人牙龈上皮细胞上清液对牙髓细胞增殖及分化影响的研究

人牙龈上皮细胞上清液对牙髓细胞增殖及分化影响的研究 ?,,,,,,分类号:,,,, 密级:一般,,, ,,,(,,, 编号:,,,,,,,,,, 荔蕤黪 硕士学位论文 人牙龈上皮细胞上清液对牙髓细胞 增殖及分化影响的研究 学位申请人: :(奎叠塑 导，，,姓名及职称: 壅塑鏊墼塑 专业名称: ～壁垦堂 ,,,,年,月,,日 人牙龈上皮细胞上清液对牙髓细胞增殖及分化影响的研究 人牙龈上皮细胞上清液对牙髓细胞 增殖及分化影响的研究 学科专业: 口腔医学 研究生:李晓娜 导 师:凌均柴教授 摘要目的:本研究拟在体外分别培养人牙髓细胞(,,,,, ,,,,,, ,,,, ;,,,,，,,,,,)和人牙龈上皮细胞(,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ;,,,,，,,,,,)，研究,,,,,上清液对,,,,,增殖及分化的影响，探讨在体外建立,,,,,和,,,,,共培养模型的,,丁行性，为组织再生牙的研究提供实验基础。和方法:?用组织块法进行,,,,,的原代培养，细胞铺满瓶底,,,时传代。倒置显微镜下进行形态学观察，取第,代,,,,,细胞直接计数法测定,,,,,生长曲线，用,,,,法进行波形丝蛋，刍(,,,,,,,,)和角蛋白(;,,,,,,,,,,，,,)的免疫组化染色，进行细胞来源鉴定。?用改良组织块法和酶消化法进行,,,,,的原代培养，待细胞铺满瓶底,,,时，进行细胞传代，倒置显微镜下进行形态学观察。耿第,代,,,,,用细胞直接计数法测定生长曲线，用,,,,法进行,,,,,角蛋白(;,)染色，以,,,,,做阴性对照。?收集不同增殖阶段的,,,,,的上清液，均以不同浓度作用于,,,,,，用,,,法测定,,,,,增殖情况，通过测定细胞裂解液中,,,水平研究对,,,,,分化的影响:原代,,,,,消化后以,×,,,,,,的密度接种于培养瓶中，每瓶,,,，隔几换液，收集培养第,、,、,,的,,,,,上清液，(,,?保存。取第,代,,,,,，以,×,,,,,,的密度接种于,, ,,板中，每孔,,, , ,，培养,,,后，吸去原培养基。实验组为将培养第,、,、,,的,,,,,上清液分别以占总体积,,,、,,,、,,,的比例(即,, , ,、,,, ,、,,,, ,)加入,,孑,板孔内，并加,,,,,培养基,,(,,,至每孑,,,,,,,;对照组为将,,,,,培养基(,—,,,)以占总体积,,,、,,,、,,,的 人才龈上皮细胞上清液对牙髓细胞增殖及分化影响的研究比例(即,,,,、,, ,,、,,,,,)加入,,孔板孔内，并加,,,,,培养基,(,,,至每孔,,,,, ,;空白对照组为每孔加入,,, , ,的,,,,,培养基,,一,,,。每组,个孔，共,,组，,,。,、,,,,,培养内静置培养。第,,取,块,,孔板通过,,,法研究对,,,,,增殖的影响;第,,取,块,, ,,板通过对培养后,,,,,细胞裂解液中,,,测定，研究对,,,,,分化的影响。结果:?,,,,,在,,,,,后长出，呈梭形，核仁清晰，一般于,,,,,,长满瓶底;,,,,,传代后第,,细胞数量有所下降，第,,,,进入对数增殖刿，第,,进入生长饱和期后细胞的数量也有所下降;,,,,,免疫组化染色显示波形丝蛋白为阳性，,,染色阴性，证实为成纤维细胞;,,,,,增殖能力较好，并可见钙化结节形成。?,,,,,在倒置显微镜下呈多角形，核大，长满后呈铺路石样;细胞生长曲线呈“滞缓一对数生长(平台”的“,”形模式;,,免疫组化染色为阳性，牙髓成纤维细胞对照为阴性，证实为上皮细胞。?相对于空白对照组(即;【(,,,组)，加入上皮细胞培养基(,(,,,)和体外培养 第,,(处于潜伏期，未进入增殖期)的,,,,,上清液对,,,,,的增殖和分化均呈抑制作用，而加入体外培养第,,和第,,(均处于对数增,乏期),,,,,的,清液对,,,,,的增殖和分化均有促进作用，并呈时间一剂量依赖关系:相对阴性对照组(即,—,,,组)，加入第,,、第,,及第,,的,,,,,上清液后,,,,,的增殖和分化程度均上升。结论:?采用组织块法成功建立了,,,,,的体外培养模型;?体外培养出的,,,,,具有较强的向成牙本质细胞分化的能力，能分泌形成类牙本质样的钙化结节，证实牙髓组织中存在有分化潜能的牙髓干细胞(,,,,,);?采用改良组织块法和酶消化法均可成功培养出,,,,,;?采用,,,,,,, ，，冷消化法结合无血清培养基培养，可有效抑带，〕,,,,,体外培养过程中成纤维细胞的污染，获得纯化的,,,,,，培养出的细胞在形态学和免疫学方面均符合上皮细胞的特征，能在较长时问内保持上皮细胞的特性;?