脓毒症大鼠心肌细胞凋亡及肾上腺糖皮质激素的作用
首都医科大学
硕士学位论文
脓毒症大鼠心肌细胞凋亡及肾上腺糖皮质激素的作用
姓名:张寒钰
申请学位级别:硕士
专业:急诊医学
指导教师:谢苗荣
20070301首都医科大学
学位论文原创性声明
本人郑重声明:所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得 的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外,本论文不包含任何其他
个
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集
体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人
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日期:如年月,占日
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、保密口,在一年解密后适用本授权书。
、不保密西
作者签名: 乞劈诲
期:卿年月“日
导师签名:
日期:厶劝年月//日首都医科大学硕士学术论文
脓毒症大鼠心肌细胞凋亡及肾上腺糖皮质激素的作用
中文摘要
目的观察脓毒症状态下大鼠心肌力学的改变及心肌细胞的凋亡变化并探讨糖
皮质激素对心肌力学及心肌细胞凋亡的影响及其机制。
材料和方法采用盲肠结扎穿孔术
吼,制作脓毒症
模型。体重为~的大鼠被随机分为组,每组只。每组大鼠 均行,于术前及术后小时测体温及血常规,术后小时开始给予舒 普深/,次/天。分组:组:手术后小时给予地塞米松./, 小时处死;组:术后小时注射生理盐水,小时处死;组:
手术后小时给予地塞米松./,小时再次给予地塞米松./, “小时处死;组:术后相应时间注射生理盐水,小时处死; 组:手术后小时给予地塞米松./,、及小时分别给予地
塞米松./,小时处死:组:术后相应时间注射生理盐水, 小时处死。
各组动物均行颈动脉、左心室内插管,监测血压及左心室功能变化共 分钟,包括心率
,、收缩压 ,、舒张压
,、平均动脉压
、左室收
缩峰压
,、左室压力上升/下降最大速率,,、左室舒张末压,。取出心脏,分离左心室,
制备单细胞
悬液,进行流式细胞仪检测。左心室行免疫病理检测抗细胞凋亡蛋白淋巴细 胞瘤/白血病一.
/,.的表达。
结果首都医科大学硕士学术论文
血流动力学监测:组、组大鼠的心率、收缩压、舒张压、平均动脉压、
左室收缩峰压、左室压力上升/下降最大速率显著高于组、组.及 组、组.,而左室舒张末压显著低于组、组.及组、
组.;组、组大鼠的心率、收缩压、舒张压、平均动脉压显著高 于组、组.,左室舒张末压显著低于组、组.,而左室
收缩峰压、左室压力上升/下降最大速率与组、组的大鼠相比无明显变化 .;组大鼠的收缩压、舒张压、平均动脉压、左室收缩峰压、左室压 力上升/下降最大速率明显高于组.,而左室舒张末压显著低于组大 鼠;组大鼠的收缩压、舒张压、平均动脉压、左室收缩峰压、左室压力上升/ 下降最大速率明显高于组.,而两组左室舒张末压无明显变化.; 组大鼠的心率、收缩压、舒张压、平均动脉压、左室收缩峰压、左室压力上 升/下降最大速率、左室舒张末压与组大鼠相比均无显著差异.。 组、组、组大鼠心肌细胞凋亡分别较组、组、组明显减
少.;组大鼠的心肌细胞凋亡率显著低于组及组大鼠;组大鼠 的心肌细胞凋亡率显著高于组大鼠.;、、组大鼠心肌细胞
凋亡无显著差异.。
结论
脓毒症时应用糖皮质激素及抗生素早期能够改善脓毒症大鼠的心功能,但 继续应用并不能完全阻止心功能的继续恶化;
脓毒症时存在心肌细胞凋亡,以小时最明显,脓毒症时应用糖皮质激 素能够减少各个阶段心肌细胞凋亡;
脓毒症时心肌细胞凋亡不是脓毒症晚期心功能受损的主要原因; 脓毒症时应用抗生素及糖皮质激素或单纯抗生素并不能阻止脓毒症大鼠
心功能的恶化,需要积极的全面治疗。 首都医科大学硕士学术论文
关键词
脓毒症,盲肠结扎穿孔术,心肌细胞凋亡,免疫组化,流式细胞,心肌力
学蔓堡堕型奎竺堡圭兰垄丝苎/.. 似~
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首都医科大学硕士学术论文
刖 置
全身炎症反应综合征 。是因
感染或创伤、烧伤、缺氧、再灌注损伤等因素作用于机体而引起的一种全身
性
的持续高代谢、高动力循环状态以及过度的炎症反应综合征。其中由感染引
起
者称为脓毒症。若原发疾病没有得到控制,则可进一步发展成重症脓毒症 及脓毒性休克 ,严重者可导致多器官功能障碍,。其中约%的脓毒症患者会出
现左、
右心室功能障碍,一旦出现心脏并发症,患者病情会急剧恶化,死亡率可由% 升至%或更高。目前国内外学者针对脓毒症的发病机理、演变机制、病理变
化从器官、组织、细胞、细胞因子等不同层次进行了大量的研究,但以往的研
究大都侧重于机体整体对炎症反应的应答,器官层次的研究主要集中在肺脏、
肝脏等,对脓毒症时心脏损伤情况及发病机制研究不多,而且以往对心脏的研
究也主要集中于心室压力负荷过重或心肌缺血方面的心肌细胞的变化及机制。
随着对脓毒症的进一步了解,凋亡机制的深入研究,调控细胞凋亡将成为今后
许多疾病的重要治疗途径之一。本实验观察了脓毒症状态下大鼠血流动力学指
标、、、、士/:脓毒症时心肌细胞抗凋亡蛋白.
