA,theneointimalareaandtheindexofPCNAexpression reducedateverytimepoint,buttheexpressionofPI6begunincreasingatday2andreachedmaximumatday14aftervascular ballooninjury.CondusionATRAearleffectivelyrepressintimalproliferationaftervascularinjury,Milchmaybeassooiated withitdfibfingtheproliferationofvascularsmoothmusclecellsthroughdown— regulatingtheexpressionofPCNAandupregLdafing thatofPl6. [收稿日期]20031l一17[修回日期]2004—0320 【作者简介]张先I{』j,硕l=研究牛,主治帅,主要从事冠心病的I 味与研究,联系电话为0,E—maj1为zhanr?o225@st,}1I】. "n萤果雄,颁},教授,硕}:研究导帅,主要从事冠心病,心功能 小伞,心律失常的临床与研究,联系电话为0532—2911308jK社,副 敦授,主要从事临睐愉验的教学j研究,联系I乜话为一 对大血管壁的机械损伤可引起一系列的变化, 包括基因表达的突变和新生内膜的形成.冠状动 脉内血管成形术(percutanoustrmMuminalcorona~an gioplast),A)后再狭窄的主要机制为血管平滑肌 细胞增殖及迁移所致的新生内膜适度增生,局部血 174ISSN1007—3949ChinJArterioscler,Vol12,No2 栓形成,细胞外基质形成,早期血管弹性回缩及晚期 负性重塑.冠状动脉内血管成形术后再狭窄是制 约冠状动脉内血管成形术远期疗效的重要因素,探 讨有效地抑制血管再狭窄的药物是当前研究的热门 课题.近来研究发现,全反式维甲酸(all—transretino— icacid,ATILt,)可明显地抑制体外培养的血管平滑肌 细胞的增殖,抑制动物模型的动脉内皮损伤后内膜 增生,促进有益的血管重塑J.本研究利用球囊损 伤大鼠胸主动脉内皮后,给予全反式维甲酸治疗,观 察其对血管内膜增生过程,P16及增殖细胞核抗原 (proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)表达的影响, 探讨全反式维甲酸防治冠状动脉内血管成形术后再 狭窄的可能机制. 1材料和方法 1.1模型建立和实验分组 本实验选用雄性SD大鼠(北京大学实验动物 中心提供),体重250,300g,3%戊巴比妥钠(1.5 mL/kg,ip)麻醉,由左颈总动脉插入自制的2F球囊 导管至肾动脉分又处,充水0.1,0.2mL,回拉至颈 总动脉开口处,反复抽拉5次,拔除导管,缝合伤口, 常规饲养.3只大鼠术后即刻从左颈静脉注入 0.5%伊文思蓝(2mL/kg),1h后处死动物,观察内 皮剥脱情况,证明主动脉内皮剥脱完全. 大鼠随机分为3组,所有动物均于术前4天灌 胃至实验结束.手术组为球囊损伤+植物油组,共 24只大鼠,每只每天给予1mL植物油灌胃,按术后 处死时间分为术后2天,7天,14天和28天亚组,每 组各6只大鼠.治疗组为球囊损伤+ATRA组,共 24只大鼠,全反式维甲酸每天30mg/kg溶入1mL 植物油灌胃,按术后处死时间分为2天,7天,14 天和28天亚组,每组各6只大鼠.对照组共6只大 鼠,除不插入球囊导管外,余操作同手术组,术后14 天处死. 1.2形态学观察 处死各组大鼠,摘除胸主动脉,截取动脉上,中, 下3段,每段长约0.5ClTI,10%中性甲醛固定24h, 石蜡包埋,从每段血管的横截面随机切3张切片, HE染色.光学显微镜下观察血管内膜增生情况,并 l喟图像分析仪测定内膜面积,并计算内膜面积与中 膜面积比 内膜面积=内弹力板包绕面积一管腔面积. 1.3免疫组织化学法 将啕主动脉蜡块切片后,进行PCNA及P16的 免疫组织化学染色,DABH202显色,苏木素复染,胞 核呈棕色为阳性,每例动物每个指标观察3张切片. 图像分析仪随机测量每张切片中6,8个视野的阳 性细胞平均吸光度及阳性细胞百分率,取其均数,用 两者乘积再乘以100,作为阳性表达指数来表示蛋 白质的表达水平j. 1.4统计学分析 实验数据用?表示,各组间比较用方差分 析,2组间比较用q检验进行统计学处理. 2结果 2.1形态学观察 对照组及球囊损伤大鼠主动脉内皮后2天尚无 新生内膜形成,但术后7天内膜开始增生;14天及 28天内膜增生非常显着,且新生内膜细胞排列紊 乱.使用ATRA后治疗组动脉中这些现象明显轻于 手术组,图像分析显示术后14天和28天治疗组的 新生内膜面积及内膜/中膜面积与手术组相比明显 减少(表1,Table1). 表1.全反式维甲酸对球囊损伤大鼠胸主动脉内皮后主动脉 内膜增生的影响(?,n:6) Table1.EffectsofATRAOilinlimalproliferationatday14.28 afterballoonmjary a:P<0.O1,与手术组比较. 