体外培养的,,,,,的上清液对,,,,,的增殖和分化均有促进作用，并呈时间一剂量依赖关系，证实,,,,,分泌的町溶性因子町促进,,,,,的增殖和分化，提示在体外建立,,,;,和,,,;,共培养模型是可行的。关键词:牙髓细胞 牙髓干细胞 牙龈上皮细胞 上清液 增殖 分化 共培养 人牙龈上皮细胞上清液对牙髓细胞增殖及分化影响的研究 ,,, ,,,,, ,, ,,,,;,, ,, ,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ;,,,, ;,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,,,,, ,,,, ;,,,, ,,,,,,,,,,,,;,,,,:,, ;,,,,,, ,,,,, ,,,,,, ,,,, ;,,,,(,,,,,),,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,, ;,,,,(,,,,,),,,,,,,,,, ,, ,,,,,，,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,;,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ;,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,，,,,,,;, ,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,, ,,, ;,;,,,,,, ,,,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,(,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,:?,,,,, ,,,, ;,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,—,,,,,,, ,,;,,,？,,(,,,, ,,,,, ;,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,, ,, ;,,,,,, ,,,,,,(,,, ;,,,,,,,, ;,,,, ,,,,,,,,;,,, ,, ,(,,,,,,,,,, ,,, ,(,,,,,,,(,,,, ,,, ,,,,,,,,, ;,,,, ,,,, ,,,,,,,,(,,,,,,,, ,,,,,,,,,, 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,—,,,培养基 ,,, 胎牛血清 ,,, ,,,,, ,,, ,,,,,, 转每分钟 ,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,;,,,,, 转化生长因子, ,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, 骨形成蛋白 ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,, ,,;,,, 表皮生,,大,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, 碱性磷酸酶 ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,;,,, 成纤维生,冈， ，,, ，,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,;,,, 胰岛素样生长因子 ,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,, ,,;,,, 血管表皮生,丈冈子 ,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,, ,,;,,, 血小板衍生生长因子 ,，, ,,,,,,,, 波形丝蚩白 人牙龈上皮细胞上清液对牙髓细胞增殖及分化影响的研究,, 角蛋白,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,, 