的表达及心肌细胞凋亡率的变化,以及地塞米松对脓毒症大鼠血流动力学指标
和心肌细胞抗凋亡蛋白.及心肌细胞凋亡率的影响。其目的在于探讨脓毒症
不同阶段心功能的变化,脓毒症时心功能损伤的机制,以及脓毒症不同阶段地
塞米松对心脏的保护作用。
首都医科大学硕士学术论文
大鼠脓毒症模型的制作、血流动力学及
心肌细胞凋亡的测定方法及结果
实验材料
.实验动物
本实验共用只雄性健康大鼠,体重~,首都医科大学实 验动物中心提供。
.主要药品与试剂
地塞米松 天津药业焦作有限公司
注射用头孢哌酮舒巴坦钠 辉瑞制药有限公司 乳酸钠林格液 上海大仲制药
.%氯化钠注射液 上海大仲制药
肝素注射液/支 江苏常州千红生化制药有限公司 :
武汉博士德生物工程有限公司
兔抗鼠单克隆抗体 武汉博士德生物工程有限公司 即用型: 武汉博士德生物工程有限公司 显色试剂盒: 武汉博士德生物工程有限公司 .:氯化钠.,无水磷酸氢二钠.,无水磷酸二氢钠., 蒸馏水。:.? 北京化工试剂厂
.枸橼酸盐缓冲液:枸橼酸三钠?,枸橼酸 北京化工试剂厂
出?。调制:.。
北京中北林格生物技术公司
.%的胃蛋白消化液.
北京中北林格生物技术公司 碘化丙啶/
公司
酶/
.乙酸钠. 北京化工试剂厂 首都医科大学硕士学术论文 / .
北京化工试剂厂
./柠檬酸钠 北京化工试剂厂 生理盐水
北京双鹤药厂
.主要仪器
型生物信号采集系统 北京微信斯达科技发展有限公司
血常规分析仪
百泰公司.
电子秤
石蜡切片机
美国
.
光学显微镜 日本?呼 电子分析天平 日本 . 电热恒温培养箱 天津市泰斯特仪器有限公司
微波炉 格兰仕公司
加样器 芬兰
离心机
电子天平 日本
流式细胞仪 美国公司
.主要器械
眼科手术器械一套眼科剪、眼科镊、止血钳、备皮刀、弯盘、/号丝 线、棉签、无菌纱布、号针头、血常规管、注射器及注射器、大鼠 固定板、无菌手套、标记笔、鼠尾器、碘伏、干棉球、二甲苯、酒精、盐酸、 树胶、盖玻片、载玻片、湿盒、苏木精、抗原修复盒、眼科剪、目尼龙网、 玻璃离心管、一次性塑料吸管。
实验方法
.动物分组
只雄性健康大鼠,随机分为组,每组只。每组动物均行盲肠首都医科大学硕士
学术论文
结扎穿孔手术,并于术前及术后小时测体温及取血行血常规检测,术后小 时开始给予舒普深/,次/天,尾静脉注射。具体分组如下: 组:术后小时给予生理盐水尾静脉注射,小时处死;
组:手术后小时给予地塞米松./稀释至尾静脉注射,
小时处死;
组:分别于术后小时及小时给予生理盐水尾静脉注射,
小时处死;
组:分别于手术后小时及小时给予地塞米松./稀释至
尾静脉注射,小时处死:
组:分别于术后小时及小时、小时、小时给予生理盐水
尾静脉注射,小时处死;
组:分别于手术后小时、小时、小时及小时给予地塞米
松./稀释至尾静脉注射,小时处死。
.大鼠脓毒症模型的制作
大鼠术前小时禁食,自由饮水。实验前即刻称重,测基础体温,碘伏消 毒鼠尾次,%酒精脱碘次,无菌干棉球擦干,剪鼠尾取静脉血.于血 常规管中。%戊巴比妥钠溶液/腹腔注射,待麻醉成功后,仰置于手 术台上,固定头部及四肢。腹部备皮,常规碘伏消毒,铺洞巾。中腹部纵形切 口.,逐层切开至腹腔,找出大鼠盲肠,用/号丝线结扎盲肠游离端/ 长度,注意避免损伤回盲部系膜血管,保持肠道通路正常。用号针头对穿 个孔,然后将肠管回纳入腹腔。依次缝合腹膜和皮肤,乳酸钠林格液/皮 下注射补液。术后小时再次测体温,碘伏消毒鼠尾次,%酒精脱碘次, 无菌干棉球擦干,剪鼠尾取静脉血.于血常规管中。每只大鼠尾静脉注射舒 普深/,次/天。激素组于相应时间点经尾静脉注射地塞米松./, 并于相应时问点处死见附图。
.血流动力学和左室功能的监测
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各组大鼠均以%戊巴比妥钠溶液/腹腔注射麻醉,仰卧位固定 于实验台上,连接.型生物医学信号采集系统,经右颈总动脉插管,
监测并记录心率、动脉收缩压、舒张压和平均动脉压,
然后将导管送入左心室,监测并记录左心室收缩峰压、左心室舒张末期 压及左心室等容期压力最大变化率?/一,监测时间共分钟。 .免疫组化检测心肌细胞凋亡
..载玻片的处理
新购载玻片用煮沸的洗衣粉水充分擦洗,流水冲洗干净后蒸馏水冲洗次, %酒精中浸泡小时,取出后于烤箱中烘烤时以上,浸入用丙酮: 稀释的中秒以防脱片,取出后稍停,再入丙酮溶液中.次洗去未结 合的,空气中晾干。
