结核杆菌概述

结核杆菌概述                                             微生物专业  张茜  2010112292 窗体底端 　    结核分枝杆菌（M. tuberculosis）简称为结核杆菌（tubercle bacilli）。早在1886年，德国细菌学家Koch就已证明结核分枝杆菌是结核病的病原菌。本菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。随着抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降。20世纪80年代后，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困及人口流动等因素，全球范围内结核病的疫情骤然恶化。据WHO统计，全世界约每3个人中就有1个人感染了结核分枝杆菌，在某些发展中国家成人中结核分枝杆菌携带率高达80%，其中约5%～10%携带者可发展为活动性结核病。近二十年由于艾滋病的流行，感染了HIV的结核分枝杆菌携带者，由于病毒破坏了机体的免疫功能，发展为活动性结核病的可能性比未感染HIV者高30～50倍，且结核的病程发展更快。此外，在HIV感染的发展进程中，结核是最早发生的一种机会性感染，结核病加重了HIV感染者或艾滋病人的疾病负担，使其更易死亡。目前全球每年约出现8百万结核新病例，并导致约3百万人死亡。我国每年死于结核病的人约25万之多，是各类传染病死亡人数总和的两倍多。因此，结核病又成为了威胁人类健康的全球性卫生问题，并成为某些发展中国家和地区，特别是艾滋病高发区人群的首要死因。   一、生物学性状   （一）形态染色   结核杆菌细长略弯曲，端极钝圆，大小约1～4×0.4um ，呈单个或分枝状排列，无荚膜、无鞭毛、无芽胞。在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典型，可呈颗粒状，串球状，短棒状，长丝形等。结核杆菌一般常用萎钠氏（Ziehl-Neelsen）抗酸性染色法染色，结核杆菌染成红色，其他非抗酸性细菌及细胞浆质等呈蓝色。结核杆菌的抗酸性取决于胞壁内所含分枝菌酸残基和胞壁固有层的完整性有关。   （二）培养特性   结核杆菌为专性需氧菌。营养要求高，在含有蛋黄、马钤薯、甘油和天门冬素等的固体培养基上才能生长。最适ph 6.5～6.8 ，最适温度为37℃，生长缓慢，接种后培养3～4周才出现肉眼可见的菌落。菌落为干燥、坚硬、表面呈颗粒状、乳酪色或黄色，形似菜花样。在液体培养内呈粗糙皱纹状菌膜生长，若在液体培养基内加入水溶性脂肪酸，如Tween～80，可降低结核杆菌表面的疏水性，使呈均匀分散生长，此有利于作药物敏感试验等。   （三）抵抗力   结核杆菌对某些理化因子的抵抗力较强。在干痰中存活6～8个月，若粘附于尘埃上，保持传染性8～10天。在3%HCI或NaOH溶液中能耐受 30分钟，因而常以酸硷中和处理严重污染的检材，杀死杂菌和消化粘稠物质，提高检出率。但对湿热、紫外线、酒精的抵抗力弱。在液体中加热62～63℃15 分钟，直射日光下2～3小时，75%酒精内数分钟即死亡。   （四）变异性   结核杆菌对链霉素、利福平、异烟肼等抗结核药物较易产生耐药性。耐药菌菌株常伴随活力和毒力减弱，如异烟肼耐药菌株对豚鼠的毒力消失，但对人们仍有一定的致病性。   卡介（Calmette-Gerine）二氏将牛型结核杆菌培养于胆汁、甘油、马铃薯培养基中，经230次传代，历时13年，使其毒力发生变异，成为对人无致病性，而仍保持良好免疫性的菌苗株，称为卡介菌（Bacilli Calmette-Giierin，BCG）。卡介菌接种人体后，可获得抗结核受疫力。   （五）菌体成份与作用   结核杆菌无内毒素，也不产生外毒素和侵袭性酶类，其致病作用主要靠菌体成份，特别是胞壁中所含的大量脂质。脂质含量与结核杆菌的毒力呈平行关系，含量愈高毒力愈强。   1.脂质（Lipid）：脂质占菌体干的20～40%，占胞壁干重的60%，主要是磷脂、脂肪酸和蜡质，它们大多与蛋白质或多糖质结合成复合物存在。①磷脂能刺激单核细胞增生，并可抑制蛋白酶的分解作用，使病灶组织溶解不完全，形成干枯样坏死。②脂肪酸在脂质中比重较大，其中6，6～二分枝酰～a，a‘～海藻糖（6，6～Dimycocyl～a，a’～D～trehalose）具有破坏细胞线粒体膜，毒害微粒体酶类，抑制中性粒细胞游走和吞噬作用，引起慢性肉牙肿。具有该物质的结核杆菌毒株，在液体培养基中能紧密粘成索状，故称为索状因子（cordfactor）。③蜡质D为胞壁中的主要成分，是一种肽糖脂（Piptidoglycolipids）与分枝菌酸（My-colic acid）复合物，能引起迟发型变态反应，并具有佐剂作用。④硫酸脑苷脂（salfatides）和硫酸多酰基化海澡糖（Multiasiylated trehalose salfate）在结核杆菌毒株胞壁中含有，能抑制吞噬细胞中的吞噬体与溶酶体融合，使结核杆菌在细胞内存活。这一类糖脂能结合中性红染料。产生中性红反应，借此可鉴定结核杆菌有无毒力。   2.蛋白质（Protein）：结核杆菌菌体内都含有数种蛋白质，其中重要的蛋白质是结核菌素（tuberculin）。结核茵素与蜡质D结合，能引起较强的迟发型变态反应。其他蛋白质可引起机体产生相应的抗体，但无保护作用。   3.