No.4 —— 如何测定原研品的多条特征溶出曲线

【附件一】 如何测得原研品多条特征溶出曲线指导原则 —— 针对参与试验的药品检验所或生产企业 一、 原研制剂的数量 至少3~5批，其中1批至少200片，其他批可为100片。 每批含量均应在97.0%~103.0%。 二、 查询既有质量 检索该产品所有药典的质量标准、进口质量标准和相关文献（如美国FDA溶出曲线数据库：和《日本橙皮书—— 多条溶出曲线数据库》：国家新药审评中心网站 → 主页右侧“日本药品体外溶出试验信息库”）。 三、 溶出介质的配制 由于原研品在研发时，均是按照该国药典溶出介质配制法，故建议根据原研品国别，选用相应溶出介质，而不采用中国药典配制法。如既有质量标准或文献有更为针对性的介质配制法，也可参照遵循。各国药典缓冲液配制法具体如下： 1. 欧洲药典配制法 (1) pH1.0~2.2 盐酸溶液 pH值1.0：精密量取盐酸溶液9.0ml，加水稀释至1000ml，摇匀，即得。 其他pH值溶液：量取一定体积的0.2mol/L盐酸液（量取盐酸18.0ml，加水稀释至1000ml，摇匀，即得），加水稀释至200ml，摇匀，即得。 pH 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 2.1 2.2 0.2mol/L盐酸液(ml) 85.0 67.2 53.2 41.4 32.4 26.0 20.4 16.2 13.0 10.2 7.8                         (2) pH3.8~5.8 醋酸盐缓冲液 2mol/L醋酸溶液：取120.0g冰醋酸（经查，冰醋酸密度为1.049g/ml，故体积约为114ml），加水稀释至1000ml，摇匀，即得。 取下表中规定物质各量，加水溶解并稀释至1000ml，摇匀，即得。 pH 3.8 4.1 4.3 4.5 4.7 4.9 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.8 三水醋酸钠(g) 0.67 1.5 1.99 2.99 3.59 4.34 5.08 5.23 5.61 5.76 5.98 6.23 2mol/L醋酸液(ml) 22.6 19.5 17.7 14.0 11.8 9.1 6.3 5.8 4.4 3.8 3.0 2.1                           (3) pH4.5~8.0 磷酸盐缓冲液 取6.80g磷酸二氢钾，加一定体积0.2mol/L氢氧化钠液（取8.0g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1000ml，即得）和适量水溶解后，再加水稀释至1000ml，摇匀，即得。 pH 4.5 5.5 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 0.2mol/L氢氧化钠液（ml） 0 9.0 18.0 28.0 40.5 58.0 82.0 pH 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 0.2mol/L氢氧化钠液（ml） 112.0 145.5 173.5 195.5 212.0 222.5 230.5                 2．美国药典配制法 (1) pH1.0~2.2  盐酸/氯化钾溶液 pH值1.0：精密量取盐酸溶液9.0ml，加水稀释至1000ml，摇匀，即得。 其他pH值溶液：量取0.2mol/L氯化钾溶液50ml，置200ml量瓶中，加入一定体积0.2mol/L盐酸液（量取盐酸18.0ml，加水稀释至1000ml，摇匀，即得），再加水稀释至刻度，摇匀，即得。 