..标本采集与制作
血流动力学指标测定完成后,立即打开胸腔,迅速取出心脏,在冰生理盐 水中冲洗,去掉周围大血管、左右心耳及右心室,左心室用%甲醛固定小 时,依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋后,置于石蜡切片机.型,美国产 切成厚的石蜡片,备用。
..免疫组化的步骤
切片置烤箱中分钟;
切片常规脱蜡至水,切片入二甲苯中分钟,次一切片入%酒精中 分钟,次一切片入%酒精中分钟,次一切片入%酒精中分钟一切片入 %酒精中分钟?切片入%酒精中分钟;
%过氧化氢消除内源性过氧化物酶分钟,避光;
蒸馏水冲洗分钟,次;
热抗原修复.枸橼酸盐缓冲溶液于抗原修复液中,微波炉加热至沸
腾,切片入枸橼酸盐缓冲溶液中,高火分钟后改为低火分钟,冷却致室温后,
洗涤分钟,:;首都医科大学硕士学术论文
滴;%封闭液,室温时,甩去多余液体,不洗;
滴力:稀释的兔抗鼠.单克隆抗体,室温过夜,洗分钟,次; 滴加生物素化山羊抗兔,室温时,洗分钟,次; 滴加,室温分钟,洗分钟,次;
显色蒸馏水,加入试剂滴,摇匀后加入试剂、各一滴, 混匀后加至切片上,室温显色.分钟,显微镜下控制反应时间,蒸馏水洗涤终
止反应;
苏木素复染.分钟,流水冲洗分钟;
%盐酸酒精分化数秒,流水冲洗数分钟;
%酒精一%酒精一%酒精脱水数秒,二甲苯透明数秒,次一滴 加一滴树胶封片一贴标签;
显微镜下观察。
.流式细胞仪检测心肌细胞凋亡
..溶液的配置
酶的制备:?.乙酸钠溶于去离子水中;
?.溶于去离子水中;
?溶解酶于乙酸钠中,浓度/;
?。水浴分钟,缓慢冷却至室温;
?加入/倍体积溶液;
?冰箱保存。
碘化丙啶的制备: ./柠檬酸钠:
?上述溶液中溶解至/;
?常温避光保存。
胃蛋白酶消化液的制备: .胃蛋白酶溶于生理盐水中,盐酸调 至.。
..实验步骤首都医科大学硕士学术论文
每只大鼠在血流动力学指标测定完成后立即打开胸腔,迅速取出心脏, 在冰生理盐水中冲洗,去掉周围大血管、左右心耳及右心室,左心室用滤纸吸
干后取.心肌组织;
将组织剪成大小的小块,生理盐水漂洗剪碎的组织; 加入胃酶消化液,恒温水浴分钟,消化期间每间隔.分钟 振荡一次;
消化分钟后,立即加入生理盐水终止反应;
目尼龙网过滤,未消化完的组织做二次消化:
收集细胞悬液,离心分钟,弃去上清;
.加生理盐水,一次性吸管吹打,?离心分钟,重复次; ;
显微镜下观察细胞碎片%;
加入倍体积的%冰乙醇,第冰乙醇一滴一滴的加,边加入边振 荡,防止结晶沉淀,余缓慢加入,。保存;
上机前加生理盐水,一次性吸管吹打,.离心分钟,重 复次,制成/的细胞悬液;
取.细胞悬液,加入酶.,下处理小时; ;
;
酶处理的细胞悬液加.溶液,作用分钟;
尼龙网目过滤后上机检测。
.统计学分析
使用.统计软件系统,所有数据以均数?标准差表示?,各
组间数据比较采用单因素方差分析检验,.为有统计学意义,.为 有显著统计学意义。
实验结果
.大鼠脓毒症模型的建立
大鼠盲肠结扎和穿刺术后小时精神萎靡,对刺激的反应性降低,蜷缩成首都
医科大学硕士学术论文
一团,腹泻、未见摄食饮水,血常规检测白细胞总数降低,%。术后小时打 开腹腔显示,腹腔内无粪便溢出,盲肠明显肿胀,仍可见表面穿刺孔,脆性增 加。大鼠盲肠结扎和穿刺术后及小时大鼠出现了明显的萎靡、精神不振、 眼神呆滞、眼半闭和对刺痛反应不敏感,打开腹腔显示,结扎后的盲肠肿胀、 坏疽,腹腔内多量浑浊渗出液,胃、肠、肝脏、肾脏瘀血、肿胀,脆性增加。
见
附图。
表,脓毒症模型大鼠的术前、术后的血象和体温变化
表所示:术后小时大鼠体温与基础值相比下降幅度大于摄氏度, 白细胞总数下降幅度大于基础值的%。
.心率、血压的变化
..盐水组之间大鼠心率、血压的情况
组大鼠的心率、收缩压、舒张压、平均动脉压显著高于组及组大鼠; 组大鼠的心率、收缩压、舒张压、平均动脉压显著高于组见表。 表、组、组、组大鼠心率、血压情况
:心率次/分;:收缩压;:舒张压】曲
:平均动脉压。’.,’.。
首都医科大学硕士学术论文
..激素组大鼠之间的心率、血压情况
组大鼠的心率、收缩压、舒张压、平均动脉压显著高于及组大鼠; 大鼠的心率、收缩压、舒张压、平均动脉压显著高于组。见表。 表、组、组、组大鼠心率、血压情况
:心率驸分;:收缩;.舒张压?
.平均动脉压。。.,’...