多糖质（polysaccharides）：多糖质常与脂质结合存在于胞壁中，主要有半乳糖，甘露醇、阿拉拍糖等。多糖质可使中性粒细胞增多，引起局部病灶细胞浸润。 4.核酸（Nucleic acid）：结核杆菌的核糖体核糖核酸（Ribonucleie acid ribosonic， rRNA）是本菌的免疫原，刺激机体产生特异性细胞免疫。 1998年英国Sanger中心和法国Paseteur研究所科学家合作完成了结核分枝杆菌H37Rv株的全基因组测序工作。结核杆菌全基因组序列由4.41Mb(4.41529bp)组成，包括4411个基因，具有潜在编码能力的基因约有3977个，约占90.2%。有3924个开放阅读框，其中约40%有功能，44%可能有功能，16%称为孤独序列，与其他微生物的序列无相似性。基因组富GC碱基，G+C含量高达65.6%。2001年10月，完成了对结核杆菌CDC1551全基因组的测序工作。结核分枝杆菌全基因测序工作的完成为结核病病原菌致病基因的各种研究提供了极好的机遇。   二、致病性   结核杆菌的致病作用可能是细菌在组织细胞内顽强增殖引起炎症反应，以及诱导机体产生迟发型变态反应性损伤有关。结核杆菌可通过呼吸道、消化道和破损的皮肤粘膜进入机体，侵犯多种组织器官，引起相应器官，引起相应器官的结核病，其中以肺结核最常见。人类肺结核有两种表现类型。   （一）原发感染   原发感染是首次感染结核杆菌，多见于儿童。结核杆菌随同飞沫和尘埃通过呼吸道进入肺泡，被巨噬细胞吞噬后，由于细菌胞壁的碳酸脑苷脂抑制吞噬体与溶酶体结合，不能发挥杀菌溶菌作用，致使结核杆菌在细胞内大量生长繁殖，最终导致细胞死亡崩解，释放出的结核杆菌或在细胞外繁殖侵害，或被另一巨噬细胞吞噬再重复上述过程，如此反复引起渗出性炎症病灶，称为原发灶。原发灶内的结核杆菌可经淋巴管扩散在肺门淋巴结，引起淋巴管炎和淋巴结肿大，X线胸片显示哑铃状阴影，称为原发综合征。随着机体抗结核免疫力的建立，原发灶大多可纤维给的钙化而自愈。但原发灶内可长期潜伏少量结核杆菌，不断刺激机体强化已建立起的抗结核免疫力，也可作为以后内源性感染的来源。只有极少数免疫力低下者，结核杆菌可经淋巴、血流扩散至全身，导致全身粟粒性结核或结核性脑膜炎。   （二）继发感染   继发感染也称原发后感染，多见于成年人。大多为内源性感染，极少由外源性感染所致。继发性感染的特点是病灶局限，一般不累及邻近的淋巴结，主要表现为慢性肉芽肿性炎症，形成结核结节，发生纤维化或干酪样坏死。病变常发生在肺尖部位。   三、免疫与变态反应   结核杆菌的免疫原rRNA和变应原结核菌素可诱发机体产生由T淋巴细胞介导的两种免疫应答反应，即细胞免疫和迟发型变态反应。   （一）免疫性   人类对结核杆菌的感染率很高，但发病率却较低，这表明人体感染结核杆菌可获得一定的抗结核免疫力。抗结核免疫力的持久性，依赖于结核杆菌在机体 内的存活，一旦体内结核杆菌消亡，抗结核免疫力也随之消失，这种免疫称为有菌免疫或传染性免疫（Infection immunify）。   抗结核免疫主要是细胞免疫，包括致敏的T淋巴细胞和被激活的巨噬细胞。致敏的T淋巴细胞可直接杀死带有结核杆菌的靶细胞，同时对释放多种作用于巨噬细胞的淋巴因子，使巨噬细胞聚集在病灶周围形成以单核细胞为主的增生性炎症。被激活的巨噬细胞极大地增强对结核杆菌的吞噬消化，抑制繁殖，阻止扩散， 甚至消毁的能力，充分分挥细胞免疫的作用。   （二）免疫与变态反应的关系   在结核杆菌感染时，细胞免疫与迟发型变态反应同时存在，此可用郭霍氏现象（Koch‘s phenomenton）说明，①在健康豚鼠皮下首次注射一定量结核杆菌，10～14天后注射部位缓慢地出现溃疡，深而不易愈合，邻近淋巴结肿大，细菌散至全身，此时结核菌素测试为阴性。②用相同等量的结核杆菌注入曾感染已康复的豚鼠皮下，在1～2天内即迅速发生溃疡，但溃疡浅而易愈合，邻近淋巴结不肿大，细菌也很少扩散，结核菌素测试为阳性。③在康复的豚鼠皮下注射大量结核杆菌，则引起注射局部及全身严重的迟发型变态反应，甚至导致动物死亡。上述三种现象表明，首次感染出现的炎症反应偏重于免疫预防，溃疡浅而愈合，细菌不扩散，说明机体尚未建立起抗结核免疫力；再次感染发生的炎症发应则偏重于免疫预防，溃疡当浅而愈合，细菌不扩散，说明机体对结核杆菌已具有一定的细胞免疫力，而溃疡迅速形成，则说明在产生免疫的同时有迟发型变态反应，表现出对机体有利的一面；用过量的结核杆菌进行再次感染，则引起剧烈的迟发型变态反应，说明迟发型变态反应对机体不利的一面。人类的原发性肺炎结核，继发性肺结核，严重而恶化的肺结核，相当于郭霍氏现象的三种情况。   近年来，实验研究证明结核杆菌细胞免疫与迟发型变态反应是由不同的T淋巴细胞亚群介导和不同的淋巴因子承担的，是独立存在的两种反应。①从小鼠实验表明，结核杆菌感染的细胞免疫应答为Lytl+-2和Lytl——2T淋巴细胞，而迟发型变态反应则为Lytl+2T淋巴细胞。②取结核杆菌rRNA 免疫小鼠的T淋巴细胞与rRNA共育的上清中不含巨噬细胞移动抑制结核杆菌繁殖抑制因子（Myco IF）；但用结核杆菌减毒活菌标（H37RV）免疫小鼠的T淋巴细胞与PPD共育，其上清中则含有MIF，而与H37RV共育的上清液不仅含有MIF而且 含有Myco IF.这两种免疫小鼠都用结核杆菌强毒株攻击，他们都获得相等程度的免疫力，故认为抗结核细胞免疫是由Myco IF承担，而与MIF无关。   本试验用于测定机体对结核杆菌有无变态反应。