原发性高尿酸血症血清差异蛋白质研究

原发性高尿酸血症血清差异蛋白质研究 双向电泳-质谱技术寻找原发性高尿酸血症血清差异蛋白质 * 11 112于飞 赵建梅陈兆云 李巍 姚华 ,新疆医科大学第一附属医院1.医学检验中心,2.党委～新疆～乌鲁木齐～830011, 摘要: 目的 建立正常人和高尿酸血症人群双向电泳图谱，寻找高尿酸血症血清 差异蛋白，进一步探索其发病机制。 采用双向凝胶电泳(2-dimentional gel electrophoresis,2-DE)和基质辅助激光解吸飞行时间质谱(matrix –assisted laser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spetrometry,MALDI-TOF-MS)对高尿酸血症人群和对照组人群血清进行差异蛋白 质研究，寻找高尿酸血症血清差异蛋白。 结果 差异达蛋白质点数为10个， 质谱成功鉴定出4个差异蛋白质，其中补体C3、触珠蛋白、α1-抗胰蛋白酶呈 上调表达，载脂蛋白L1呈下调表达。 结论 初步发现补体C3、触珠蛋白、α 1-抗胰蛋白酶、载脂蛋白L1在高尿酸血症组和正常对照组人群血清中存在差异， 但结果有待运用其他生物学的方法进行验证并探索其机制。 关键词:高尿酸血症;血清;蛋白质组学;双向电泳 Study of differentially expressed serun proteins in primary hyperuricemia by 2-DE and MALDI-TOF-MS 11112YU Fei, MA Ling, CHEN Zhao-yun, LI Wei, YAO Hua (1.Department of clinical laboratory;2.Party Committee,First Affiliated Hospital,Xinjiang Medical University, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830011, China) Abstract: Objective To find the different serum-associated proteins of hyperuricemia(HUA) by using two-dimensional gel electrophoresis for understanding the pathogenesis of HUA. Methods 2-DE and matrix–assisted laser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spetrometry(MALDI-TOF-MS) were used to screen differential expressed serum proteins among hyperuricemia population and control group. Results Gel-image analysis revealed that there were 10 differential protein spots. A total of 4 differential protein spots were successfully identified by MALDI-TOF-MS. complement 3, haptoglobin, α1-antitrypsin were up-regulated and apolipoprotein L1 was down-regulated as compared with control Conclusion complement 3, haptoglobin, α1-antitrypsin and apolipoprotein L1 are differentially expressed in the hyperuricemia group,and the result should be validated by other biochemical technologies. Keywords:hyperuricemia;serum;proteomics;two-dimensional electrophoresis 1 基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金青年基金(2012211B33) *通信作者:yaohua01@sina.com 高尿酸血症( hyperuricemia，HUA)是以体内嘌呤代谢紊乱、尿酸(uric acid，UA)生成增加及(或)尿酸排泄减少，使得尿酸在体内沉积为特征的疾病，严重时可造成病理生理的改变，引发痛风和尿酸性肾病等。