..激素组与盐水组不同时间点心率、血压的情况
组大鼠的心率、收缩压、舒张压、平均动脉压明显高于组见表。 表、组与组的大鼠心率、血压情况
:心率撕分;.收缩;:舒张压
..平均动脉压。’.,‘.。
组大鼠的心率、收缩压、舒张压、平均动脉压明显高于组的大鼠见 表。首都医科大学硕士学术论文
表、组与组的大鼠心率、血压情况
:心率匆分;:收缩压;:舒张压?;
..平均动脉压。.,..。
组大鼠的心率、收缩压、舒张压、平均动脉压与组大鼠相比无显著差 异。见表。
表、组与组的大鼠心率、血压情况
:心率次/分;:收缩压::舒张压:
.平均动脉压龃。.。‘..。
表、、、、所示:组大鼠的心率、收缩压、舒张压、平均动脉压 显著高于组.及组.;组大鼠的心率、收缩压、舒张压、
平均动脉压显著高于组.;组大鼠的心率、收缩压、舒张压、平均 动脉压显著高于组.及组.;组大鼠的心率、收缩压、
舒张压、平均动脉压显著高于组.;组大鼠的收缩压、舒张压、 平均动脉压明显高于组.;组大鼠的收缩压、舒张压、平均动脉压 首都医科人学硕士学术论文
明显高于组.;组大鼠的心率、收缩压、舒张压、平均动脉压与 组相比无显著差异口.。
.各组大鼠左心室功能的情况
..盐水组大鼠心功能的情况
组大鼠左室收缩峰压、左室压力上升/下降最大速率显著高于组及组, 而左室舒张末压显著低于组及组;组大鼠左室收缩峰压、左室压力上升/ 下降最大速率与组大鼠相比无明显变化,而左室舒张末压显著低于组见 表。
表、组、组、组左心室功能参数的变化
:左室压力上升
:左室收缩峰压恤】;:左室舒张末压曲;,
最大速率/;一,。。:左室压力下降最大速率/。.,。..’ ..激素组大鼠心功能情况
组大鼠左室收缩峰压、左室压力上升/下降最大速率显著高于组及 组,而左室舒张末压显著低于组及组;组大鼠左室收缩峰压、左室压 力上升/下降最大速率与组大鼠相比无明显变化,而左室舒张末压显著低于
组大鼠见表。
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..激素组与盐水组大鼠不同时间点心功能情况
组大鼠的左室收缩峰压、左室压力上升/下降最大速率显著高于组, 而左室舒张末压显著低于组见表。
表、组、组左心室功能参数的变化
:左室收缩峰压;:左室舒张末压?;,。:左室压力上升
最大速率/;一仙。:左室压力下降最大速率咖。‘.,’’.。 组大鼠的左室收缩峰压、左室压力上升,下降最大速率显著高于组的 大鼠,左室舒张末压低于脓毒症组大鼠见表。
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表,组,纽左心室功能参数的变化
:皇收缩峰压口;:左室舒张末压;却,一左室压力上升
最大速率四蚴;一,。:左室压力下降最大速率四,。..,?’.。 组大鼠的左室收缩峰压、左室压力上升,下降最大速率、左室舒张末压 与组大鼠相比无明显变化见表。
表、组、组左心室功能参数的变化
?:左室收缩峰压王曲;:左室舒张末压】;/。。:左室压力上升 最大速率?/;一,?。:左室压力下降最大速率?/。.。’印.. 表、、、、所示:组大鼠左室收缩峰压、左室压力上升,下降最 大速率显著高于组.及组大鼠.,而左室舒张末压显著低于 组.及组大鼠.;组大鼠左室收缩峰压、左室压力上升/ 下降最大速率与组相比无明显变化.,而左室舒张末压显著低于组 大鼠.;组大鼠左室收缩峰压、左室压力上升/下降最大速率显著高于 组.及组大鼠.,而左室舒张末压显著低于组.首都医科大学硕士学术论文
及组大鼠.;组大鼠左室收缩峰压、左室压力上升/下降最大速率 与组大鼠相比无明显变化.,而左室舒张末压显著低于组大鼠 .;组的大鼠的左室收缩峰压、左室压力上升/下降最大速率显著高于 组.,而左室舒张末压显著低于组.;组大鼠的左室收缩 峰压、左室压力上升厂降最大速率显著高于组.,而左室舒张末压低 于组.;组大鼠的左室收缩峰压、左室压力上升/下降最大速率、左 室舒张末压与组大鼠相比无明显变化.。
.各组大鼠心肌细胞抗凋亡蛋白的表达
免疫组化染色后,蛋白阳性呈棕黄色细颗粒,位于胞浆内,主要表达 在心肌细胞。见附图。 .
.,各组大鼠心肌细胞凋亡率的比较
盐水组大鼠心肌细胞凋亡率的比较
组大鼠的心肌细胞凋亡率显著低于组及组大鼠;组大鼠的心肌细 胞凋亡率显著高于组大鼠见表
表、组、与组比较
印.,。.
脓毒症大鼠小时心肌细胞凋亡达高峰,小时轻度下降。 激素组大鼠心肌细胞凋亡率的比较
组大鼠的心肌细胞凋亡率略低于组及组大鼠;组大鼠的心肌 细胞凋亡率低于组,但均无统计学意义见表首都医科大学硕士学术论文 表、组、与组比较
’.,‘’.
激素组与盐水组大鼠心肌细胞凋亡率的比较
组大鼠的心肌细胞凋亡率显著高于组的心肌细胞凋亡率见表 表、组与组比较
..,‘。.
