聚六亚甲基双胍对中国对虾受精卵和无节幼体的影响及其杀菌效果研究

聚六亚甲基双胍对中国对虾受精卵和无节幼体的影响及其杀菌效果研究 聚六亚甲基双胍对中国对虾受精卵和无节 幼体的影响及其杀菌效果研究 第27卷第5期 2006年10月 海洋水产研究 MARINEFISHERIESRESEARCH Vo1.27.NO.5 Oct.,2006 聚六亚甲基双胍对中国对虾受精卵和无节幼体的 影响及其杀菌效果研究 秦志华李健刘淇 (中国海洋大学生命科学与技术学部,青岛266003) (.中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛266071) 摘要用PHMB(聚六亚甲基双胍)对中国对虾(FPPr0户P口P"schinensis)受精卵和无节幼体进 行消毒处理,并与二氯异氰尿酸钠进行比较.结果显示,用PHMB对中国对虾受精卵消毒,其对孵化 率无显着影响(P<O.05)的浓度为?16×10,l/L;用PHMB对中国对虾无节幼体消毒,对变态率 无显着影响(P<O.05)的浓度为?4×lO,/A/L;并且其药效保持时间较长.杀菌实验,PHMB 能够杀灭副溶血弧菌和鳗弧菌.根据本试验的结果,使用(2,3)×10一l/L的PHMB对中国对虾 受精卵和无节幼体进行消毒处理是有效可行的. 关键词中国对虾受精卵无节幼体消毒聚六亚甲基双胍 中图分类号X171.5;S945.46文献识别码A文章编号1000—7075(2006)05—0039—05 Effectsofpolyhexamethylenebiguanide(PHMB)onzygoteand naupliiofFrDp口chinensisandgermicidalefficacy QINZhi—hua'LIJianLIUQi (OceanUniversityofChina,Qingdao266003) (YellowSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Qingdao266071) ABSTRACTTheeffectofpolyhexamethylenebiguanide(PHMB)andSodiumdichloroisocya— nurate(DCCNa)onzygoteandnaupliiofFeer0ene5chinensiswasstudied.Theresults showthatwhenthePHMBis?16×10一 ul/L,thehatchingrateofzygoteisnoaffected:when thePHMBiS?4×10一ul/L,themetamorphosingrateofnaupliiiSnoaffected.Besides,the actionofPHMBkeepslongincomparisonwithDCCN.Therefore,wesuggestthatthezygote andnaupliiofFeer0ene5chinensiswasdisinfectedwith(2,3)×10一u1/LofPHMB. KEYWoRDSFeer0ene5chinensisZygoteNaupliiDisinfectant Polyhexamethylenebiguanide(PHMB) 在对虾苗种生产过程中,对受精卵和育苗水体进行消毒处理,对于提高受精卵的孵 化率和幼体的成活率是 国家863计划项目(2004AA603320),国家科技攻关计划项目(2004BA526B02)和国 家科技基础条件平台项目(2004DEA70880)共同资助 *通讯作者.E—mailtliiian@ysfri.ac.CD.,Tel:(0532)85830183 收稿日期:2005—12-01;接受日期:2006—01—10 作者简介;秦志华(1979一),女,在读硕士研究生,主要从事水产动物营养免疫学研 究 40海洋水产研究第27卷 非常重要的,也是预防由于病原体垂直传播所导致的对虾疾病的有效方法之一. 面活性剂类消毒剂由于其独特的结构和性能,近几年在消毒领域发展速度很快 (张文福2004).本实 验选用的聚六亚甲基双胍(Polyhexamethylenebiguanide简称PHMB)属于阳离子表面活性剂,无色无味,完 全溶于水,性质稳定,其杀菌机制与含氯消毒剂不同,杀菌过程中不发生强氧化反应,细胞内产生沉淀作用,同 时细胞内磷的数量上升,从而阻碍细胞壁与核酸的合成;降低细胞膜的渗透性,停止磷向细胞外分泌,并能凝结 蛋白质(Khunkittieta1.1999;Wallace2003).