国内外大量流行病学研究表明，随着人们生活水平的提高，高尿酸血症的发病率日渐增高。近年来研究发现，高尿酸血症可引起胰岛素抵抗，加速血管病变和糖耐量异常的发生和发展，与高血压、动脉粥样硬化、冠心病、血脂血糖代谢紊乱、肥胖和胰岛素抵抗等代谢综 [1-5]合症疾病密切相关。但直至现在，原发性高尿酸血症的发病机制仍然不完全清楚。近年来蛋白质组学技术的飞速发展为研究疾病发病机制和探索早期诊断(筛检)的生物标记物提供了新的思路和技术平台。本研究采用双向凝胶电泳(2-dimentional gel electrophoresis,2-DE)和基质辅助激光解吸飞行时间质谱(matrix –assisted laser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spe trometry,MALDI-TOF-MS)技术对高尿酸血症人群和对照组人群血清进行差异蛋白质研究，初步建立高尿酸血症血清差异蛋白表达谱，以期为进一步研究高尿酸血症的发病机制提供依据。 对象与方法 一、对象 根据我国血尿酸调查结果确定纳入标准:男性>417μmol/L(7.0g/L),女性>357μmol/L(6.0g/L)，年龄控制在20-70岁之间。排除妊娠期妇女、药物、肾功能不全、血液病、恶性肿瘤等对血尿酸的影响，同时排除伴发糖尿病、高血脂等代谢综合症及重大传染病，在新疆医科大学第一附属医院的体检、门诊及住院者中选择单纯高尿酸血症患者15例为病例组;选择同期就诊的年龄、性别、地域等相匹配健康体检者15例为正常对照组。本研究获得我院医学伦理委员会批准并取得受试对象的知情同意。 二、方法 1 材料:固相PH梯度(immobilized PH gradient,IPG)干胶条, PH3-10两性电解质购自美国Bio-Rad公司，3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺胺(CHAPS)，二硫苏糖醇(DTT)，碘乙酰胺(IAA)为美国Sigma公司产品，碳酸氢铵，α-氰基-4-羟桂酸(CHCA)购自Fluka公司，乙氰(ACN)购自Fisher公司，测序级胰蛋白酶(trypsin)购自Promega公司。其他试剂为国产分析纯试剂。去高丰度 2 基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金青年基金(2012211B33) *通信作者:yaohua01@sina.com 蛋白柱ProteoExtract Albumin/IgG Removal购自Calbiochem公司。所用仪器及软件:Multiphor ?多功能电泳系统(美国Amersham公司)，PowerLook 2100XL扫描仪(美国UMAX)，Protean ? Xi cell大型垂直电泳槽(美国Bio-Rad公司)，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(4700 Proteomics Analyzer)，4000 Series software软件，GPS Explorer? v3.5胶分析软件(Applied Biosystems,USA) 2血清采集及预处理:空腹抽取肘静脉血5ml于无菌洁净试管中，4?静置2小时，3000rpm/min离心10分钟，取血清分装， -80?低温冰箱保存。为减少不同个体间差异，使混合样本在最大程度上反映组内不同个体的共性，故采用混合 [6-8]血清的策略。样品充分解冻后将每组15份血清(无脂血，溶血，黄疸，浑浊)分别取50μl充分混合，6000rpm 4? 离心10min后取上清60微升用稀释缓冲液稀释10倍，将稀释后的液体过柱去除白蛋白、球蛋白，收集流出液，加5倍体积的TCA-丙酮溶液，-20?过夜沉淀后 12000rpm ，4? 离心30min,去上清,加90%丙酮，12000rpm ,4? 离心30min,去上清，重复一次，室温晾干沉淀。 加适量裂解液回溶，bradford法测量浓度,-80? 保存。 [9]3 双向电泳:参照Amersham双向电泳手册和Gorg方法进行,考马斯亮蓝染色。每组混合血清重复电泳3次，以保证实验的稳定性。 4 图像分析:染色凝胶采用凝胶成像仪扫描，再用PDQuest7.3胶分析软件进行图像的强度校正、点、背景消减、均一化和匹配分析。蛋白的相对表达量用扫描积分光密度值来表示，并进行组间比较，t检验分析结果。 5 质谱分析和生物信息学分析:酶解后的样品用ABI4700 Proteomics Analyzer进行质谱分析(激光源为355nm波长的Nd:YAG激光器，采用正离子反射和自动获取数据的模式采集数据)。一级激光强度3900，二级激光强度4300，肽质量指纹(peptide mass fingerprinting,PMF)扫描范围为700-4000。