组大鼠的心肌细胞凋亡率显著高于组大鼠的心肌细胞凋亡率见表 表、与组比较
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组大鼠的心肌细胞凋亡率显著高于组大鼠的心肌细胞凋亡率见表 表、组与组比较
‘.,’’.叭
首都医科大学硕士学术论文
表,、、,所示:本试验中给予生理盐水组的大鼠,小时即 出现细胞凋亡,小时细胞凋亡数量达峰值, 小时心肌细胞凋亡数明显大 于小时心肌细胞凋亡数.,小时心肌细胞凋亡数逐渐减少。应用地 塞米松各组的大鼠心肌细胞凋亡数比较无明显变化.。小时、小时及 小时应用地塞米松组大鼠心肌细胞凋亡数均明显低于相应时间点上应用生
理
盐水组大鼠.。
讨论
全身炎症反综合征,是因
感染、创伤、烧伤、缺氧、荐灌注损伤等因素作用于机体而引起的一种全身
性
的持续高代谢、高动力循环状态以及过度的炎症反应综合征【。由感染引起
的
称之为脓毒症。若原发疾病没有得到控制,则可在脓毒症的基础上进展到 重症脓毒症
的阶段。重症脓毒症是指脓毒症伴有器官功能障碍。
其定义如下:心血管系统:或在给予足够的补液情
况下小时内收缩压下降.,或小时给予生理盐水
病人仍无反应;呼吸系统:.;泌尿系统:每
小时尿量./:中枢神经系统:精神状态有明显改变昏迷评
分至少降低分【。
心功能不全或衰竭是重症脓毒症预后不良的重要因素。一旦出现心脏并发 症,脓毒症患者病情会急剧恶化,死亡率即由%上升到%~%。本实验 应用大鼠动物模型研究脓毒症时血流动力学及心肌细胞凋亡的变化,并探讨
地
塞米松注射液对脓毒症时心功能及心肌细胞凋亡率的影响。 .动物模型的建立
本实验采用大鼠盲肠结扎和穿孔术制作脓毒症模型。盲肠结扎和穿孔术 ,致大鼠脓毒症模型是国内外较早采用的脓毒
症模型制作方法,其病理过程与临床脓毒症较为相似,是制作脓毒症、感染性
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休克及模型常用的方’法【。’’’吼。模型操作简便,通过外科处理使 动物腹腔存在失活组织的同时,少量混有多种细菌的肠内容物持续溢入腹
腔,
引起腹腔感染,继而出现全身炎症反应综合征和脓毒症。血中内毒素检出率及
细菌培养包括菌和一菌阳性率高,内毒素和促炎因子升高幅度相对平缓,
持续时间长,这些特点均显示出模型在临床相关性方面的优势。但此模型
的缺陷是穿孔后是否包裹关系到动物的预后,并受施术者手法和动物个体差异
的影响,不易人为控制【卿。
一般来说,动物脓毒症的诊断标准为【】:直肠温度较正常或术前升高
或降低.;呼吸频率超过对照值倍或低于对照值的%;
白细胞总数超过对照值的倍或减少%;心率较对照值增加%。以上
各项指标皆是间接反映全身炎症反应的表现,但是由于大鼠容易激惹,测定动
物呼吸、心率在实际操作中并不能保证其准确性【】,故而器官损伤的病理改变
为脓毒症诊断的金标准。本实验在盲肠结扎和穿刺术后小时及术后、小
时的大鼠腹腔皆显示结扎后的盲肠呈黑紫色、肿胀,腹腔内血性浑浊渗出液较
多。大鼠心脏染色病理片示灶性心肌纤维断裂、灶性间质水肿、心肌细胞空
泡变性及嗜酸性变,并可见灶性心肌坏死、肌膜细胞增生、肌浆溶解、间质血
管淤血。血象白细胞总数下降%,体温下降大于?。故可认为本实验所用
的模型达到了诊断脓毒症的标准。
.血流动力学的变化
脓毒症早期机体循环系统表现为体循环阻力下降、心输出量和组织灌流量
正常或增加【】。体循环阻力下降是脓毒症的首要血流动力学改变,其血流动力
学改变的基础是机体高心排、高体温、高通气、外周血管舒张功能异常及血管
通透性改变导致血液重新分布旧”】。脓毒症晚期机体出现顽固性低血压、心室
收缩功能损害、心脏扩大、射血分数下降、对容量负荷收缩反应差及收缩峰值
压力/收缩末期容积比值下降。
、/是与心肌收缩强度相关的指标。./是心室收缩后左室内压首都医科大学硕士学术论文
快速下降期的最大下降速率,反映左室的舒张功能,是心肌早期心室舒张功能
改变的敏感指标。若动脉压不变或降低,./降低则表示左室舒张功能异常。
当左心室舒张功能不全或回心血流量增加,使升高。部分实验发现大鼠
脓毒症在病程进展过程中有两个阶段,第一阶段为脓毒症早期,处于高血流动
力学状态,出现血压的上升,心率增快,、::/增大,减小,心
脏收缩及舒张功能处于增强状态;第二阶段为脓毒症晚期,处于低血流动力
学
状态,出现血压下降,、::/减小,增大,心脏收缩和舒张功能
都受损。但在脓毒症早期和晚期的分界时间段上,各文献报道的不尽相同,一
般认为【悼期在模型制作后小时,晚期在小时。笔者实验所显示的数据也