2.2全反式维甲酸对P16表达的影响 在手术组,球囊损伤血管内皮后各时间点P16 的表达无明显差异;而在治疗组,球囊损伤后2天 P16的阳性表达指数与手术组相比无明显差异(9.8 ?1.9比8.9?1.4),而损伤后7天明显升高(17.6 ?1.3比8.9?1.7,P<0.01),14天达高峰(22.1? 3.1比9.0?1.6,P<0.01),28天时降低但仍高于 手术组(15.2?1.7比8.5?1.5,P<0.01).对照 组表达阴性(图1,Figure1). 2.3全反式维甲酸对增殖细胞核抗原表达的影响 球囊损伤后2天中膜即有增殖细胞核抗原表 达,7天表达达到高峰,阳性细胞主要聚集在新生内 CN43—1262/R中国动脉硬化杂志2004年第12卷第2期l75 膜,l4天开始表达明显下降.中膜表达极少或没有 表达,只有内膜可见阳性表达细胞,且各时间点PC. NA表达的阳性指数治疗组均明显低于手术组(P( 0O1).对照组无阳性表达(表2和图2,Table2和 Figure2) A舔. ?' 图1球囊损伤后14天P16表达ix4?】A为手托目l;B 为全豆式维陆清疗凯 figurelE】ofPI6mday14船operation(×400) 表2全反式维甲酸对球囊损伤大鼠胸主动脉内皮后增殖细 胞核抗原表达的影响(?.n=6) Table2Effet'tsofATRAonexpresserofPCNAafterballoon i帅inrats 3讨论 大量研究表刚ATRA能通过维fl『1酸受体抑制 血管损伤平滑肌细胞增殖迁移和新生『q膜的形 成,ATRA袱摄入机体后,与维甲酸受体结合,并通 .,. ,一?, | B 一 :. 圊2.球囊损伤后7天增殖细胞核抗原表达cx4O0】A 为于术;13为全厦武维甲酸治疗组 Figure2.ExpressiemofPCNA?day7aI?q瑁ti?(×400) 过受体与启动子上特异性的反应元件结合,进而调 节特异基因的转录J.本实验也证明:术后7天 PCNA增殖达高峰,说明此时期细胞增殖最活跃;应 用ATRA后,作为细胞增殖标志的PCNA表达也受 到明显抑制,术后14天手术组新生内膜的面积明显 大于治疗组. 全反式维甲酸能阻止细胞周期的进程.并抑制 成视网膜细胞瘤蛋白(pRb)磷酸化,上调细胞周期 蛋白依赖性激酶(cvdin—dependentkinase,CDK)抑制 蛋白P27基因表达,通过调整G.S期细胞周期调节 因子抑制细胞分化活性.细胞周期进程受细胞因 子,周期调控蛋白,癌基因及抑癌基因表达产物等多 因素调控,各因素之间相互协凋,构成网络调控机 制.P27一PI6融台基因,被命名为W9,在体外能明 显抑制新生内膜的增殖….PI6可直接作用于细 目周期,与细胞周期蛋白(Cyen)D竞争结合CDK4. 并抑制其活性,使pRb持续去磷酸化状态,导致cl 期滞….日前研究认为,CyclinDI—CDK4.PI6一pRb 环路为间控细胞(1期的最重要途径.并且PI6, CDK和pRb问可能为一负反馈调节环路本研 究发现,在手术组球囊损伤大鼠胸主动脉内皮后各 176ISSN1007—3949ChinJArterioscler.Vol12.No2 在治疗组 时间点P16表达的阳性指数变化不大, PCNA的表达受到抑制,而P16的表达明显升高.这 可能是由于A能抑制pRb的磷酸化,提高P16 的表达水平,P16与CDK4结合,抑制CDK4的激酶 活性,使细胞周期阻滞在G期,从而抑制血管新生 内膜的增殖.术后14天,治疗组新生内膜的面积明 显小于手术组也说明了这一点. 本实验结果表明:ATRA抑制血管内皮损伤后 内膜增生的机制可能与上调P16和下调PCNA的表 达有关,但平滑肌细胞增殖的途径呈网络状交叉分 布,单纯抑制一条途径难以奏效.ATRA使我们对 PTCA术后再狭窄的药物防治看到了希望,但其临床 有效性和作用机制尚须进一步探索. 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AU?一mfinoicacidreduce~neointimalformationandpromotesfavorablegeo? metricmmndlingoftheratcawtidafterballoondwI町.Circulation. 1998.98(12):1219—227 [5]聂晓敏.刘瑞云.黄振文.张金盈,董建增.崔天祥1,精氨酸对大鼠 血管损伤后内膜增生及相关细胞周期调控基因表达的影响.中国病理 生理杂志.2001,17(3):248—250 l6]KizkiM,DawsonMI.He)ThanRtofnovelretinoidXreceptorselective ligm~dsOiln~'eloidleukemicdiffeveventiafionandp~liferationinvi仃D.B/aod. 1996.87(16):1977—983 [7]TannerFC.BoetunM.AkyinekLM.SanH.