含HIV 一1 gpl20 基因的重组腺相关病毒和重组腺病毒疫苗联合免疫

含HIV 一1 gpl20 基因的重组腺相关病毒和重组腺病毒疫苗联合免疫 ?,,,? 主堡塞堕塑～堕壅堑耋堂苤查～～丝堡～～旦筮～～鲞箜兰塑 堡～,～～墅』垦翌鱼～垫～,翌～～望竺～坐～竺～～坚～～些～～～堕～:～ (论著( 含,，,一, ,,,,,基因的重组腺相关病毒 和重组腺病毒疫苗联合免疫的研究 冯霞 余双庆 陈国敏 吴小兵 左建民 董温平 周玲 曾毅 【摘要】 目的探讨含,，,(, ,,,,,基因的重组腺相关病毒(,,,,)和重组腺病毒(,,,,)疫苗在,,,,，;小鼠中联合免疫的效果。方法 将密码子优化的,，,—, ,,,,,基因分别插入腺相关病毒(,,,)和腺病毒(,,,)载体质粒，构建含该基因的,,,,和,,,,载体疫苗。将两种疫苗以不同的联合方式免疫,,,,，;小鼠，,,,,检测小鼠血清中的,,,,,特异性抗体，细胞内细胞因子染色法检测小鼠 的特异性细胞毒性,淋巴细胞(;,,,)应答。结果两种重组病毒均可达目的基因印,,,;在小鼠体 内两种重组病毒联合免疫可诱导特异性的;,,应答和,清，,,抗体反应，但用,,,,初免,次，再用,,,,加强,次所诱发的;,，，,和血清，,,反应最强。结论,,,,和,,,,疫苗联合免疫可在小鼠体内诱导特异性的;,,应答和血清，异,抗体反应。 【主题词】,?一,;艾滋病疫苗;细小病毒科;腺病毒科，，,,,,, ,,,,,;, ,, ,,;,,,,,,,,, ,,,,,,,霸,;,,,,, ,,,坞咖，,，，,, ,,,, ，，,;嗍,,,,,, ,,,,,、，,,,琏,,;;,，，,;伽,,,,,,,砌,,,印,,, 删,皿口，,,跏?，学口,愕，,掰?,阶械，,，聊她狰,,愕，,?(，缸,(,汛， ,,增耽,,,垤，,日,,肠辔，,,?, ,(,,,口疗础, ,，锄,,,,疏惭琳口以肼,，船,姗如, ,,, ,括,?,;,眦,,,口以肌啦眦面几，珊,嬲, ;,,叫钉胍鲫, ;,眦,,,口，,, ,孵眦如,，,彬昭,,,,,,，,,,,, 【,,蜘糟;,】,时,;断, ,,咖,,出, ,,,岫, ,雠,, ,, ,,;,,,,,,,, ,,,,,(曲,,;,,,,, ,,,,(,,,,);,,,,,,, ,,,, ,,;,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,(,,,,),,;;,,, ,, ,,,,，; ,,;,(,,,，,,, ,,, ;,,,,(,,,,,,,, ,，,一,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,吨,,,;,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,;,,, ,,,,,,,,,,(,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,;;,,,, ,,,, ;,,,,,;,,,(,,，卫，; ,,;, ,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,，， ,从,粕, ,,,, ,,;;,,,, ,, ,,?宅,,,,,,,,,,,,,,,,, ,;,,,,(,, ，,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,;,,, ,, ,,,, ,,, ,孔,,,,,,,, ,,, ,,,,;,,, ,, ,,,,,;,,,,,,,;,,,,,,, ,,,,, ,,,,,(,,,山, ,,,,, ,,,, ,,, ,,,, ,,;;,,, ;,,,, ,,,,,,,印,,, ,,,,;,,,, ,,;,删,,, ,汕,,,, ,, ,,,, ,，, ,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,, ,, ,,,, ,，,, ,,, ,, ,,,;,,,, ,，，, ,,,,,,,,, ,,,,, ,,,;,; ,,，’，, ,,, ，,,,,,,,,,, ,,,,,,,,(,伽;，耐伽 ,,,, ,,;,嘶,,, ,,,,, ,,, , ,,, ,,,,,,, ,汕,,,, ;,,,, ,,,;,, ,,,;,,,; ,,，,,,,,,,,, ,,,, ，,, ,，,,,,,,,( 【,,, ,,陆】 ,，,一,; ,，,, ,,;;,,,,; ,唧,,,,,,,,; ,,,,,,,,,,,, 实验证明，多种不同疫苗的联合应用，发挥各自 以及何种免疫可诱导较好的免疫反应。