pH 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 2.1 2.2 0.2mol/L盐酸液(ml) 85.0 67.2 53.2 41.4 32.4 26.0 20.4 16.2 13.0 10.2 7.8                         (2) pH2.2~4.0  盐酸/苯二甲酸氢钾溶液 称取2.04g苯二甲酸氢钾，加入一定体积0.2mol/L盐酸液和适量水溶解后，再加水稀释至200ml，摇匀，即得。 pH 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 0.2mol/L盐酸液(ml) 49.5 42.2 35.4 28.9 22.3 15.7 10.4 6.3 2.9 0.1                       (3) pH4.2~5.8  氢氧化钠/苯二甲酸氢钾溶液 称取2.04g苯二甲酸氢钾，加入一定体积的0.2mol/L氢氧化钠溶液和适量水溶解后，再加水稀释至200ml，摇匀，即得。 pH 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 0.2mol/L氢氧化钠液（ml） 3.0 6.6 11.1 16.5 22.6 28.8 34.1 38.8 42.3                     (4) pH4.1~5.5  醋酸盐缓冲液 <注> 通常采用该配制法。 2mol/L醋酸溶液：取120.0g冰醋酸（经查，冰醋酸密度为1.049g/ml，故体积约为114ml），加水稀释至1000ml，摇匀，即得。 取下表中规定物质各量，加水溶解并稀释至1000ml，摇匀，即得。 pH 4.1 4.3 4.5 4.7 4.9 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 三水醋酸钠(g) 1.5 1.99 2.99 3.59 4.34 5.08 5.23 5.61 5.76 5.98 2mol/L醋酸液(ml) 19.5 17.7 14.0 11.8 9.1 6.3 5.8 4.4 3.8 3.0                       (5) pH5.8~8.0  氢氧化钠/磷酸二氢钾溶液 取6.80g磷酸二氢钾，加一定体积0.2mol/L氢氧化钠液（取8.0g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1000ml，即得）和适量水溶解后，再加水稀释至1000ml，摇匀，即得。 pH     5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 0.2mol/L氢氧化钠液（ml）     18.0 28.0 40.5 58.0 82.0 pH 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 0.2mol/L氢氧化钠液（ml） 112.0 145.5 173.5 195.5 212.0 222.5 230.5                 (6) pH8.0~10.0  氢氧化钠/氯化钾/硼酸溶液 称取0.75g氯化钾与0.62g硼酸，加入一定体积的0.2mol/L氢氧化钠溶液和适量水，溶解后再加水稀释至200ml，摇匀，即得。 pH 8.0 8.2 8.4 8.6 8.8 9.0 9.2 9.4 9.6 9.8 10.0 0.2mol/L氢氧化钠液（ml） 3.9 6.0 8.6 11.8 15.8 20.8 26.4 32.1 36.9 40.6 43.7                         3．日本药典配制法 (1) pH1.2溶液：取氯化钠2.0g，加水适量使溶解，加盐酸7ml，再加水稀释至1000ml，混匀，即得。 (3) pH3.0～6.0介质：取十二水合磷酸氢二钠17.91g，加水溶解并稀释至1000mL，即得0.05mol/L的磷酸氢二钠溶液；另取一水合柠檬酸（亦称“枸橼酸”）5.25g，加水溶解并稀释至1000mL，即得0.025mol/L的柠檬酸溶液。然后用柠檬酸溶液调节磷酸氢二钠溶液，使最终pH值至目标值即可。 <注> 测定溶解度时刻采用该配制法，其后测溶出曲线时则采用醋酸盐缓冲液(pH4.0)。 (3) 0.05mol/L醋酸/醋酸钠缓冲液(pH4.0)：将0.05mol/L醋酸液-0.05mol/L醋酸钠溶液按(16.4:3.6)比例混合，即得。即：取冰醋酸3.0g，加水稀释至1000ml，用0.68%醋酸钠溶液三水合物溶液调pH值至4.0，即得。 (4) pH6.8磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钾1.7g和无水磷酸氢二钠1.775g，加水适量使溶解后，定容至1000ml，即得。 4．中国药典配制法 略。 【备注】 (1) 配制时，建议采用加热煮沸方式，尤其当使用到十二烷基硫酸钠等固体试剂表面活性剂时，以保证溶解完全。不推荐采用超声和磁力搅拌振摇等方式。 (2) 配制后测定溶液pH值，应为理论值的±0.05以内，如未果，应调节。 (3) 当需要进行模拟人体胃液与肠液进行体外溶出度试验时，“含有胃蛋白酶的模拟胃液”和“含有胰酶的模拟肠液”配制法如下： ● 含有胃蛋白酶的模拟胃液，英文全称为Simulated Gastric Fluid，简写为SGF。有时亦可附有下标“sp”，缩写为SGF[sp]。配制法：取2.0氯化钠和3.2g胃蛋白酶（标识应为每mg中含800~2500个活度单位），加7.0ml盐酸和水使溶解至1000ml，即得。该溶液pH值应为1.2。 ● 含有胰酶的模拟肠液，英文全称为Simulated Intestinal Fluid，简写为SIF。有时亦可附有下标“sp”，缩写为SIF[sp]。配制法：取磷酸二氢钾6.8g，加水250ml使溶解，加0.2mol/L氢氧化钠溶液77ml和500ml水，再加胰酶10g使溶解后，用0.2mol/L氢氧化钠溶液或0.2mol/L盐酸溶液调节pH值至6.8±0.1，再加水稀释至1000ml，即得。 四、 主成分在各溶出介质中的稳定性 1. 测定法  建议采用既有质量标准中有关物质项下或含量测定项下液相色谱条件。 2. 取原料药试验。当主药难溶于水，可采用先加少量甲醇溶解浓配后再用溶出介质稀释的办法；配制浓度均为溶出量的100%。 3. 分别测定pH1.0~1.2、4.0~4.5、6.8和水，4种介质中的溶液稳定性，建议于0、0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、4.0h、6.0h、8.0h测定（对于缓控释制剂，则应延长至24.0h）。如不稳定，根据降解速度，可在其后的“pH值-溶解度曲线”和“各条溶出曲线”检测时采用下述克服： (1) 迅即测定  即先行完成对照品检测后，再开始溶出度试验。 (2) 逐片测定  即1片1片测定，以不至于手忙脚乱。 (3) 如主成分定向降解为某固定杂质  测得该杂质峰面积与主成分峰面积的相对校正因子，样品检测时进行换算。 (4) 如主成分非定向降解、而是降解为多个杂质  采用倒测法：测定溶出杯中剩余固体颗粒中主成分残留量，随后采用已测得的（百分含量-残留量）/百分含量×100%求得溶出量。如此，虽然一条溶出曲线由数片测得，亦无妨，因为原研品片间差异较小，该误差可忽略（此种情形时，建议原研企业与办公室专家共同商议）。 五、 pH值-溶解度曲线的测定 1. 测定法  如主成分在介质中不稳定，则采用既有质量标准中有关物质项下或含量测定项下液相色谱条件。如稳定，可采用替代的液相色谱法（详见下节）。 2. 取8支具塞试管，加入过量原料药，分别精密加入5ml 1.0、2.0、……、8.0溶出介质，摇匀，密塞，置37℃水浴中振荡，直至形成过饱和溶液（如稳定、可过夜），滤过，取续滤液经液相测得准确溶解度，绘制曲线。 当出现主成分在某pH介质中极不稳定、溶解后即迅速分解，无法测定的情形，则该介质中溶解度可免做。 3. 对照品溶液根据样品溶液中峰面积的多寡、配制适当浓度。可采用甲醇浓配后，用各溶出介质稀释的方法。对于难溶性药物，对照品溶液可酌情采用纯甲醇或纯乙腈配制。 