将一定是结核菌素注入皮内，如受试者曾感染结核杆菌，则在注射部位出现迟发型变态反应炎症，是为阳性，未感染结核杆菌则为阴性。此法可用检测可凝病人曾否感染结核菌，接种卡介苗后是否阳转以及检则机体细胞免疫功能。   结核菌素试验一般使用旧结核菌素（Old-tubercein简称OT），是结核杆菌在肉汽中培养物经加热浓缩的滤液。主要成分是结核蛋白，也含有结核杆菌的其他代谢和培养基成分。稀释1万倍，0.1毫升内含有1个单位（稀释1000倍，0.1ml 有10个单位），取OT结核蛋白纯化后称为精制纯蛋白衍生物（Purified protein derivative ，简称PPD ），取0.00002ml作为一个结核菌素单位，是现今国际制造的PPD，称为PPD-S.试验法常规使用5个单位OT（2000倍稀释0.1ml） 或PPD-S0.0001mg注入受试者前臂掌侧皮内，48～72小时内出现红肿硬节直径大于5毫米者为阳性，虽有红肿但无硬结或硬结直径不到5毫米者为阴性。应注意受拭者处于原发感染早期，变态反应尚未发生，或正患严重的结核病如全身粟粒性结核和结核性脑膜炎时机无反应能力，或患其他严重疾病（麻疹、结 节病、恶性肿瘤），如用过免疫抑制剂时，结核菌素反应均可转为阴性。   四、微生物诊断   根据结核菌感染的类型，应采取病灶部位的适当标本。如肺炎结核有采取咯痰（最好取早晨第一次咯痰，挑取带血或脓痰）；肾或膀胱结核以无菌导尿或取中段尿液；肠结核采取粪便标本，结核性脑膜炎进行腰脊穿刺采取脑脊液；脓胸、肋膜炎、腹膜炎或骨髓结核等则穿刺取脓汁。   （一）直接涂片染色   咯痰可直接涂片。用萋纳氏法染色，若镜检找到抗酸性杆菌，可能是结核杆菌，但通常应报告：“查到抗酸性杆菌”，因标本中可能混杂有非致病性抗性抗酸杆菌，单凭形态染色不能确定是结核杆菌，需进一步分离培养鉴定。如标本中结核杆菌量少，杂菌和杂质多时，直接涂片不易检出（一般需要每毫升痰液含有结核杆菌10万个以上才能检出），应浓缩集菌后，再涂片染色镜检，以提高检出阳性率。   无菌直接采取的脑脊液、导尿或中段尿可直接用离心沉淀集菌。咯痰和粪便标本浓缩集菌因含杂功菌多，需用4%NaOH或3%HCL或6%H2SO4处理，然后，用离心沉淀法将结核杆菌浓缩聚集于管底，再取沉淀物涂片作抗酸染色检查、分离培养或动物试验。   （二）分离培养   结核杆菌生长缓慢，培养期长，当以酸碱中和浓缩集菌的沉淀物，接种于固体培养基上，以蜡封口防止干燥。37℃培养4～6周后检查结果。根据生长 缓慢，菌落干燥、颗粒状、乳酪色象菜花状，菌体染色抗酸性强，多数为结核杆菌。如菌落、菌体染色都不典型，则可能为非典型分枝杆菌，应进一步作鉴别试验。   （三）动物试验   常用豚鼠或地鼠鉴别疑似结核杆菌的分离培养物和毒力测定。取经浓缩集菌处理的标本1.0毫升注射于豚鼠腹股沟皮下，经3～4周饲养观察，如出现局部淋巴结肿大，消瘦或结核菌素试验阳性，可及时剖检：若观察6～8周后，仍未见发病者，也要剖检。剖检时应注意观察淋巴结、肝、脾、肺等脏器有无结核病变。   五、防治原则   （一）预防接种   卡介苗接种是预防结核病的有效措施之一，广泛接种卡介苗能大大地降低结核病的发病率。根据统计调查未接种组的发病率比接种组高4～5倍，婴儿因 免疫力低，为卡介苗接种的主要对象。6个月以内健康儿童可直接接种，较大儿童须作结核菌素试验，阴性者接种。一般在接种后6～8周如结核菌素试验转阳，则表示接种者已产生免疫力。试验阴性者应再行接种。皮内接种卡介苗后，结素试验转阳率可达96～99%，阳性反应可维护5年左右。   （二）治疗 结核病的治疗在于控制疾病，促使病灶愈合，消除症状和防止复发。抗痨药物有制菌作用，但它们仍须通过体内免疫机理而起作用。常用的药物有异菸肼 （INH）、链霉素、对氨水杨酸钠（PAS）、利福平、乙胺丁醇等。各种抗痨药物如合并应用，有协同作用，且能降低耐药性的产生，减少毒性。因耐药菌株出现较多，因此由病人体内人分离的结核菌株在治疗过程中应作药敏试验，以测定耐药性的产生情况。 六．结核杆菌耐药研究  20世纪中叶以来，各种抗结核药物相继问世，加之人们生活水平的提高、卫生设施的改善等，结核病的发病率持续下降。然而，结核杆菌很快对各种药物产生了耐 药性，结核病在沉寂了一段时间后又死灰复燃，给结核病控制工作带来了新的挑战。从结核菌的结构本身上来讲，它具有几种抑制抗生素活性的机制。首先，它被其 特有的、高疏水性的细胞壁保护，大大降低了化合物的渗透性，这就构成了结核杆菌对药物的第一道防线。另外，在结核杆菌中发现了活跃的药物外排系统、使药物 降解或失活的酶以及与这些功能相关的基因。结核杆菌的耐药性形成机制有适应学说、选择学说、遗传学说，遗传学的研究表明结核杆菌产生耐药性的根本原因在于 基因突变。在自然条件下，基因突变的几率非常低。   基因学研究表明，结核杆菌耐药性的产生多见于染色体上编码药物标靶的基因或药物活性有关的酶基因 突变所造成。目前对结核杆菌耐药分子机制的研究主要集中在各种药物的作用靶点及其相关基因的突变上。现已研究清楚耐药性有关突变形式，有点突变、缺失、插入突变等，这些形式在抗结核一线药物（异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素等）均已出现。   结核杆菌耐利福平（RFP）分子机制  RFP作用于结核杆菌DNA依赖的RNA聚合酶β亚基（rpoβ），与它特异性地结合，抑制聚合酶活性，干扰分枝杆菌RNA的转录及合成，阻碍蛋白质合成 而发挥抗菌作用。