与此基本相符。时间的差异可能与模型制作的具体方法有关,如:盲肠结扎的
范围、穿刺的部位、孔径等。
本实验中生理盐水组和激素组大鼠的心率、收缩压、舒张压、平均动脉压、
左室收缩峰压、左室压力上升/下降最大速率均随着时间的延长而明显下降。表
明随着脓毒症病程的进展,心功能和血流动力学是进行性恶化的。年,
等【就证实脓毒症时机体出现左室射血分数下降,并发现脓毒症时心肌抑制约
占并发症的%【。此后多项研究脓毒症的动物实验也得出了类似的结果。
.糖皮质激素对心功能的影响
脓毒症时机体存在相对肾上腺功能不全和外周糖皮质激素抵抗,相对肾上
腺功能不全的总发病率为%~%【 】。糖皮质激素具有稳定细胞膜、溶酶
体膜及肥大细胞膜,减轻脱颗粒反应,减少组胺释放的作用,同时能诱导细胞
合成多种磷脂酶:抑制蛋白,减少花生四烯酸的释放,防止中性粒细胞活化和内
皮细胞损害,抑制师.、、氧自由基、前列腺素等炎症介质的释放,从而
在脓毒症时起到保护脏器功能的作用【埘。糖皮质激素对心血管作用的机制
可能
为【: 抑制诱导型一氧化氮合酶和细胞色素氧化酶一合成; 使心
恢复儿茶酚胺受体对于儿
血管对于内毒素及致炎细胞因子产生耐受状态;
茶酚胺的敏感性; 的升压作用与交感神经兴奋无关。首都医科大学硕士学术论文
本试验发现,无论是地塞米松组还是生理盐水组,大鼠的心功能均进行下
降。表明随着脓毒症时间的延长,心功能是进行性恶化的。地塞米松组大鼠小
时及小时的血压及心功能均明显高于相应时间点上的生理盐水组大鼠,说明
地塞米松能明显改善脓毒症早期大鼠的心功能和血流动力学。长期的动物实验
显示,早期应用糖皮质激素,能显著改善脓毒症动物模型血流动力学指标,甚
至提高实验动物的生存率。小剂量糖皮质激素能增加脓毒症患者体循环血管
阻力,升高平均动脉压【仉,同时可以缩短血管加压素使用的时间及休克逆转
时间’’趋’。国外的大量文献和/分析’’矧的结果证实了小剂量的
激素可能对脓毒症和脓毒症休克相对肾上腺功能不全者的症状改善、死亡率降
低有效。然而本实验发现持续给予地塞米松时,时地塞米松组大鼠的心功
能和血流动力学与给予生理盐水时组大鼠相比较并无统计学差异,表明脓
毒症晚期持续给予地塞米松并不能阻止心功能的进一步恶化,其原因可能与没
有对脓毒症给予全面支持治疗有关。
.心肌细胞凋亡及与心功能的关系
细胞凋亡是一种保守的基因调控的程序性细胞死亡,对机体有重要的生理
和病理意义,是许多疾病的发病机制之一。许多基因参与细胞凋亡过程,抗细
胞凋亡蛋白淋巴细胞瘤/白血病一?
/.,一是其
中之一。.原癌基因家族被认为是调节细胞凋亡的关键基因,与?对线
粒体膜完整性起保护作用,可能是此类蛋白抗凋亡作用的主要机制‘。家
族是个多元性的家族,表现同源性的特性,既有抑制凋亡的基因如,,
,.,又有促进凋亡的基因如,,。
目前已经得到大多数学者的公认【,心肌细胞凋亡与多种心血管疾病密切
相关,它在心脏的正常发育过程中、心律失常、动脉粥样硬化、高血压病、慢
性心功能不全、心肌梗死和缺血一再灌注损伤以及心脏移植一排斥反应等许多
心血管疾病的病理生理中起着重要作用。
心肌细胞凋亡可由不同的死亡信号介导,这些死亡信号包括有缺氧、酸中首都医科大学硕士学术论文
毒、电离辐射、机械牵引、再灌注氧化应激、病毒感染等。致心肌细胞凋亡的
信号通路可能有种【‘弧:氧化还原调节系统、细胞因子受体/.家庭、
具有激酶活性的细胞膜受体、蛋白偶联受体及磷脂酶:髓鞘磷脂酶
活化和酰基鞘氨醇形成。各种刺激可活化多条信号传导通路,各条通路间相
互
作用、相互影响。
大量研究表明炎症是动脉粥样硬化、心血管事件的病因,而且能促进心功 能不全的进展。心肌细胞凋亡是心力衰竭中不可忽视的现象,心肌细胞的丢
失
可能导致收缩功能下降,进而减低泵功能。已报道了严重心衰伴明显心 脏扩大和围产期死亡的转基因鼠镧过度表达引起细胞凋亡,提示凋亡存在于
心
力衰竭的一个短暂时期。等给大鼠注射脂多塘,发现内毒素预处理组脓毒 症大鼠心肌细胞表达明显增加,阻止了内毒素引起的心功能恶化,提高了 脓毒症大鼠的生存掣引。亦有的学者证实内毒素可导致的产生,从而 报道缺氧时
引起心肌功能下降和心肌细胞凋亡【弘’。等
?. 表达水平及蛋白质合成增多,缺氧、酸中毒共存时则
可见心肌细胞凋亡。
本试验采用免疫组化检测抗凋亡蛋白.和流式细胞仪检测凋亡的心肌细 胞数,生理盐水组在小时即出现明显的抗心肌细胞凋亡蛋白的表达,心 肌细胞凋亡数增加;小时抗心肌细胞凋亡蛋白的表达及心肌细胞凋亡数 明显增加,达到峰值;小时抗凋亡蛋白表达及心肌细胞凋亡数减少,但 仍明显高于小时。本实验还发现心功能随脓毒症时间的延长进行性恶化,而 心肌细胞凋亡数是在小时达高峰,故认为脓毒症时心功能的进行性恶化与心