4. 进行多条溶出曲线测定时，溶出介质pH值的选择 (1) 如各溶解度均较为一致（最大值与最小值相差2倍以内），可按下述选取4种介质。 ● 对于普通制剂 (1)酸性药物制剂  pH值分别为1.0或1.2、5.5~6.5、6.8~7.5和水； (2)中性或碱性药物/包衣制剂  pH值分别为1.0或1.2、3.0~5.0、6.8和水； (3)难溶性药物制剂  pH值分别为1.0或1.2、4.0~4.5、6.8和水； (4)肠溶制剂  pH值分别为1.0或1.2、6.0、6.8和水； ● 对于缓（控）释制剂 pH值分别为1.0或1.2、3.0～5.0、6.8～7.5和水。 通常可将药物pKa值小于3.0的看作酸性药物，大于等于3.0的看作中/碱性药物（pKa值可通过文献查询获得）。 美国与欧盟通常选取1.0、4.5、6.8和水，而日本通常选取1.2、4.0、6.8和水；但对于肠溶制剂，则应将4.0和4.5更换成6.0。 对于以上范围的选择，推荐根据溶解度测定结果，选取溶解度最小的pH值进行研究。 当在某pH值介质中最终溶出量未达85%，而在其他pH    值介质中可达到，则可更换成其他pH    值介质。 当原研品使用说明书中明确标注“本品吸收易受食物影响”以及“本品必须饭后30分钟内服用”时，则应增加“模拟胃液”和“模拟肠液”2种介质中的溶出曲线比对研究。缓控释制剂必须增加“模拟肠液”的研究。 (2) 如各溶解度相差较大、甚至是数量级差异，则说明该药物为“pH值依赖型药物”，此时根据测定结果，酌情考虑细分pH至0.5，再行测定溶解度。随后针对性选取，甚至需检测5~6条曲线。 5. 不建议采用pH8.0以上的介质进行表达；如确有必要，应提供充足理由。FDA公布的溶出度数据库中，仅有“阿维A胶囊”采用pH9.6溶出介质的特例，盖因在1.0~8.0介质中，溶解度甚低、溶出量甚少的缘故。 六、 测定法 推荐采用液相色谱法，即便既有质量标准为紫外法。 如主成分在各溶出介质中稳定性良好，建议对既有色谱条件进行优化，以提高检测效率。可采用以下措施予以实现。 以上无论采用何法，对于方法学验证，仅需进行线性试验（溶出量10%~120%）和精密度试验（溶出量10%和120%即可）。 1. 调节流动相、缩短保留时间 为加快测定，可将既有质量标准中的流动相中有机相比例提高。如此，虽有杂质与主成分未能分离的担忧，但考虑到样品已被稀释900倍，在此条件下，存在的微量杂质响应值已微乎其微，即便有所体现，其影响对于溶出结果而言亦在误差范围之内，故忽略不计。 2. 升高柱温或加大流量或采用短色谱柱 升高柱温至40~50℃。一般的反相色谱柱最高承受温度可达80℃，在60℃以下试验毫无问题。 流量可根据柱压限制提高至1.5~2.0ml/min、以加快测定进程。 采用3~5cm长的短色谱柱，应是最事半功倍、节能增效的作法。 3. 调整进样量 对于小规格制剂，进样量可根据对照品溶液（浓度为释放量的10%时）精密度予以灵活调节至100μl~500μl。对于大规格制剂，为防止超载，可采用5μl。 4. 改变检测波长 对于小规格制剂，当采用最大吸收和加大进样量仍无法满足精密度检测要求时，可采用吸收更强的末端吸收波长。 对于大规格制剂，在几近全部溶出时，由于浓度过大，会出现色谱柱超载或检测器超载而导致峰形不佳之情形，此时可通过改变波长使峰面积变小、从而令色谱峰峰面积的精密度满足要求。 5. 使用超高速液相 如采用超高速液相测定，效率自然更高，推荐尝试。 6. 液相软件编程 对于大批量样品的数据处理，建议充分利用仪器自带的软件功能，绝不建议将每一个峰面积输入Excel软件计算这种费时费力的方式。现今市场上的主流品牌色谱仪皆已具有数据批量处理功能和打印功能（多张图谱结果打印在一张纸上），将这些功能掌握后一次性编辑好模板，便可大大提高工作效率。（参与药检所可向各液相公司请教，或请各公司的软件工程师统一为各药检所进行培训） 【备注】 对于目前各省级药检所已较为普及的光纤溶出仪，只要验证了辅料无干扰、测定结果准确可靠，也大力推荐使用。 