近年来的研究表明，结核分枝杆菌耐RFP的发生是由于编码RNA聚合酶聚合酶β亚基（rpoβ)基因突变所致，而且集中在一段高度保守的 81bp(507～533位27个氨基酸密码子）的区域内，此区域为核心区域又称RFP耐药决定区。最常见的突变点是第531位丝氨酸（Ser)与亮氨酸 （Leu)置换，第526位组氨酸（His)与络氨酸（Tyr)、天门冬氨酸（Asp)或半胱氨酸Cys置换，第516位Asp与氨酸（Val)置换。临 床分离耐RFP菌株超过96%是由于rpoβ基因突变所致，其中有65%～86%的突变发生在第531位和第526位，并引发高RFP水平的耐药（＞32μg/ml），而514、521、533位点产生的都是RFP低水平耐药（＜13.5μg/ml)。约4%左右耐RFP结核分枝杆菌的核心区域或 rpoβ基因其他未知未发生突变，提示还有其他耐RFP机制存在，如发现在rpoβ氨基酸终止区域的突变与利福平的耐受性有关。rpoβ突变已作为 结核分枝杆菌耐RFP的遗传标志，并建立了多种快速、有效的检测耐RFP基因型的。目前，研究人员主要研究rpoβ基因不同位点突变与耐RFP表型之间、rpoβ基因突变与利福平最低抑菌浓度的关系等。这些方面的研究还有待进一步的深入。   结核杆菌耐异烟肼的分子机制  异烟肼属于前体药物，需要由结核杆菌体内的过氧化氢酶―过氧化物酶激活，从而产生一系列的活性氧和活性有机自由基攻击结核杆菌的多个靶点，结果造成一些蛋 白靶点某些基团氧化或酰化使蛋白失活，从而导致菌体一些生理功能的丧失。INH耐药机制比较复杂，目前研究比较清楚的是细胞壁分枝菌酸合成途径中的酶系，过氧化氢酶―过氧化物酶编码基因（KatG)和（或）烯酰基还原酶编码基因（inhA)或烷基过氧化氢酶编码基因（ahpC)或酰基携带蛋白 （AcpM)及β酮酯酰合成酶的复合物编码基因（KasA)等。   KatG基因位于结核杆菌染色体上，含2223个核苷酸。临床分离耐 INH的菌株中有42%～58%发生了KatG基因突变，可有KatG基因的完全缺失（不到1/3），导致产生高水平的INH耐药；大部分为 KatG基因有突变（点突变、缺失或插入），约在40%的耐异烟肼菌株中发现了第315位（Ser―Thr)的突变，此位置的突变使得过氧化氢酶―过氧化物酶丧失了近50%的酶的活性，导致酶失去活化INH的能力，引起高水平的INH耐药性，但它保留的酶活性仍为菌体提供一定水平的氧化保护，可使菌株抵抗机体残留的抗生素。KatG其他位置上的变异，也可以导致细菌对INH产生不同水平的耐药性和保留不同的过氧化物酶―过氧化氢酶活性，对这些突变所 起的作用还需要深入的研究。   InhA和KasA均属于分枝菌酸合成系统的酶蛋白，它们发生突变的位点通常位于启动子区域，也有少数发生 在编码这些蛋白的基因中，突变最终导致这些靶蛋白的过量表达或者一些功能的变化。但这类突变引起的都是低水平的异烟肼耐受。InhA发生的突变使得 第94位的产物色氨酸被丙氨酸取代，这种取代使InhA与还原型烟酰胺二核苷酸（NADH）的亲合力提高，从而在一定程度上阻断了异烟肼对InhA的抑 制，使菌株产生了一定的耐受性。对临床耐INH菌株的研究，在一些耐药菌株上可出现KasA基因突变［2］，但在一些敏感菌株中也发现了类似的突变，目前对于它在INH耐受中起的作用还不太清楚，有待进一步的研究。   在约10%INH临床耐药株中含有KatG基因突变的菌株中发现了ahpC基因的突变。INH耐药菌株中ahpC启动子区域突变将引起AhpC蛋白的过量表达，从而弥补KatG基因突变造成的过氧化氢酶―过氧化物酶活性 的损失，以抵抗宿主巨噬细胞的氧化作用。AhpC和KatG是细菌中协同作用调节氧压的一个调节子的两个酶，该协同作用是与OxyR转录因素一起进行的。 结核杆菌OxyR基因含有许多移码突变、缺失，本质上并无活性，是一个假基因，与结核分枝杆菌INH敏感性无关。但OxyR调节蛋白在功能上是作为氧化―应激的感受器和基因转录的激活剂，它控制解毒酶基因的表达，如KatG和ahpC基因的表达。因而，认为AhpC和OxyR水平之间的关系是结核杆菌对INH敏感的原因。   结核杆菌耐链霉素的分子机制 链霉素是一种氨基糖苷类抗生素，它主要作用于核糖体30S亚基，诱导遗传密码的错读，抑制转译过程的开始，干扰转译过程中的校对，从而抑制蛋白质的合成，发挥抗菌作用。研究表明，结核分枝杆菌耐受SM与编码核糖体30S亚基，S12蛋白的rpsL基因和编码16SrRNA的rrs基因突变有关。临床分离耐 SM菌株约有80%可见rpsL和（或）rrs基因突变，其中rpsL的突变率高于rrs。rspL基因最常见的是43位密码子突变，使Lys密码 子（AAG）突变成精氨酸（Arg)，也可见88位密码子发生同样的突变，rspL的突变常引起高水平的耐药。rrs突变常发生于915区和530环区， 它常引起中等水平的耐药。少数耐SM结核分枝杆菌分离株中发现双位点的突变，如rspL43位密码子和rrs513位密码子突变，rpsL88位和 rrs904位突变。约25%～30%左右的临床耐SM分离株具有野生型rrs基因和rspL基因，提示可能还有其他耐药机制存在，可能与细胞渗透性有关。   结核杆菌耐乙胺丁醇（EMB）的分子机制  乙胺丁醇是一种合成抗结核分枝杆菌活性的药物，它是一种阿拉伯糖类似物，作用于结核分枝杆菌阿拉伯糖基转移酶，阻断形成阿拉伯半聚糖，从而影响细胞壁分枝 菌酸―阿拉伯半乳糖―肽聚糖复合物的形成，使细菌无法生成完整的细胞壁，同时还会造成分子菌酸的积累。   