所得结果用GPS(Applied Biosystem,USA)进行数据库检索。检索参数设置:数据库为美国国家生物技术信息中心(national center for biotecbnology information，NCBI)非冗余(nr)数据库，种属为Human,，肽片段分子质量容许误差(Precursor tol):?0.1 Da，二级片段容许误差(MS/MS tol):?0.5 Da，酶解片段不完全(missed cleavages):1，固定修饰(fixed modifications):脲甲基半胱氨酸(carbamidomethyl)，可变修饰(variable modifications):氧化(oxidation)。在数据库检索时胰酶自降解峰和污染 3 基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金青年基金(2012211B33) *通信作者:yaohua01@sina.com 物的峰都手工剔除。登陆NCBI的protein网站，寻找相关蛋白质的资料，分析其与高尿酸血症的可能关系。 结 果 一、双向凝胶电泳和图像分析结果: 经PDQuest7.3胶分析软件进行图像的强度校正、点检测、背景消减、均一化和匹配分析，2组血清的2-DE胶和master胶的匹配率为89%和87%，对照组平均斑点数为287个，病例组平均为304个，根据p<0.05为差异表达作为标准共检测出10个差异点，其中4个主要的差异区域见图1。 a b c d 图1 4个蛋白点在高尿酸血症患者(a-b)和健康人血清(c-d)双向凝胶电泳图中的表达差异 a. 2203号蛋白点对应的α1-抗胰蛋白酶在高尿酸血症患者中的表达;b. 5102、7206分别对应的触珠蛋白和补体C3在高尿酸血症患者中的表达c.2203号蛋白点对应的α1-抗胰蛋白酶在健康人中的表达;;d. 5102、5203、7206分别对应的触珠蛋白、载脂蛋白L1和补体C3在健康人中的表达; Figure 1 2- DE profiles of serum samples. a. α1-antitrypsin(2203)expressed in HUA 4 基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金青年基金(2012211B33) *通信作者:yaohua01@sina.com group;b. haptoglobin(5102)、complement 3(7206) expressed in HUA group ;c. α1-antitrypsin(2203)expressed in control group;d. haptoglobin(5102)，Apolipoprotein L 1(5203)complement 3(7206) expressed in control group; 二、差异蛋白点的质谱分析及搜库结果 对差异蛋白点进行酶解，质谱分析后用GPS软件在NCBI nr(非冗余)数据库中搜索鉴定出4种蛋白质。其中在高尿酸血症组中，补体C3、触珠蛋白、α1-抗胰蛋白酶呈上调表达，载脂蛋白L1呈下调表达，差异均有统计学意义 )。蛋白质谱数据库搜索鉴定结果见表1。 (p<0.05 表1 高尿酸血症血清中4个差异蛋白点的质谱鉴定和数据库搜索结果 Table 1. Differentially expressed proteins identified by MALDI-TOF PMF in the serum of HUA and normal healthy controls 序号 蛋白质名称 蛋白检索号(GI) 序列覆盖率(%)理论分子量 理论等电点 表达情况 1 补体C3 78101267 16 71317.15 6.82 ? 2 触珠蛋白 4826762 21 45860.82 6.13 ? 3 α1-抗胰蛋白酶 50363217 32 46878.08 5.37 ? 4 载脂蛋白L1 21735616 19 46003.90 5.93 ? 讨 论 高尿酸血症是多基因遗传性疾病,尽管目前已对其发病机制进行了较深入的研究,得出了部分结论,但仍有许多问题有待于解决。本研究以高尿酸血症为研究对象，应用高通量的蛋白质组工作站和生物信息学相结合，初步建立了高尿酸血症的血清蛋白质表达谱，初步鉴别出了4种差异表达蛋白质。 补体C3(complement 3) 是 1912 年 Ritg 用蛇毒处理血清时发现的，是补体系统的核心。它是启动补体活化旁路途径并参与其级联反应的关键分子,还被 [10-12]认为可能是高血压、高血脂、胰岛素抵抗、肥胖与动脉粥样硬化之间的桥梁 。 [13]刘红梅等人研究发现在不同糖代谢状态人群中,随着糖代谢紊乱的加重血清C3和超敏C反应蛋白(hs-CRP)水平均逐渐升高,C3与胰岛素抵抗指数 5 基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金青年基金(2012211B33) *通信作者:yaohua01@sina.com [14](HOMA2-IR)的相关性均较hs-CRP更为密切。Herndndez-M 等对 316 例西班牙肥胖人群的研究发现，C3 水平升高与BMI 增加显著相关，在随着高血压、 [15]糖尿病、血脂异常等代谢危险因素个数的增加，C3 水平显著增加。Onat A等对 1 220例土耳其中年人群的研究发现在校正了MS 的 5 个组分后，血清 C3 水平仍强烈预测 MS 发病，提示补体C3 是代谢综合征的一个独立危险因子。近年来研究认为高尿酸血症是代谢综合症的重要组成部分，与代谢综合征其他疾病相互影响。本研究中高尿酸血症组的补体C3呈上调表达，与其在代谢综合征疾病中的表达水平一致，但目前关于补体C3是否参与及如何参与高尿酸血症的发病机制知之甚少，需要今后进一步研究。 触珠蛋白(haptoglobin,Hp) 是一种急性时相反应蛋白，其主要功能是通过与游离血红蛋白(heamoglobin，Hb)结合形成 Hp-Hb 复合物，并很快被单核 - 巨噬细胞系统介导的清道夫受体 CD163 清除掉，防止 Hb 对组织的氧化损伤，阻止 Hb 从肾小球滤过，避免 Hb 对肾小管的损害。Hp 具有抗氧化活性、抗炎、 [16]抗菌、促进血管生成等作用。许莉等通过检测冠心病患者血浆结合珠蛋白水平的变化发现冠心病患者血浆中结合珠蛋白浓度明显升高，作者认为可能是冠心病患者体内慢性炎症的代偿机制。最近有学者通过蛋白质组学研究提出触珠蛋白可 [17]能是阿尔茨海默病患者血清生物标记物之一。这些研究表明触珠蛋白具有多种生物功能，在不同的病理状态下发挥着不同的作用。本研究发现高尿酸血症组的触珠蛋白呈高表达，但其究竟是通过抗炎作用或抗氧化作用与高尿酸血症相关，还是一种急性期蛋白质反应，还需要大量研究的证实。 α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,α1-AT)是存在于人血浆中最重要的蛋白酶抑制物之一,主要由肝细胞产生,其主要作用是抑制蛋白溶酶活性，从而保护人体组织免受蛋白溶酶的破坏, 维持机体内环境的平衡，常作为炎症反应的标志物[18]。作为急性时相反应蛋白, α1-AT在急性炎症反应过程中可以增加2-3倍，在感染、肿瘤和肝病时α1- AT 浓度均显著增加, 且与炎症的程度相关。α1- AT 浓度的增加主要由白介素 6 介导。目前研究的较清楚的是α1- AT与肺部疾病的关系，认为α1- AT的缺乏是慢性阻塞性肺疾病的一个风险因素,在慢性阻塞性肺疾病(COPD)的发病机制中占有重要地位。本研究发现高尿酸血症组的α1- AT呈高表达，同时发现与抗炎作用相关的补体C3、触珠蛋白在高尿酸血症组也 6 基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金青年基金(2012211B33) *通信作者:yaohua01@sina.com 呈现高表达，这是否意味着炎性反应在高尿酸血症的发生发展中也起到一定的作 用仍需进一步研究。 载脂蛋白L 1(Apolipoprotein L 1,APOL1 )最初于1997年以一种人类的高密 度脂蛋白被描述,目前,人们对APOL1在人体中的详细的生理功能尚未探讨清楚。 在外周血中,APOL1主要要与载脂蛋白Al复合体蛋白结合而产生功能。最近研究 表明,ApoLl是唯一一种与bcl-2 ( B-cell leukemia-1ymphoma,B细胞淋巴瘤/白 血病-2,一种原癌基因)同源域3结合的脂质类蛋白,并且启动人体细胞凋亡或自 噬性死亡的功能。在我们的研究中,APOL1在高尿酸血症患者中都较正常人群低 表达,此外也有研究表明在具有低高密度脂蛋白的冠状动脉疾病患者中，APOL1 [19]与高血糖症和血浆甘油三酯具有明确的相关性。 综上所述，本研究中采用2-DE和MALDI-TOF-MS 对高尿酸血症组和对照组 人群血清进行了差异蛋白质研究，初步发现了触珠蛋白、载脂蛋白L1、α1-抗 胰蛋白酶和补体C3在高尿酸血症组和对照组中存在差异表达。由于目前的研究 仅仅是蛋白质组学初筛实验，还需要利用其他生物学方法进行进一步验证，并深 入探索其与高尿酸血症发病机制的具体关系，以期能为高尿酸血症的预防和早期 治疗提供参考。 参考文献 [1]Li-Ying ,Chen Wen-Hua,Zhu Zhou-Wen,et al.Relationship between hyperuricemia and metabolic syndrome[J].Journal Zhejiang Univ Sci B,2007,8:593-598. 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