二甲基硫氧化物,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,;,,,; ,;,, 乙一胺四乙酸 四甲基偶氮唑蓝 一,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,?,,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,, 酶联免疫吸附实验 ,, 人爿,龈上皮细胞上清液对牙髓细胞增殖及分化影响的研究 刖 吾 近十年来组织工程学取得了长足的进展，目前已有组织工程化的骨、软骨、皮肤、血管等多种人工组织问世„,,,,牙齿是人体重要的器官，几乎每个人在一生中都会面临龋齿、牙周病以及外伤所致的牙齿损伤和缺失问题，因此通过组织工程技术获得牙齿再生具有重大的科研和临床意义„,,。 细胞、组织的增殖、分化乃至器官和个体的生长发育，都是不同类型的细胞相互作用的结果，牙齿发育就是一个上皮与问充质相互诱导、相互作用的生物学过程。在牙胚发育的早期，局部的,〕腔上皮增厚形成牙源性上皮，并向深层结缔组织内延伸，在固定区域提供成牙信息，诱导其周围的外胚间充质细胞向牙源性间充质细胞分化。在牙源性卜皮的诱导下，牙源性削充质进一步分化形成牙本质和牙髓，而牙源性上皮也在牙源性间充质的诱导下发育为成釉器并形成釉质〔,, ,在牙胚发育和创伤引起的牙髓细胞(,,,,,, ,,,, ;,,,,，,,,,)增殖分化过程中，均存在多种细胞以及多种生长因子之问的协同作用，揭示它们之问的相互作用关系，是了解牙髓组织和细胞功能的重要途径,,,。 同一类型或不同类型的细胞通过直接接触和(或)可溶性因子的旁分泌等方式保持细胞间通讯，这种细胞间通讯是维持正常器官、组织及细胞结构和功能的重要环节。种子细胞、生物支架和牛长因子微环境是组织工程的三大要素“”，其最终目的是模拟体内的细胞生长微环境，再造人工组织或器官，而其中生长因子微环境的体外模拟最为困难，细胞共培养(;,;,,,,,,)技术是近年来用于在体外模拟细胞生长微环境以及研究细胞,、日,相互作用重要方法“。,,,。 ,,,,, 目前共培养技术在口腔医学研究领域已得到一定的应用〔, , ,,,,,,等?,,将人上皮根鞘细胞和间充质细胞进行共培养，结果发现细胞问及细胞基质问的相互作用在根部牙本质的形成中发挥重要作用;,,,,,等“”用兔切牙根尖区上皮细胞和,,,,在体外构建成共培养模式，发现上皮细胞能够促进,,,,的碱性磷酸酶(,,,)表达，并推测这种作用可能是由上皮细胞分泌某种细胞因子完成的;周彬等…,采用体外套皿共培养的方法对牙周韧带细胞(,,,,,,,,,,, , ,,,,,,, ;,,,，,,,,)和骨髓基质来源的成骨样细胞(,,,,,,,,,, ,,,, ;,,,，,,)进行共培养，发现在共培养体系中,,,,和成骨样细胞存在相互作用，两者的分化趋势受到相互 人牙龈上皮细胞上清液对牙髓细胞增殖及分化影响的研究诱导:魏听等?,,将口腔粘膜上皮细胞和成纤维细胞进行复合培养，成功制备出 口腔粘膜的体外模型。 人牙龈上皮细胞(,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ;,,,,，,,,,,)与牙齿发育过程中的牙源性上皮在组织胚胎学上具有同源性。在胚胎第,周，覆盖在原口腔的上皮在未来的牙槽突区增生，形成原发性上皮带，上皮带向深层生长，分裂为颊(唇)侧的前庭板和舌(腭)侧的牙板，前庭板表面上皮变性形成口腔前庭沟，而牙板最末端的细胞增生发育成牙胚。,,,,,属于口腔的被覆上皮，来自外胚层，在胍胎发育过程中由原广,腔的上皮发育而来，,,,,。 近年来，大量研究证实口腔粘膜上皮细胞能分泌和表达多种细胞因子。,,,,,,等„,,,通过免疫组化检测到在人正常牙龈上皮的基底细胞和棘细胞中均有表皮生长因子(,,,)及其受体(,,,,)的表达，并认为,,,和,,,,能够刺激上皮细胞增殖，在牙周病发展过程中上皮的根方迁移中起作用。,,等吨,,发现转化生长因子,(,,,—,)及其受体在牙龈上皮和结合上皮中均有表达，在牙周损伤的修复过程中，牙龈上皮通过自分泌或旁分泌的方式产生的,,,(,作用于上皮自身，抑制牙龈上皮的增殖迁移而促进结合上皮对牙面的再附着。,,,,,等 „,?在失败种植体周围的龈沟液中以及大鼠试验性牙龈炎的牙龈上皮和结合上皮中均发现血小板源生长囡子(,,,,)的高度表达，并认为牙龈卜皮或结合上皮是炎症时,,,,的来源。