研究表明结核分枝杆菌耐 EMB与编码阿拉伯糖基转移酶基因embABC操纵元突变有关，该操纵元约10.201Kb，由embC、embA和embB三个基因组成。国外专家研究 表明，69%耐EMB分离株有embB突变，其中89%又都发生于306位氨基酸密码子，国内也有类似的研究结果。在许多EMB耐受的结核杆菌中 都是embB第306位的密码子的突变，使得产物中的蛋氨酸被其他氨基酸取代。另外，也发现了embR基因的突变与EMB的耐受也有关；rmID基因的突变可能产生高水平的乙胺丁醇耐受，但其具体机制还不太清楚。   结核杆菌耐吡嗪酰胺（PZA）的分子机制  PZA是一种烟酰胺类似物，它可能是具有抗分枝杆菌活性的复合物的前身，需要经结核杆菌体内的吡嗪酰胺酶催化才能转化成吡嗪酸发挥杀菌作用。针对PZA的 作用机制，很早就发现对PZA耐受的菌株通常都失去了吡嗪酰胺酶的活性。目前，已经测序出编码吡嗪酰胺酶的基因为pncA。表明，72%～97%耐 PZA的分离株存在pncA基因突变，突变发生的位点可分布在启动子区域和结构基因的各种位置。pncA基因突变造成PncA蛋白结构改变，从而失去了将 PZA转化成活性形式的能力，导致耐药。但一些对PZA敏感的菌株中也发现了pncA基因的突变，也并不是所有对PZA耐受的菌株都发生了 pncA基因突变，这也表明了对PZA的耐受可能还存在一些其他的机制。也有资料表明，前体药物PZA缺乏吸收也是PZA耐药的一种重要机制，也 是结核分枝杆菌独特的机制。   其他方面分子机制的研究目前，已知有关的结核分枝杆菌毒力相关的基因有：与细菌在宿主内繁殖有关的分泌重复蛋白（ERP）；具有溶血活性的溶血素（TlyA)；与细菌入侵、存活 有关的Virs蛋白质（Virs)；与细菌在细胞内存活有关的过氧化氢酶―过氧化物酶（KatG)；与调控细菌在细胞内存活状况有关的Sigma因子家族（包括SigF）等。近来，学者们重点研究结核杆菌持续感染的基因有以下几种。   编码异枸橼酸裂解酶的基因icl和aceA  已证明这两种基因的产物都有异枸橼酸裂解酶活性。当结核分枝杆菌感染机体后，感染由急性转入为持续感染，结核分枝杆菌就改为利用脂肪酸为碳源，而异枸橼酸裂解酶是乙醛酸循环中的关键酶之一。已有较多的报道异枸橼酸裂解酶在结核菌持续感染中起重要作用。   编码环丙烷合成酶的基因pacA 环丙烷合成酶在形成分枝酶的索状结构中具有重要作用，用对pacA酶的抑制剂，可在持续期杀死细菌。 结核分枝杆菌分子生物学检测研究主要集中在结核病的诊断、结核菌耐药性的测定、分枝杆菌菌型鉴定等方面。常用的检测技术介绍如下。 　 　DNA序列测定技术的原理是建立在变性聚丙烯酰胺凝胶电脉技术的基础上，将待测DNA片段用放射性标记而形成单链寡核苷酸，使其一端为固定末端，而另一端成为一系列相差一个碱基的连续末端。寡核苷酸产物在4种不同双脱核苷的反应体系中分别终止于不同位置的A、T、C或G碱基上，将产物于聚丙烯酰胺凝胶电泳 重分离，放射自显影后从4种末端寡聚核苷酸梯子性图谱中，就可以直接读出DNA的核苷酸顺序。DNA序列测定技术已应用于以下方面。   结核分枝杆菌耐药基因型鉴定方法不仅能用于细菌基因突变的检测，而且能够确定其突变的部位与性质，是检测基因突变的最可靠的方法。目前，DNA序列测定已作为从基因水平进行MTB 耐药性测定的金标准。但对每一菌株而言，全部测定所有已知突变部位，需要多次反应，且自动测序仪价格昂贵，需多步操作，限制了其在大多数实验室的 应用。所以该法常作为其他方法的参考方法，或与其他方法结合应用。   结核分枝杆菌菌种鉴定  利用PCR―DNA序列分析技术，即利用PCR扩增待测基因，以荧光素为标记物，然后用测序仪测序，根据所得结果即可将待测菌株分型。 PCR―DNA可灵敏、快速、可靠地测定分枝杆菌种特异型核苷酸序列，目前，用于菌种鉴定的核苷酸序列主要有16SrRNA和65kD蛋白编码基因。但由 于测序的成本高，工作量大，所以在临床实验室很难开展。   核酸探针是指用放射性或非放射性物质标记已知的DNA或RNA片段，然后用这种已知的核酸探针检测样品中未知的核苷酸顺序，如有完全互补的核苷酸顺序，则 按碱基互补的原则结合，形成稳定的DNA：DNA或RNA：RNA复合物，再经显影、显色或荧光检测的方法，将结合核苷酸的位置或大小显示出来。核酸探针 技术的显著特点是高度的特异性，可用于结核病的诊断、菌种鉴定和耐药性检测等方面，但它的灵敏度不够理想，标本中至少需要104～105个细菌的DNA才 能检测出来，而且不能直接检测标本［6］，所以一般将它和其他的技术结合起来使用，如将它和敏感性高的核酸体外扩增技术相结合已成为结核病诊断和研究的重 要手段。 　  基因芯片又称DNA芯片、生物芯片，是目前分子生物学最前沿的方法，创始于20世纪90年代初。其基本原理是将大量探针分子（指已知的DNA或RNA片 段）固定在支持物（玻璃、硅片等）上，然后与待测样本的DNA或RNA进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度而获得样品分子的数量和序列信息。因 为该计算是将大量探针同时固定在支持物上，所以一次性对样品大量序列进行检测和分析。   此技术在结核分枝杆菌的研究种可用于菌种的鉴定、 耐药性的检测，基因组比较分析。如目前已发现了针对5种抗结核药物（INH、RFP、EMB、SM、PZA）耐药的相关基因，基因芯片技术就是将针对这些 相关突变的探针固定在一张芯片上，只需少量样本进行一次杂交，就可获得某菌株对该5种抗结核药物的耐药情况。