该消毒剂在医药行业应用广泛,David(1995)报道其作为漱 口水时,对革兰氏阴性菌杀灭性很强.基于PHMB的以上优点,本文采用药浴方式研究PHMB对中国对虾受 精卵和无节幼体的毒性及其杀菌效果,以为生产性应用提供参考数据. 1材料和方法 1.1实验材料 实验用消毒剂有克大克(液体,有效成分PHMB含量为25,青岛克大克有限公司提供)和二氯异氰尿酸 钠(固体,含有效氯为58,乳山市兽药有限公司提供). 1.2实验方法 1.2.1消毒剂对受精卵孵化率的影响 用无菌生理盐水将上述两种消毒剂配成一定浓度的母液,移取母液于400ml烧杯中(内装200ml海水), 使其达到实验所需的浓度,实验设对照组和3个平行.实验过程中不充气,不换水. 1.2.1.1短时间药浴对受精卵孵化率的影响 以不同浓度消毒剂溶液分别浸浴受精卵1O,2O,30min,用100目筛绢网滤掉消毒剂溶液,然后用过滤海 水充分冲洗,去除残留的消毒剂,放入烧杯中孵化,每个烧杯放入3O粒,48h后对孵化出的无节幼体进行计数. 1.2.1.2长时间药浴对受精卵孵化率的影响 以不同浓度消毒剂溶液分别浸浴受精卵48h,每个烧杯中放入3O粒,48h后对孵化出的无节幼体进行 计数. 1.2.2消毒剂对无节幼体变态率的影响 挑选健康活泼趋光性好的无节幼体放入不同浓度的消毒剂溶液中,每个烧杯中放入2O尾,72h后计数已 变态的蚤状幼体. 1.2.3消毒剂对致病性弧茵的杀灭作用 将菌种活化后配制成菌悬液(10.CFU/ml,麦氏比浊法).移取菌悬液于200ml灭菌海水中,使其终浓度 为10CFU/ml;将消毒剂母液加入烧杯中,使其达到实验所需浓度,1,3,24h时取样并稀释,吸取稀释后的 溶液100l,按平板菌落计数法接种在2216E培养基上,置于恒温培养箱中(28?),48h后计数. l_2.4消毒剂放置一定时间后杀菌率的变化 将消毒剂配制成相同浓度的溶液,不加盖,放置2,5,8d后按照平板菌落计数法测定其杀菌率的变化. 1.2.5数据处理 实验数据以3个平行组数据的平均值表示,用SPSS软件进行处理. 2实验结果 由表1可以看出,PHMB对受精卵孵化率无显着影响(P<O.05)的浓度为?16×lOl/L,二氯异氰尿 酸钠对受精卵孵化率无显着影响(P<O.05)的浓度为?2×10t~g/ml,在使用低浓度PHMB的情况下(4× 10一l/L以下)受精卵的孵化率要比对照组的孵化率高;PHMB对无节幼体变态率无显着影响(P<0.05)的 浓度为?4×10一l/L,二氯异氰尿酸钠对无节幼体变态率无显着影响(P<O.05)的浓度为<1×10一g/ml. 第5期秦志华等:聚六亚甲基双胍对中国对虾受精卵和无节幼体的影响及其杀菌效果研究41 表1长时间药浴对中国对虾受精卵孵化率和无节幼体变态率的影响 Table1EffectoflongimmergingindisinfectantonzygoteandnaupliiofFenneropenaeuschin ensis *代表与对照组比较差异显着 由表2可以看出,用PHMB将受精卵浸泡消毒10,20,30min,在500×10,l/L以下浓度时对受精卵 的孵化率无显着影响(P<0.05). 表2PHMB短时间药浴对中国对虾受精卵孵化率的影响() Table2EffectofshortimmerginginPHMBonzygoteofFenneropenaeuschinensis() 由表3可以看出,PHMB和二氯异氰尿酸钠均能对两种致病性弧菌产生显着的杀灭作用.其中,用2× 10,l/L的PHMB对幼体期间常见致病菌——副溶血弧菌作用3h杀灭率为97.56%,作用24h的杀灭率 为96.65,用12×10,ul/L的PHMB对鳗弧菌作用3h,杀灭率为80.68%,作用24h的杀灭率为100Z. 