,,,,,,等瞳,,用酶联免疫吸附实验(,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,，,,，,,)在人牙龈上皮培养物中检测出高水平表达的血管表皮生长因子(,,,,)、转化生长因子一旺(,,,(,,,,,)和表皮生长因子(,,,)，并发现,,,,,体外培养过程中释放的这些细胞因子有促进创口愈合的作用。郭树中等,,,发现角质细胞的上清液，能够抑制瘢痕成纤维细胞的增殖，作者推测在创口愈合过程中，表皮细胞在发生接触抑制的同时，能够分泌一种细胞抑制因子作用于真皮层的成纤维细胞，抑制成纤维细胞的增殖。 一般来说，正常的体细胞几乎不表达端粒酶活性，只有在造血干细胞、生殖细胞等增殖旺盛细胞中才可检测到端粒酶活性。但廖建兴等旺,,报道正常口腔粘膜上皮细胞中存在端粒酶活性表达，且呈弱阳性，作者由此推测其活性?,,,,与口腔粘膜上皮中存在有增殖活性的干细胞有关。牙髓中存在牙髓干细胞(,,,,,, ,,,,,,,, ;,,,,，,,,,,)已得到公认?,,,,，结合以上研究结果，有学者设想眈,,采用 人牙龈上皮细胞上清液对牙髓细胞增殖及分化影响的研究体外细胞培养技术分别培养取自人腭部的上皮干细胞及从骨髓或拔除的第三磨牙的牙髓组织中获得的问充质干细胞，在适当的时机将上皮和问充质干细胞构建成共培养模式，以诱导分化形成牙胚，待牙胚发育至钟状期晚期时将其移植至颌骨缺牙处，牙胚可在继续发育并萌出(示意图见图,)。假如这种设想能够实现，那么将对实现人牙齿组织工程化产生划时代的意义。 基于以,论述，笔者推测:可由取材容易的,,,,,取代不易获得的牙源性上皮细胞，在体外与人牙髓细胞(,,,,, ,,,,,, ,,,, ;,,,,，,,,,,)构建共培养模型，用该模型模拟人牙齿发育过程中上皮和问充质，剞的相互作用， 进行人牙齿发育机制的研究，并推测可用,,,,,和,,,,,作为种子细胞进行组织工程牙再生的研究。 为此，本研究作为系列研究的一部分，在体外分别培养了,,,,,和,,,,,，收集体外培养的处于不同增殖阶段的,,,,,的卜清液，按一定比例加入,,,,,培养基中，观察,,,,,分泌的可溶性因子对,,,,,增殖及分化的影响，以探讨在体外构建,,,,,和,,,,,的共培养模型的可行性。 人牙龈上皮细胞上清液对牙髓细胞增殖及分化影响的研究 第,章人牙髓细胞(,,,,,)的原代培养 牙髓是位于牙齿硬组织中的疏松结缔组织，含有多种细胞成分，主要有成牙本质细胞、成纤维细胞和未分化的间充质细胞,,,,。牙髓组织承担着牙齿的营养、代谢、感觉和修复等重要的生理功能，因此关于牙髓细胞(,,,,)增殖分化的研究具有重要意义。 牙齿是人体的重要器官，几乎每个人在一生中都会面临龋齿、牙周病以及外伤所导致的牙齿损伤和缺失问题，而近年来发展迅速的干细胞技术和组织工程技术有望使牙齿再生成为现实。自从,,,,,,,,等旺,,在,,,,年首次提出牙髓组织中存在牙髓干细胞(,, ;,,,,，,,,,,)的观点以来，关于,,,,,,, ,,,, ,,,, ,,的研究方兴未艾，大多数学者认为,,,,,其实就是牙髓组织中未分化的外胚问充质细胞〔,,,,,, ,由于,,,,,具有多向分化的潜能，可能仍具有牙乳头的性质，如果将其与牙源性上皮组合，在?定的环境中，模拟牙胚发育过程中上皮与问充质的相互诱导过程，有可能诱导形成牙胚。假如这种设想能够实现，那么将对实现人牙齿组织工程化产生划时代的意义。但由于目前尚未发现,,,,,特异性的标志物，实现,,,,,的分离和纯化曰日订还有较大的困难。 人牙髓细胞(,,,,,)体外培养体系是目前研究,,,,,增殖和分化的主要体外模型〔,,, ,由于人牙髓组织量少、细胞活性低，因而其比其他组织更难进行原代培养,,,,,目前牙髓体外培养方法主要有组织块法和酶解法两种，本研究采用组织块法?,、,,,，成功建立了,,,,,的体外培养体系，通过观察,,,,,的增殖分化来探讨,,,,,在其中的作用，并为,,,,,和,,,,,共培养的后续研究提供种予细胞。,(,材料与方法,(,(,(,材料来源 , 人牙龈上皮细胞上清液对牙髓细胞增殖及分化影响的研究 年龄在,,岁以下的健康个体，因阻生或证畸需要拔出的健康、完整的前磨牙或第三磨牙。,(,(,(,细胞培养试剂及其它试剂 旺一,,,培养基 ,,,;,，,,, 胎牛血清(,,,) 杭州四季青生物材料有限公司 ,—,,,,, ,,,,,，,,, ,,, 博士德生物工程有限公司 ，型胶原酶 ,,,,,，,,, ,(,,,胰蛋白酶，,(,,,,,,, ,,,;,，,,, 波形丝蛋白单克隆抗体 武汉博士德生物工程有限公司 ，型胶原单克隆抗体 武汉博士德生物工程有限公司 即用型,,,,试剂盒 武汉博士德生物工程有限公司 青链霉素双抗 ,,,,,，,,,,(,(,(,主要仪器 .