用基因检测结核菌耐药性，仅需要4h。国内外 有多家单位用该法检测研究结核菌耐药性，但由于芯片制备比较复杂；样品的处理比较繁琐；又需要昂贵的仪器，检测成本高，临床实验室很难推广使用。 　 　DNA指纹图谱分析技术的基本原理是用限制性内切酶消化结核菌染色体DNA上特定的核苷酸序列，在琼脂糖凝胶中电泳分离，再将限制性片段转移到尼龙膜或纤维素膜上，与带标 记的已知DNA探针杂交，然后检测与探针同源的限制性片段的数目和大小的变化，以区别菌株。这些片段数目和大小的变化使每株分离株呈现特征性带型，即指纹 图谱型。此技术通常用于菌种鉴定，从而可以调查结核病的爆发流行，调查结核病患者是内源性复发还是外源性再感染，药物敏感性的变化等流行病学方面的研究。 　 　用于菌株分型的遗传标志必须具有菌株内稳定型和菌种内多样性的特点。目前结核分枝杆菌DNA图谱分析方法普遍插入序列（IS）或其他重复序列作为分型标 志。常用的有IS6110、IS1081、间隔子寡核苷酸、串联重复序列、富含GC多态性重复序列等，其中应用最广泛的是IS6110。下面对各种分型标志做一简单介绍。 　  IS6110 它广泛存在于结核分枝杆菌复合群（MTBc)的染色体基因组上，属于插入序列IS3家族。它在结核分枝杆菌不同亲本的菌株种中IS6110的拷贝数和染色 体位置是高度变异的，在菌株传播期间能保持稳定，使流行病学无关的菌株产生不同指纹图谱，因而，IS6110―限制性片段长度多态性（RFLP）已成为结 核分枝杆菌DNA指纹分析的国际性标准化方法。但这种方法也存在一些不足，一是对IS6110拷贝数少或无IS6110菌株难以进行菌株水平鉴 定，二是操作过程较繁琐，需要先对临床标本分离培养，实验中还要进行Southern杂交，费时也长。 　  间隔子是断裂基因中所具有的非编码序列，基于结核分枝杆菌的顺向重复序列（DR），它是一含36bp核苷酸的短的重复序列，集中在染色体一个特殊的区域，DR之间常被一些不同的间隔序列（间隔子）分开（多态性）。间隔子寡核苷酸分型法也就是Spoligotyping分型法。该法能非常容易的区别牛分 枝杆菌和其他结核分枝杆菌；也常用于IS6110低拷贝数的菌株分型，还可用于结核病的诊断等方面。Spoligotyping分型法方法操作简 单，可直接检测临床标本，而且检测结核分枝杆菌复合群的同时可对菌株进行分型，有利于调查结核病的爆发流行。   多态性串联重复和可变数目串联重复（MPTR）是结核分枝杆菌染色体中一种主要类型的重复DNA，由10bp的短串联重复序列而被5bp的非重复序列所分隔，有许多位点在他 们的重复数目中显示出高度可变性，称之为可变数目串联重复（VNTR）。VNTR分型方法与IS6110―RFLP分型方法分辨能力非常接近，而且可对 IS6110拷贝数较少的菌株进行分型。由于VNTR具有高度的稳定性和可重复性，且该法操作简单，能提供数字式的分型信息，可同时对大量样本进行分析， 所以VNTR分型方法的应用前景很好。   富含GC的多态性重复序列（PGRs)  是由24bp核苷酸序列不相同的重复序列组成，被不同序列的1～30bp核苷酸分隔，有数百个拷贝，并在染色体中是相当稳定的，可用于菌株分型。   　聚合酶链反应（PCR）诞生于1985年，由美国 Muliis等发明。PCR是一种根据脱氧核糖核酸（DNA）复制原理而设计的体外DNA或核糖核酸（RNA）扩增方法，由高温变性、低湿退火及适温延伸 等反应组成一个周期，经过n个周期后，理论上可以获得2n双链DNA分子，使DNA特定区段大量扩增。此检测技术灵敏度高、特异性强、简便、快速，但也存 在假阴性、假阳性、污染等方面的问题，研究人员对其进行了不懈的研究，使该技术不断得到改善，新的PCR及其衍生技术不断建立，常见的有以下几种。 　 　 逆转录PCR ，RNA在逆转录酶的作用下逆转录为cDNA，然后对cDNA进行PCR，一个细胞中rRNA的数量是DNA的100倍，因此扩增产物增多，试验的灵敏度大 大提高。该法敏感性和特异性均高于经典PCR，可用于结核病的诊断，但同样无法区别死活菌。 巢式PCR、半巢式PCR  巢式PCR采用内外两对引物，两次扩增。内引物是针对外引物扩增产物中的某一段序列而设计，即内引物以外引物扩增产物为模板进行第二次扩增，内引物具有菌 种特异性，外引物具有分枝杆菌属特异性。通过两次扩增可以提高检测的灵敏度，也可以从临床标本中直接检出结核分枝杆菌。它的特点是快速、敏感性高，而且可 用于分枝杆菌种属鉴别。半巢式PCR是由巢式PCR发展而来，主要是内引物的不同，它是利用外引物中的上游引物与第三寡核苷酸链组成了内引物，它 同样可以直接检测临床标本，用于结核病的诊断。还有由上述两种方法发展而来的单管平衡半巢式PCR，此法提高了扩增的效率，并有效控制了污染等。另外还有 单管巢式逆转录PCR，它的特点是可区分死活菌，但技术还不很成熟，有待进一步的研究。   PCR―单链构象多态性分析（SSCP）该法主要用于检测结核分枝杆菌的耐药性。其原理主要是PCR产物是两条互补单链，各单链的碱基序列不同而形成不同的空间构象，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 中，单链DNA泳动速度即取决于DNA的长度，也决定于其序列组成与空间构象。如果单链DNA某一片段的碱基序列发生突变或存在多态性，则在凝胶中的迁移率会发生改变，而在凝胶上显示不同的带型，通过与标准株对照即可确定有无突变，但无法确定突变的部位和性质。   