肌细胞凋亡无明显相关性,与有些学者的研究相似帅’’“。
脓毒症时心功能受损的原因很多,主要有:脓毒症机体摄入减少、血
管内的液体转移进入组织间隙、血管扩张剂对毛细血管床扩张,可导致有效循
环血容量减少,严重影响心脏灌注和氧合。通过临床研究认为低血压和低
血容量是主要原因【删;冠状动脉灌注减少,微循环水平血流分布异常和氧供首都医科大学硕士学术论文
需矛盾,引起包括心脏的多器官缺血缺氧性损伤【;炎症介质和细胞因子直
接引起心肌细胞坏死【】;细菌内毒素的心脏毒性损伤?瓠】;某些
治疗措施,如过度的液体复苏、血管活性药物的应用等,亦可导致心肌细胞损
伤。等娜】认为过度应用影响心肌顺应性的治疗,会增加心肌氧耗和心
肌细胞损伤,心脏灌注压升高和室壁张力增加,也导致心肌细胞微小损伤。
缺血再灌注和氧自由基的损伤【’鹌】;脓毒症时亚型的信号转导体系
的变化‘鲰。美国大学医学中心的研究人员发现【,肾上腺素能受体
激活和儿茶酚胺释放增加是脓毒症病理生理学的重要组成部分。掣通过
脓毒症大鼠试验推测在心肌细胞内的比值再分布可能参与脓毒性休克时初
期的高动力和继之而来的低动力变化。有研究发现【矧在脓毒症早期就出现了心
肌细胞反应性的降低,蛋白基因表达水平降低,蛋白生成减少,这
种改变随着脓毒症大鼠全身炎性反应的不断进展更加严重。目前的研究认为【、
,脓毒症时心功能障碍的发生可能是多种因素综合作用的结果。
.激素对脓毒症心肌细胞凋亡的作用
糖皮质激素在体内主要与其受体特异性结合,通过基因或非基因机制发挥
作用,可以起抗炎、抗毒、抗休克、减少炎症介质、减轻损伤的作用,是早期
治疗脓毒症常用的药物。糖皮质激素对于凋亡细胞的作用非常复杂,并且不同
的组织细胞作用不同,糖皮质激素能够促进淋巴细胞的凋亡,而抑制一些组织
细胞的凋亡,如,中性粒细胞、乳房小叶上皮细胞、肝细胞,并发现可以抑制
顺铂和家族诱导的海拉癌细胞凋亡。
等发现./也
塞米松能够增加脓毒症大鼠动脉内皮细胞口一半乳糖苷酶蛋白的表达,抑制内皮
细胞凋亡,并认为糖皮质激素能够改变特异性基因的表达,从而抑制细胞凋亡。
认为地塞米松抗凋亡的作用可能因为家族抗凋亡蛋白
的表达,如.,“地塞米松通过增加糖皮质激素活性上调抗凋亡蛋白
?的表达,且刺激.表达具有时间依赖性,而.,和表达时
】等发现地塞米松抑制细胞凋亡的关键通路是地
间依赖性不明显。首都医科大学硕士学术论文
塞米松上调糖皮质激素受体,抑促分裂原活化蛋白激酶,从而抑制细胞
凋亡。目前较一致的认为.家族的表达与糖皮质激素诱导细胞凋亡的敏感性
相关。本试验证实, 时、时、小时给予地塞米松组的脓毒症大鼠心
肌细胞凋亡率明显低小时、时、小时给予生理盐水组的脓毒症大鼠,表
明地塞米松能明显抑制心肌细胞凋亡。同时发现小时、小时、时给予地
塞米松组的脓毒症大鼠心肌细胞凋亡率无明显差异,表明地塞米松对各时间点
的脓毒症大鼠心肌细胞凋亡均有明显的抑制作用。本实验还发现给予地塞米松
虽然明显减少了各时间点脓毒症大鼠的心肌细胞凋亡,且给予地寨米松组大鼠
心肌细胞凋亡数并未随时间的延长而增加,但给地塞米松组的大鼠心功能仍随
着脓毒症时间的延长而恶化,说明脓毒症时糖皮质激素虽然抑制了大鼠心肌细
胞的凋亡,但并没有阻止心功能的恶化。临床上早期使用糖皮质激素产生的治
疗作用可能与该激素的其它作用有关。
结论
脓毒症时应用糖皮质激素及抗生素早期能够改善脓毒症大鼠的心功能,但
继续应用并不能完全阻止心功能的继续恶化;
脓毒症时存在心肌细胞凋亡,以小时最明显,脓毒症时应用糖皮质激
素能够减少各个阶段心肌细胞凋亡;
脓毒症时心肌细胞凋亡不是脓毒症晚期心功能受损的主要原因;
脓毒症时应用抗生素及糖皮质激素或单纯抗生素并不能阻止脓毒症大鼠
心功能的恶化,需要积极的全面治疗。首都医科大学硕十学术论文 参考文献
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文献综述
脓毒症时细胞凋亡的研究进展 脓毒症是临床上常见的急危重症并发症,也是诱发脓毒性休克、多器官功
能障碍综合征的重要原因。细胞凋亡对机体有重要的生理和病理意义,凋亡
失
调是许多疾病的发病机制之一。本文就近年发表的相关文献中对脓毒症时各系
统器官细胞凋亡的研究进展作一简要综述。
脓毒症及细胞凋亡的相关概念
年美国胸科医师学会及危重病急救医学会共同提出脓毒症是感染或有