盈i—Yong,Tashi~J,eta1.Dif- femnfialeffectsofthecyclin—dependentkilkaseintfibitorsp27Kip1.p21Cip1.and pl6Ink4oilvascularsmoothmusclecellproliferation.Circulation,2OOO.101 (17):2022-025 [8]McArtharJG.qangHCitronD.GamamG.I丑陀BL.Gym4sJ.eta1. p27一p16Chimera:Asuperioranfipmliferafiveforthepreventionof,wointim~hy— perplasia.Mo/ecu/~Thera/~.2001.3(1):8—13 [9]1LV.CarcmadA.MondesireJ,CarlsonP.ZayekN,CanmJdL.eta1. p27一p16Fusiongeneinhibitsangioplas~一inducedneointimalh)-perplasiaandc(130一 narvarteryocclusion.CirctdationResearch.2001.89(4):323—328 l10jLa】T甲hemL.TsuiL,WickS.NakanoT.KilinskiL.FinerM.eta1.Novel chimericp16mad027moleculeswithincreasedanfipmiiferafiveactivi押forvascu. 1ar~ea3egenetherapyJMolecularMedicine,2000.78(8):451459 [11]白明,张晓菊,金阳,陶晓南.抑癌基因p16对维A酸诱导肺癌细 胞分化的作用.中华结核和呼吸杂志.2001,24(9):534—537 [12]杨志祥,糜漫天,张乾勇,郎海滨,韦娜.CyclinDl在视黄醇类化合 物诱导骨髓细胞分化中的作用研究白血病杂志.2OOO,9(2):79—82 (此文编辑朱雯霞) [文章编号]1007—3949(2004)12—02—0176-01 肥大细胞对平滑肌源性泡沫细胞I型胶原和 ?型胶原表达的影响 甘露,刘录山,唐朝克,万载阳,危当恒,万腊香,杨永宗 (南华大学心血管病研究所,湖南省衡阳市421001) [关键词]病理学与病理生理学;肥大细胞;泡沫细胞;胶原;动脉粥样硬化 目的检测大鼠腹腔肥大细胞(mastcell,MC)对平滑肌源性泡沫细胞I型胶原和?型胶原表达的影响.方法sD大鼠体重 约200g,雌雄不限,供采集MC和原代培养平滑肌细胞(smoothmusclecell,SMC).采用梯度密度离心分离MC,提取MC上清液 (含MC释放的各种炎症介质).用MC上清液和氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)处理SMC,实验分四组:对照组SMC在5mL含 10%小牛血清的DMEM中培养48h;oxIJ)L组SMC在5mL含10%小牛血清的DMEM中(含oxIJ)L,终浓度为100mg/L)培养48 h;MC上清液组SMC在5mL含10%小牛血清的MC上清液(由含1×1个MC的细胞悬液提取)中培养48h;MC上清液+0x. LDL组SMC在5mL含10%小牛血清的MC上清液(由含1×1个Mc的细胞悬液提取)中(含oxIJ)L,终浓度为100mg/L)~养 48h.采用油红0染色检测SMC泡沫化.RT-PCR检测SMCI型胶原和?型胶原mRNA的表达,PcR引物序列I型胶原为5一 GACACTGAACCCrrrGTAA1U3和5一GTGA从L3'CCCGTCTGCF..3,扩增片段长度为399bp;?型胶原引物序列为5一AGC GGAG从TAC3W,Gc3和5一TGTAATGrITCIGGGAGGC一3,扩增片段长度为288bp;内参照采用actin,引物序列为5一GTG GGGCGCCCCAGGCACCA一3和5一CTCC3TAATGTCACGCACGATTFC一3,扩增片段长度为548bp.免疫细胞化学染色检测 SMCI型胶原和?型胶原蛋白表达.结果油红0染色显示MC上清液可加速SMC泡沫化.RT-PCR结果发现,与对照组 SMC相比,用oxLDL或MC上清液分别单独处理SMC48h后,I型胶原和?型胶原的mRNA表达均降低,用0xLDL和MC上清 液同时处理SMC48h后,I型胶原和?型胶原的m1A表达降低更明显.免疫细胞化学染色显示,对照组SMC细胞浆内有大 量棕色颗粒.颗粒粗大而染色深,说明对照组I型胶原和?型胶原的蛋白表达为强阳性;用oxLDL或MC上清液分别单独处理 SMC8h后,细胞浆内棕色颗粒少而染色戋,说明I型忮原和?型胶原的蛋白表达均明显降低:用0xu)I|和Mc上清液同时处 理SMC48h后,I型肢原和?型耳吏原的蛋白表达降低更明显,结论MC在体外抑制SMCI型胶原和?型月吏原表达,并且能 协同oxLDL对I型耳吏原和?型胶原表达的抑制作用因此MC释放的炎症介质也许参与了动脉粥样斑块纤维帽的重构