PCR与核酸探针技术的结合是将PCR的较高的灵敏度和核酸探针的高特异性结合形成的新方法。 实时荧光定量PCR技术也称分子信标技术，是近年发展起来的核酸定量技术，是在普通PCR扩增体系中加入与靶基因序列互补的双荧光标记探针，当靶基因存在时，产生荧光，荧光的强 度与PCR产物量成正比，应用荧光光谱分析即可定量测定。该技术糅合了PCR的敏感性、分子杂交的特异性和光化学的精确性。用定量PCR方法可检测耐药菌 株和敏感菌株间DNA量的微小差别，以此确定是否耐药。 PCR分子灯塔技术原理是在PCR扩增过程中引入了荧光标记的探针，游离的单链DNA探针以一种茎环结构存在，环状结构与靶序列互补，茎环结构即探针两臂的末端分别连有荧 光物质和能淬灭荧光的物质。茎环结构使两部分足够近，荧光物质淬灭，因而溶液中检测不到荧光。若探针与靶序列能发生杂交，茎环探针将伸展成线状，即可检测 到荧光。该法适合于耐药性检测中检测点突变，Piatek等用该法检测了耐利福平的结核杆菌，显示了较高的特异性和灵敏性，分别为100%和98%。并且该法扩增、荧光探针检测一体化，快速且防污染，但 所用的仪器价格昂贵，难以普及。 PCR―限制性片段长度多态性分析（RFLP）其通过PCR扩增含有中特定酶切点的DNA片段，该片段经限制性内切酶消化后，产生较小的DNA片段，再电泳分离可形成结核分枝杆菌DNA指纹图谱。 这是一种最早使用的基因分型方法，该方法操作简便，分辨能力高、图谱相对稳定，但电泳时往往条带难以区分，实际使用起来比较困难。该法也可用于检测耐药基 因，如Mokrousov Ⅰ等利用该技术检测耐INH菌株的基因突变。该法是针对结核分枝杆菌基因组DNA上特征片段，如插入序列IS6110、IS1081，多态性富含 GC重复序列（PGRs)等。   PCR―双脱氧指纹图谱（ddF) 是由PCR―SSCP和双脱氧DNA测序结合产生的一种方法，主要用于结核菌耐药型测定。原理是PCR扩增产物变性形成单链，加入一种双脱氧核苷酸，通过 双脱氧核苷酸末端终止法，形成一系列一端为固定末端，而另一端长度不同的单链寡核苷酸，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析末端在同一碱基的产物的序列差 别。若条带出现泳动则判断为存在突变。PCR技术的广泛应用和迅猛发展，在PCR基础上建立了许多新的技术或衍生出其他体外扩增技术。 　 　综上所述，结核病分子生物学的研究在不同的领域均已取得较大的进展，但分子生物学的广泛应用还受到很多限制。首先是分子生物学理论中还有许多值得进一步 研究的领域，如耐药基因的研究，rpoB基因突变在耐RFP菌株中占95%左右，其他主要基因突变在耐药菌中比例均为80%作用，这就有可能还存在其他的 耐药基因，这就需要我们进一步的研究，以期找到各种药物的全部或绝大部分耐药基因；其二，分子生物学技术由于技术要求高，通常仪器设备、试剂费用较高，目前，分子生物学技术大多还仅仅局限在研究实验室。随着理论研究的深入，各种技术的不断完善与发展，分子生物学定能为结核病的诊断、治疗、流行病学调查等提供更大的帮助。 参考文献 [1] 李羲.呼吸系统疾病非典型表现与诊治[M].济南：山东科技出版社，2006：98. [2] 中国疾病预防控制中心.中国新闻社防治结核病专辑[M].北京：中国新闻出版社，2003：1- 5. [3] 黄秀清.结核病防治研究进展[J].广西预防医学，2002，8（1）：4- 6. [4] 杨继基.传染病学[M].北京：人民卫生出版社，2006：197- 198. [5] 卫生部疾病控制司. 全国结核病防治工作表彰大会资料汇编[Z].2001：14- 16. [6] 周林，李祥蓉.结核病的诊断[J].中国社区医师，2004，20（6）：11- 12. [7] 汤永春. 结核病防治工作的几个问题[J]. 中国社区医师，2004，20（6）：3- 4. [8] 王撷秀. 耐多药结核病的预防[J]. 中华结核和呼吸杂志，2006，39（8）：511- 512. [9] 高三友，等.结核病现代流行病学[M].北京：气象出版社，2003：43- 45. [10]Blanchard TG，Eisenberg JC，Matsumotoy．Clearance of Helicobacter pylori infection through immunization：the site of Tcell activation contributes to vaccine efficacy．Vaccine，2004，22：888—897． [11]Garhart CA，Heinzel FP，Czinn SJ，et a1．Vaccine induced reduction of H．pylori colonization in mice is interleukin—l 2 depen—dent but gamma interferon and inducible nitric oxide synthase independent．Infect Immun，2003，71：910一921． Cole ST，Brosch R，ParkhiU J，et a1．Deciphering the biology of M．tuberculosis from the complete genome sequence．Nature，1998，396：190一198．