表3PHMB和二氯异氰尿酸钠对两种弧蕾的杀灭作用 Table3SterilizationtotwostrainsofpathogenicbacteriasofPHMBandDCCNa 聚六亚甲基双胍(PHMB)杀菌率()Sterilizationrate二氯异氰尿酸钠(DCCNa)杀菌率()Sterilizationrflte 浓度(tA/L)作用时间(h)浓度(t~g/m1)作用时间(h) C0ncentrati0n1324C0ncentrati0n1324 42海洋水产研究第27卷 由图l可以看出两种消毒剂放置2,5,8d后, 二氯异氰尿酸钠的杀菌率下降很快,而PHMB相对 稳定. 3讨论 3.1PHMB杀菌效果 Q 120 一 薹100i 80 糌焉60 量40.?0 图1PHMB和DCCNa存放2,5,8d后杀菌率的变化 为了满足实际生产中对养殖动物疾病的防治需 Fig.1VaiationofsteillatiorateofPHMBand 求,人们常选用各种消毒剂对养殖水体进行消毒处DCCNft.toredf.t.,fi,,.d.ightdy 理.而化学消毒剂的种类很多,其作用机理也各不相 同,对于各种致病微生物的杀灭作用也有所不同,要取得显着的疗效就必须选择正确的药剂种类,还必须选用 合适的药剂浓度. 含氯消毒剂是一类广谱高效的消毒剂,对细菌,真菌,病毒,原生动物有较强的杀灭作用,是水产上广泛应 用的一类消毒剂,在防止以水为媒介的传染病流行方面起了重要作用.但是含氯消毒剂有效氯含量低且不稳 定,易失效,对水产动物具有强烈的刺激性.现已证明,含氯消毒剂在水环境中的主要次生产物为三氯甲烷,这 种次生产物具有一定的致畸变作用(胡庚东等2000),近年来已引起国内外学者的广泛关注.为了保证人类 的健康,国际社会已纷纷推出有关的替代型消毒方式. PHMB在医药行业应用已达1O年之久,David(1995)曾报道使用5O,100vg/mlPHMB可明显减少口腔 上皮细胞白念珠菌(Candidaalbicans)芽生孢子的数量,并使不含芽生孢子的口腔上皮细胞数量上升.Rosin 等(2001)报道,PHMB用在漱口水方面可以有效杀灭口腔细菌.Cazzzniga等(2002)报道用PHMB处理包扎 伤口的纱布可以防止假单胞菌的感染.现在PHMB的应用范围越来越广,在食品行 业和环境消毒方面也有应 用,Kusnetsov等(1997)报道使用PHMB对游泳池进行消毒可以防止嗜肺军团菌(Legionella)的感染.Mes— sick等(1999)报道在食品工业用PHMB处理固体表面可以防治真菌的污染.Payne等(1996)报道用PHMB 处理纺织品可以长久的去除异味.且以上研究均未见报道对人体造成危害,但在水产方面的应用还未见报道. 因此本文对此种消毒剂和二氯异氰尿酸钠做了几方面的比较实验. 3.2消毒实验 消毒实验表明,用一定浓度的PHMB对受精卵进行长时问消毒,其孵化率比对照组高,可能是因为消毒剂 杀灭了水体中和受精卵表面的病原菌从而使受精卵的孵化率提高有关系.这与潘鲁青(1997)报道的使用一定 浓度的漂粉精或碘伏对中国对虾受精卵消毒后,幼体成活率高于对照组的结果相符;而且受精卵和无节幼体对 消毒剂的耐受力不同,受精卵的耐受力比无节幼体强;并且消毒剂的毒性效应随浓度的增加和时间的延长明显 增强,受精卵的孵化率和无节幼体的变态率下降,死亡率增加;而在相同时间,相同浓度下PHMB对受精卵和 无节幼体的毒性要比二氯异氰尿酸钠小. 3.3杀菌实验 通过PHMB和二氯异氰尿酸钠对几种对虾常见致病菌的杀灭作用的比较发现,随着消毒剂浓度的增加, 其各自灭菌效果都逐渐增强,但是两种消毒剂对致病菌的杀灭能力不同,其灭菌效果随浓度增加而增加的幅度 不同,随时间的延长而增加的幅度也不同,对不同的致病菌的杀灭作用不同.在试验过程中还发现,对病原菌 达到相同的杀灭程度,PHMB的使用浓度要比二氯异氢尿酸钠高出许多.但是,随着消毒时间的延长,PHMB 能保持比较好的灭菌效果,二氯异氰尿酸钠却有所下降,原因可能是其性质不稳定,有效氯在水中有所衰减所 致.裘丹红等(2001)测试了二氯异氰尿酸钠在自来水中的衰减情况,结果表明,有效氯含量为15.45, 8.03,6.76的二氯异氰尿酸钠不加盖闭光保存10d后有效氯平均下降率分别为42.51,23.47, 28.60.与本试验所做的结果相符合.而PHMB相对稳定,药效保持时间较长.在David(1995)的研究中 第5期秦志华等:聚六亚甲基双胍对中国对虾受精卵和无节幼体的影响及其杀菌效果研究43 发现PHMB能在口腔龋齿中保留数小时也证明了这一点. 弄清消毒剂在水中的衰减规律,对于其在养殖生产中正确,安全的使用具有重要的指导意义.