高度可疑感染灶引起的全身炎症反应综合征,即感染加。凡具备以下:
种临床表现中的种或种以上者,即可诊断:体温或?;
心率次,;呼吸频率次/或:白细胞
计数/或/,杆状核%。美国每年有近万脓毒症患者,每
天有近名患者死于严重脓毒症,在欧洲每年估计有万人死于脓毒症【。
我国每年约有万患者发生脓毒症
细胞凋亡是机体清除衰老或感染细胞的一种重要方式,对机体有重要的生
理和病理意义。细胞凋亡的过程受基因调控,有一系列形态学和生物化学的特
征性改变。协调、适当的细胞凋亡有助于维持机体稳态,而异常凋亡的出现则
将导致机体内环境的紊乱。
脓毒症时各系统器官的细胞凋亡
.淋巴细胞凋亡
有人提出,脓毒症状态下,机体表现为免疫抑制,如迟发超敏反应丧失、
病原清除能力下降、易继发感染等。淋巴细胞大量凋亡导致淋巴细胞数减少
是首都医科大学硕士学术论文
造成上述表现的重要因素。有研究表明,%因脓毒症死亡的患者表现为淋巴细
胞凋亡增加。 等’发现脓毒症患者迟发超敏反应丧失,循环
淋巴细胞数目降低,而且存活的淋巴细胞也处于无反应状态。等【】证
实腹膜炎患者淋巴细胞增殖和细胞因子分泌功能均受到明显抑制,而且其严重
程度与死亡率密切相关。等’’’报道死于脓毒症的患者存在明显的
低淋巴细胞血症,淋巴器官中淋巴细胞凋亡明显增加,而且凋亡的细胞以
细胞、细胞和树突细胞为主。使用凋亡抑制剂抑制淋巴细胞凋亡可明显改善机
体免疫功能,改善脓毒症患者预后,提高生存率。
.淋巴器官细胞的凋亡
研究发现,将内毒素注射至小鼠体内,胸腺皮质萎缩变薄,胸腺细胞凋亡
明显,阻断.的作用可减轻造成的胸腺细胞凋亡。对胸腺细胞表型进行
分析时发现【】,凋亡的胸腺细胞表型从以为主变为以一一为
主,且一,一和一一表型的细胞比例明显增加。脓毒症
时骨髓中发生细胞凋亡的细胞以淋巴细胞为主,骨髓细胞凋亡较晚,且骨髓细
胞凋亡增加的幅度是胸腺细胞的/.。在猪的内毒素注射模型中,脾脏淋巴滤
泡中可观察到淋巴细胞凋亡小体,证实内毒素可引起脾脏内细胞发生凋亡,但
这些改变较胸腺的程度轻【】。在小鼠盲肠结扎穿孔模型中,发现肠系膜、
肺和骨骼肌处淋巴细胞出现细胞凋亡【】,证明淋巴结也有细胞凋亡的存在。 】等在脓毒症患者死后即刻检测各脏器实质细胞的凋亡改变,发现细 胞凋亡现象仅出现在淋巴细胞和肠上皮细胞。
.中性粒细胞及单核吞噬细胞的凋亡
中性粒细胞是机体非特异性防御反应的重要执行者,是机体防御系 统的重要组成部分,在炎症的发生、发展和转归中发挥着重要作用。隰建成
等【”
用动物模型观察中性粒细胞凋亡发现:术后、和小时出现典型的 ,以术后时最高。】等发现和.能提高中性粒细胞核
和受体相关因子水平;中性粒细胞凋亡可被、.所抑制。首都医科大学硕士学
术论文
等【.在临床研究中也发现,正常人外周血中离体培养时的凋 亡率为%,而刀患者的凋亡率不足%,并在血清中发现了抗凋亡因子 的存在。
’等用人外周//分别与地塞米松和缓冲液体
外培养研究表明,激素有抑制凋亡的作用,随着激素浓度的增加,的 凋亡相应减少,并证实这一作用是通过细胞表面的糖皮质激素受体来实现
的。
于泳浩【‘在严重腹腔内感染导致脓毒症患者中发现.俚显著增加,还发现 明显高于健康人,这说明单核一巨噬细胞凋亡减弱。
脓毒症急性期,中性粒细胞凋亡受到抑制,使得中性粒细胞寿命延长,更 好地发挥抗炎功能,但在炎症局部中性粒细胞大量聚积激活,死亡的中性粒
细
胞内蛋白酶类溢出及巨噬细胞系统活化产生的大量细胞因子会引起及器官
损伤,这与脓毒症早期的功能损害明显相关。
.肺血管内皮细胞凋亡
急性呼吸功能衰竭是脓毒症患者常见的并发症,是脓毒症患者死亡的直接
原因之一。微血管通透性增高是器官功能受损的重要特征之一。血管通透性增
高,一方面使大量液体渗入组织间隙,加重组织细胞的缺氧;另一方面使炎症
细胞过多聚集于局部组织,释放蛋白酶及氧自由基等直接造成组织细胞损伤。,
有研究证实在动物模型中存在内皮细胞凋亡。内皮细胞凋亡导致内皮细胞
骨架重组,是微血管通透性增加的原因之一。急性炎症时内皮细胞是主要的靶
细胞,内皮细胞凋亡可以直接导致早期血管内皮的损伤,引起脏器微血管
损伤和中性粒细胞在实质脏器微血管床中积聚,从而导致多脏器灌注不全。多
种细胞因子.、、删毒素等在体外条件下可以诱导培养的内皮
细胞凋亡。吴荣谦【等用制作脓毒症动物模型并尾静脉注射伊文蓝的方法检
测肺微血管通透性的改变,发现微血管内皮细胞的凋亡在脓毒症晚期明显增强
并伴有.基因表达的下调。
等对绿脓杆菌感染性肺炎的大鼠模型进行研究结果显示:肺组
织细胞上抗原的表达与大鼠的生存率呈正相关;抗原的表达介导被感染的