的优势，可以达到单一形式的疫苗难以达到的效果。 ,材料和方法在这些载体中，腺相关病毒(,,,)免疫原性低，可在体内持续表达目的基因，而腺病毒(,,,)可在短期 ,(,载体和试剂 ,,,载体系统由本元正阳基因内大量表达目的基因，将它们联合应用，可能获得理 有限公司提供，,,,,,,—,系统(包括,,,穿梭质粒想的免疫效果。我们将优化的,,,,,基因插入,,, ,,,,,,,,—;,,、骨架质粒,,,,,,,(,和大肠埃希菌,,和,,,载体，构建了两种重组疫苗，即重组腺相关 ,,,,)为美国约翰霍普金斯大学,,(,, ,,馈赠。淋病毒(,,,,)和重组腺病毒(,,,,)，并在,,,,,;小 巴细胞分离液购自瑞典,,,硼,;,,公司。,,标记大鼠体内初步探讨了,,,,和,,,,联合免疫的效果 鼠抗小鼠;,,,单克隆抗体(,,(,)和,，,;标记大鼠 抗小鼠，,,(,单克隆抗体购自美国,, ,,,?，,,,,,公 基金项目:中国综合性艾滋病研究项目(,，豫,);国家,,,计划 司;羊抗人,,,,,多抗购于华美生物公司，,,,标记项目(,,,,,,,,,,,,) 兔抗羊和羊抗小鼠，,,均购于中山生物技术有限 作者单位:,,,,,,北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控 公司。制所肿瘤病毒与艾滋病研究室;冯霞和余双庆对本文贡献等同 万方数据 主堡塞堕塑堕压疸垂堂壁查～,坚生～～旦釜～～鲞箜～塑 鱼～,璺皇些』曼翌曼～也～,翌～～旦～～～丝坚～,坚～～生～～～盟～:,,(, ,，,(, ,,,,,基因密码子优化及合成见文献 ,(,(, 抗一,,,,, ，,,抗体的检测:纯化的,，,一, 〔,〕。 ,,,,,抗原(本室制备)以碳酸盐包被液稀释至,弘,,,(, 多肽合成 ,,,,, ,,区多肽,，,,,,,,,由博 ，，,,，每孔,,,出包被微孔板。,,,标记的羊抗小鼠亚生物技术有限公司合成。 ，,,作为二抗，血清样品以,倍系列稀释，间接,(,实验动物 雌性,,,,,;小鼠，,,,周龄，购 ,,,,法测定抗体滴度。 自中国医学科学院实验动物所。 ,(,(,细胞免疫反应的检测:采用细胞内染色法检,(, ,,,,载体疫苗的构建将,,,,表达载体质 测,，,一, ,,,,,特异性细胞毒性,淋巴细胞(;,,)反粒,,,,,(,,, ,,,,,送交本元正阳基因有限公司， 应。最后一次免疫后,周，处死小鼠，分离脾淋巴细由其包装并纯化,,,,，滴度为,×,,,, ,(,，，，,,。 胞，取,×,,,小鼠淋巴细胞以,,肛,,，，,, ,,区多肽于,(, ,,,,载体疫苗的构建将密码子优化的,亚 ,,?，,,;,,培养箱中刺激培养，, ,后加入蛋白质型中国流行株;,,,,,的,,,,,基因插入穿梭质粒， 运输抑制物布雷非尔德菌素,(,,,,,,,,, ,，,肛,,，，,,)再与,,,骨架质粒,,,,,,,(,共转化,(;,如,, 处理，继续培养, ,。,,标记的大鼠抗小鼠,,,,,,,,，获得重组子。经限制性内切酶酶切鉴定，阳性 (,,(,)单抗室温避光染色, ,;,,多聚甲醛室温固质粒命名为,,,—,,,(,,,,,。以托; ，线性化,,,( 定,, ,,,,;,(,,,皂素室温穿膜,, ，， ,,,。,,’,标记,,,(,;,,,,后转染,,,细胞获得,,,,。连续传代 的大鼠抗小鼠，,,(,单抗室温避光染色, ,。,,,,,,次即可获得高滴度的重组病毒。采用,,，,?方 洗涤,次后以,,,灶, ,,,重悬，上流式细胞仪，计数法测定病毒滴度。 ,,,和，,,(丫双阳性的,淋巴细胞。,(,重组病毒的鉴定 , 结果,(,(, 重组病毒中,,,,,基因表达的鉴定:以,,， ,,,的,,,,和野生型,,一,感染,,,细胞，, ,后收 ,(,重组病毒的鉴定集完全病变的细胞，用,,,,,, ,,,,检测蛋白的表 ,(,(, ,,,,,, ,,,,检测,,,,,蛋白的表达:收集达。将,,,,按,,，为,×,,,转染,,,细胞，并按 ,,(,和,,,,以及,,,,感染的,,,细胞，以蛋白裂,,，,,加入辅助病毒野生型,,,增加其表达，转染 解液裂解后，经,,,(,,,,电泳、转膜。用兔抗羊后,, ,收获细胞，用,,,,,, ,,,,检测蛋白的表达。 ,,,,,多抗作为一抗，,,,标记的羊抗人，,,作为二,(,(,重组病毒颗粒的电镜观察:取,,,”, ,,,, 抗，检测印,,,蛋白的表达。