3 Zhu H，Bilgin M，Snyder M．Proteomics．Annu Rev Biochem．2003；72：783—812． [12] Mathesius U，Imin N，Natera SH，et a1．Proteomics as functional genomics t001．Methods Mol Biol，2003，236：395—414． [13] Cash P．Proteomics of bacterial pathogens．Adv Biochem Eng Biotechnol，2003，83：93—1 15． [14] Roberts DM，Liao RP，Wisedchaisri G，et a1．TWO sensor kinases contribute to the hypoxic response of MTB．J BiolChem，2004，279(22)：23082—23087． Florczyk MA，McCue LA，Stack RF，et a1．Identification and characterization of mycobacterial proteins differentially expressed under standing and shaking culture conditions，includ— ing Rv2623 from a novel class of putative ATP binding proteins．Infect Immun，2001，69：5777—5785． [15] Mariani F，Cappelli G，Riccardi G，et a1．Mycobacterium tuberculosis H 3 7 Rv comparative geng··expression analysis in synthetic medium and human macrophage．Gene，2000，253：281—291． [16] Rodriguez GM．Smith I．Mechanisms of iron regulation in my cobacteria：role in physiology and virulence．Mol Microbiol，2003，47(6)：1485—1494． [17] Jungblut PR，Schaible UE，Mollenkopf HJ，et a1．Comparative proteome analysis of Mycobacterium tuberculosis and My cobacterium bovis BCG strains：towards functional genomics of microbial pathogens．Mol Microbiol，1999，33(6)：1103—1117． [18] Mattow J，Jungblut PR，Schaible UE，et a1．Identification of proteins from Mycobacterium tuberculosis missing in attenuated Mycobacterium bovis BCG strains．Electrophoresis，2001， 22(14)：2936—2946． [19] He XY，Zhuang YH，Zhang XG，et a1．Comparative proteome analysis of culture supernatant proteins of Mycobacterium tuberculosis H37Rv and H37Ra．Microbes Infect，2003，5(10)： 851—856． [20] Goulding CW，Parseghian A，Sawaya MR，et a1．Crystal structure of major secreted protein of Mycobacterium tuberculosis MPT63 at 1．5-A resolution．Protein Sci，2002，1 1：2887— 2893． [21] van Montfort RL，Basha E，Friedrich KL，et a1．Crystalstructure and assembly of a eukaryotic small heat shock protein．Nat Struct Bi01，2001，8(12)：1025—1030． [22] Raynaud C，Papavinasasundaram KG，Speight RA，et a1．The functions of OmpATb，a pore—forming protein of Myeobaeterium tuberculosis．Mol Microbiol，2002，46：191—201． [23] Sloane AJ，Duff JL，Wilson NL，et a1．High throughput peptide msss fingerprinting and protein macroarray analysis using chemical printing strategies．Mol Cell Proteomics，2002，1： 490—499． 文档已经阅读完毕，请返回上一页！