并且菌液浓 度对消毒剂消毒效果的影响也很大,在相同消毒时间,相同消毒浓度,而被消毒菌液浓度不同时,其消毒效果有 很大差异,菌数越少,其消毒效果越明显(陈来洪等1995).另外,实验中未使用中和剂,残留消毒剂也可 能对实验结果造成影响. 3.4结论 本次实验结果表明,适宜浓度的PHMB可用于中国对虾受精卵和无节幼体的消毒,既可以一定程度地杀 灭水体中的致病性弧菌,又不会对受精卵和无节幼体的孵化率和变态率产生显着的影响.关于PHMB对真 菌,原生动物及各种病毒的杀灭效果,还有待于进一步研究. 参考文献 陈来洪,阎林海,李云辉.1995.对8种消毒药物杀菌效果的比较试验.辽宁畜牧兽,2:2O,21 医 张文福.2004.表面活性剂在消毒领域中的应用.日用化学工业,34(2):1O8,110 胡庚东,吴伟.2000.含氯消毒剂在水环境中的次生产物及其致突变性研究.湛江海 洋大学,20(3):45,49 裘丹红,袁文平.2001.消毒灵使用与贮存过程中杀菌率及有效氯含量变化的比较. 中国卫生检验杂志,11(1):88,89 潘鲁青.1997.几种消毒剂对中国对虾受精卵和无节幼体的影响研究.海洋科 学,1:7,9 Cazzaniga,A.,Serralta,V.,Davis,S.,Orr,R.,Eaglstein,W.,andMertz,P.M.2002.Theeffectofanantimicrobialgauzedressingimpregnated with0.2-percentpolyhexamethylenebiguanideasflbarriertopreventPseudomonasaeruginosawoundinvasion.Wounds,14:169,176 David,S.J.1995.Preliminaryinvestigationsconcerningtheanti— adherencepropertiesofpolyhexamethylenebiguanide.InternationalJournalof Pharmaceutics,117:123,126 Khunkitti,W.,Hann,A.C.,Lloyd,D.,Furr,J.R.,andRussell,A.D.1999.X— raymicroanalysisofchlorineandphosphoruscontentinbigua— nide-treatedAcanthamoebacastellanii.J.App1.Microbio1.86:453,459 Kusnetsov,J.M.,Tulkki,A.I.,Ahonen,H.E.,andMartikainen,P.J.1997.Efficacyofthreepreventionstrategiesagainstlegionellaincooling watersystems.J.App1.Microbio1.82:763,768 Messick,C.R.,Pendland,S.L.,Moshirfar,M.,Fiscella,R.G.,Losnedahl,K.J.,Schriever,C.A.,andSchreckenberger,P.C.1999.InvitrotiC- tivityofpolyhexamethylenebiguanide(PHMB)againstfungalisolatesassociatedwithinfectivekeratitis.J.Antimicrob.Chemother,44:297, 298 Payne,J.D.,andKudner,D.W.1996.Adurableantiodorfinishforcottontextiles.Text.Chem.Color,28:28,3O Rosin,M.,Welk,A.,Bernhardt,0.,Ruhnau,M.,Pitten,F.A.,Kocher,T.,andKramer,A.2001.Effectofflpolyhexamethylenebiguanide mouthrinseonbacterialcountsandplaque.J.Clin.Periodonto1.28:1121,1126 Wallace,H.M.2003.Polyaminesandtheirroleinhumandisease-anintroduction.Biochem.S oc.Trans.31:354,355