,,,,和,,,,感染的悬液和,,倍稀释后的,,,,，分别负染后电子显微 ,,,细胞可见明显的,,,×,,,的条带(图,)，说明两镜下观察病毒颗粒。 种重组病毒均可表达目的基因,,,,,。,(,动物免疫及免疫反应的检测,(,(,动物免疫:,,只雌性,,,,,;小鼠，,(,周龄，体重约,,,,, ,，随机分为,组，每组,只。将两种疫苗,,,,和,,,,以不同的联合方式免疫小鼠。以,,,将,,,,稀释至,×,,?,(,,,,,,，,,,,稀释至,×,,, ,,,,，，,,，双侧胫前肌内注射，每侧各,, ,，具体免疫程序见表,。 表, ,,,,和,,,,联合免疫程序 ,,,(, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,;,,,,,,, ,, ,,,,锄, ,,,, ,:,,,,感染的,,,细胞;,:,,(,感染的,,,细胞; ,:正常,,,细胞;,:,,,,感染的,,,细胞 图, ,,,,，,, ,,,,检测重组病毒中印,,,蛋白的表达 ,:,,, ;,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,;,:,,, ;,,, ,，如;,,, ,,,,， ,,,,; ,:,,,,,, ,,, ;,?,;,:,,, ;,,,, ,，,,,,,, ,汕,,,, ,,(, ,,,,,, ,,,,锄,,,,,, ,, ,,,嘟,,仰,,印,,, ,, ,,;,,,,,蚰, ,,,,,,, 万方数据 主堡塞堕塑堕盎堑童堂苤查～～塑至～～旦篁～～鲞箜～塑垦～,些些』垦翌鱼～垫～,翌～～旦～～～～坚～～～坚～～～～～～～堕～:,,(,(,电子显微镜下观察重组病毒颗粒:取,,,“, ,(,(,特异性血清，,,抗体检测结果:,,,,检测,,,,悬液，负染后电子显微镜下可观察到直径约 结果显示，在第,和,,周时，仅第,组可检测到特,, ,,,具有典型,,,特征的病毒颗粒(图,)。,,,, 异性的血清，,,抗体，滴度均为,:,,，其他各组均检负染后电镜下可见大量大小均一的病毒颗粒，以完 测不到特异性抗体反应，说明用,,,,初免,次，再整的实心颗粒为主，少量空心颗粒(中间为黑色)为 用,,,,加强,次所诱发的抗体反应较强，与;,,反病毒的空壳形式(图,)，表明纯化后的,,,,为高纯 应结果相一致。细胞及体液免疫反应结果见表,。度病毒。 表,不同免疫方式在,,,,，;小鼠中 诱发的细胞及体液免疫反应 ,,,(, ,,, ,,,,,,,, ,，,, ,,,,, ,,,;,,,; ,, ,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,; ,,;, ,,,，和，,,,,双阳性的 烈篙銎,嬲麓,警印，舞妇体 啪,, ,;,,,，,,, ，,,吖，, ;,,,,(,) 商,, ,品;,,,; ，,, ,:重组腺病毒;,:重组腺相关病毒 图, ,,,,和,,,,的电镜观察(×,, ,,,;×,,, ,,,) ,:,,,,;,:,,,, 注:“一”代表阴性 ,,,,:“(”:,,辨,,, ,,,(, ,,,;呐, ,,;,,酗,,, ,, ,,,, ,，,, ,,,, ,讨论,(,免疫小鼠中免疫反应的检测,(,(,细胞免疫反应的检测:用胞内细胞因子染色 研究表明，细胞介导的免疫反应在,，,(,的控法检测小鼠脾淋巴细胞中;,,和，,,(丫双阳性的细 制中起着重要作用，特异性;,,在病毒生活史的初 期就可以靶向杀伤感染细胞，同时可产生，,,(,和胞，并经过流式细胞仪计数，检测,,,,,特异性的;,,应答，结果见图,。第,组和第,组的;,,应答 ,,,(,等细胞因子，从而抑制病毒在宿主细胞内的明显强于第,组，第,组的;,,应答与第,组差异 复制。如何诱导特异、有效的,,,应答就成了,，,无显著意义。该结果说明，采用,,,,初免，,,,,加 疫苗研究的重点。,，,大约有,,,种抗原蛋白，如强的免疫方案可诱发较强的特异性;,,应答，并且 果没有初次免疫，由于优势免疫原的存在，它可能无用,,,,初免,次，再用,,,,加强,次所诱发的 法诱导针对插入蛋白的应答,趺饪赡苁梗韵赴悖裕谭从Ρ龋颍粒粒殖趺猓贝危颍粒洌旨忧浚创蔚拿庖?中，以保证同样的应答可以被随后的重组病毒免疫方案高出,倍。 所加强怛,。在小鼠和恒河猴中的试验表明，用含有 , , ,,,,,,, ,(,, ,,,,,,, ,(,, ,,,,,,, ,(,, ,,,,, ,(,, ,,,,, ,(,, ,,,,, ,(,, , , 。, 一 , 基 ,(, ,(, ?: 茔 , , .