七、 测定时的注意事项 1. 溶出仪性能应满足测定要求。溶出篮篮孔应无堵塞和破损。桨板厚度均应在4.0±0.2mm范围内（采用游标卡尺测定）。1个溶出杯中仅能投入1片。 2. 投片方式  如为人工投样，桨板法测定，可采用错时投样方式，如每隔30秒投入1片，如此便可做到平行操作、从容不迫。 3. 密切关注滤膜吸附问题  建议采用1个滤头、1个针筒即可。预先抽取一定体积溶出液（10~20ml），滤过，滤液沿杯壁轻轻注回溶出杯中，从而使主成分在滤膜上的吸附饱和。其后抽取1.5~2.0ml样品，滤过，取滤液测定即可。 4. 对于难溶性、小规格、原料药已进行了微粉化处理的制剂（规格一般不超过10mg），建议取出后无需过滤，直接置于液相小瓶中、放置0.5h即可进样测定。因为在取样点位置处，吸取的溶出液携带出样品颗粒的可能性极小，即便有少量存在（一般为辅料颗粒），静置后使其沉淀，也不会影响到测定，更不会堵塞色谱柱。起到“一举多得、事半功倍”之效。 5. 由于每次仅取1.5~2.0ml，损失的体积可忽略不计，故其后溶出量无需累积计算。 6. 如经验证，溶出介质脱气与否不会影响测定结果，可酌情考虑，尤其在进行桨板法试验时。 7. 测定数量  用于比较的均值应不得少于6片测得，其他进行摸索的时间点可为3片。 8. 对照品溶液配制法：建议采用甲醇溶解浓配后，再用各溶出介质稀释的方法。只要最终溶液中甲醇体积不超过2.0%(v/v)，则无需验证。配制浓度应为溶出量的50%~60%，以兼顾样品高低浓度，尽可能缩小外标一点法测定误差。 9. 不同来源的水可能会因pH值的不同，导致对pH值敏感的药物溶出行为差异显著，建议每次测定新来源水的pH值，以确保试验的稳定性。 八、 多条特征溶出曲线的测定 1. 装置、转速和溶液体积 根据既有质量标准，对于片剂，通常采用桨板法；对于胶囊剂，通常采用转篮法，也可采用桨板法或是加沉降篮的桨板法。对于不易采用篮法（如样品发生堵塞篮孔或样品塌陷于篮底或粘附于篮顶）、且易漂浮于液面等的制剂，可考虑采用桨法+沉降蓝；对于溶出过程中长时间粘附于杯壁某处、导致溶出数据精密度不佳的情形，也可考虑采用桨法+沉降篮。绝不推荐采用自制沉降装置。 转速统一采用50转，系因患者中的绝大多数——中老年人群体内蠕动强度与其相当。 体积统一采用大杯法、900ml。不建议采用小杯法，即便既有质量标准采用，因该法为我国特有，采用该法测得的原研品溶出曲线可能是错误表达。 2. 溶出曲线的测定 (1) 关于测定时间点和结束时间点的设定 对于测定时间点，普通制剂与肠溶制剂可分别为5、10、15、20、30、45、60、90、120分钟，此后每隔1小时测定；缓/控释制剂可为15、30、45、60、90、120分钟，3、4、5、6、8、10、12、24小时。 对于结束时间点，在酸性介质(pH1.0~3.0)中最长测定时间为2小时；在其他各pH值介质中普通制剂与肠溶制剂均为6小时，缓/控释制剂为24小时。但当连续两点溶出率均达85%、且差值在5%以内时（所谓的“平台期”），试验则可提前结束。 如出现溶出饱和现象，即至某溶出量后始终不再增加，此时应连续测得的3个时间点溶出量差值应不超过3.0%，试验也可提前结束。 3. 试验参数的放宽 在某溶出介质中，当结束时间点溶出量仍未达85%时，则可酌情放宽溶出度试验参数。此时建议先不增加转速、而采用添加表面活性剂（如吐温-80或SDS或SLS；采用级，市场主流品牌，并应标注厂家以便日后重复）方式，添加浓度可从0.01％(w/v)起点、按1、2、5级别依次递增，最大至3.0%。如仍未果，建议酌情增加转速至最高100转。 如原研品在某介质中溶出数据精密度不佳时，则可采用增加转速至75或100转，直至精密度符合规定 绝不允许添加有机溶剂、因为这将严重背离体内外相关性原则，同时大大降低区分效应。 【备注】 (1) 溶出数据精密度要求  用于f2因子计算的时间点中，第一个时间点的RSD不得过20.0%，其后时间点的RSD不得过10.0%（注意而非所有测定时间点）。 (2) 先取原研品1批，完成以上测定确得多条特征溶出曲线后，再测定其他2批。每批样品在规定取样时间点测得的溶出度数据精密度应符合规定，3批均值的最大差值不得过10%（批间均一性规定），随后以3批均值(n=18)作为该时间点的“标准溶出量”。如在某介质中3批样品均值的最大差值超出10%，说明原研品在该介质中的溶出度行为波动较大（但不可能在各介质中均如此），此时建议增加测定至5批确定各时间点溶出度数据波动范围，仿制品落在该范围内即可判定两者溶出行为一致。 (3) 延迟释放  当原研品具有延迟释放现象时（即前5~20分钟溶出量小于10%，其后溶出量迅速提升），此时仿制品也应具有延迟释放，两者平均延迟时间（溶出量为5%的时间点）相差应在5分钟以内。溶出曲线比较时各自减去平均延迟时间后再行比较。 (4) 剂量倾泻试验  ● 对于速释制剂  从以上各溶出介质中确定一最具区分力的介质（通常为溶出最慢的介质），采用100转测定原研品溶出曲线（或添加一定浓度的表面活性剂），仿制品在该条件下的溶出曲线应与原研品一致。 ● 对于缓控释制剂  分别在100转和200转条件下测定pH6.8释放曲线，仿制品在该两条件下的溶出曲线应与原研品一致。 九、 溶出曲线比较 1. 当原研制剂15分钟溶出量达85%以上时（前提50转） 仿制制剂15分钟平均溶出率也达85%以上，且6片中仅能有1片小于85%。 无需采用f1和f2因子比较；也无需关注5、10、20、30分钟溶出量，但需测定。 2. 当原研制剂在15~30分钟内溶出量达85%以上时 采用f2因子比较，比较5或10、15、30分钟3个时间点。（根据溶出量等分原则选择5或10min时间点） 3. 当原研制剂在30分钟后达85%以上时 采用f1和f2因子比较。 f1计算公式                应介于0~15.0 f2计算公式 应大于50.0       Rt和Tt分别表示两制剂在第n个取样点的平均累积溶出率。 计算f2因子时的时间点选择： ● 溶出量在85%以上的时间点仅能选取1个。 ● 由于该因子计算结果有依赖于比较时间点个数的特性，故普通速释制剂只能选取3~4个、缓控释制剂只能选取3~5个时间点，否则结果会错误偏高。 ● 时间点的选择建议尽可能以溶出量等分为原则。 4. 针对肠溶制剂的酸性介质 原研品与仿制品在2小时的释放量均应小于10.0%。 5. 针对缓控释制剂的酸性介质 原研品与仿制品在各时间点的释放量差值均应不大于±8.0%。 【备注】 (1) f1和f2因子Excel计算模板详见附件，计算时直接带入即可。 (2) 当某介质溶出度试验条件放宽至桨板法100转、加入3.0%表面活性剂时，最终溶出量仍未达85%时，不再放宽，确定3~4个比较时间点后，两者在每时间点溶出量差值应在±8.0%以内。 (3) 最终应确定出该原研品以下多条特征溶出/释放曲线 ● 普通速释制剂和肠溶制剂 (1) 至少4条溶出曲线（低转速） (2) 剂量倾泻试验（100转、酌情加表面活性剂） (3) 酌情进行模拟胃液与模拟肠液的研究（转速酌情确定） ● 缓控释制剂 (1) 至少4条溶出曲线（低转速） (2) 剂量倾泻试验（100转和200转、酌情加表面活性剂） (3) 模拟肠液的研究（转速酌情确定） 之所以要求仿制品进行与原研品以上多条溶出曲线/释放曲线的比较，盖因此次仿制药品质一致性工作主要是采用“体外一致、进而推导至体内一致”的方式进行，故着重加强了体外溶出曲线比较的全面性与多样性。 一十、 测定仿制品（企业自行完成，药检所抽查复核） 仿制制剂含量均应在96.0~104.0%。 用于计算f2因子的时间点溶出度数据精密度如不符合规定，仍需继续进行研究（批内均一性规定）。 根据以上详尽规定，企业自行测定自身产品的多批号多条溶出曲线，每批逐一与原研品曲线进行比较，多条曲线均应一致；且每批样品在规定取样时间点的均值差值最大不得过10%（批间均一性规定）。 计算可采用编制好的Excel模板。 上海药检所  谢沐风撰写 2012年7月