TLR7和NF-κB在外阴硬化性苔藓及外阴鳞癌中的表达及意义

TLR7和NF-κB在外阴硬化性苔藓及外阴鳞癌中的达及意义 TLR7 和 NF-κB 在外阴硬化性苔藓及外阴 鳞癌中的表达及意义 (1. 中国医科大学附属第一医院妇科，沈阳 110001; 5 2. 中国医科大学附属第一医院产科，沈阳 110001) 摘要:目的:探讨 TLR7 和 NF-κB p65 在外阴硬化性苔癣和外阴鳞癌中的表达及意义。方法: 采用免疫组化 S-P 法检测 TLR7 和 NF-κB p65 在外阴硬化性苔鲜及外阴鳞癌中的表达情况。 结果:TLR7 在外阴硬化性苔藓中的表达明显低于外阴正常皮肤(P<0.05);NF-κB p65 在外 阴鳞癌中的表达明显高于外阴正常皮肤(P<0.05)，其在外阴硬化性苔藓中的表达明显低于 10 外阴正常皮肤(P<0.05)。结论:TLR7 参与正常外阴表皮的免疫应答反应，在外阴硬化性 苔藓中 TLR7 的作用减弱;NF-κB p65 在外阴鳞癌中高表达，促进肿瘤细胞的增殖，在外阴 硬化性苔藓中低表达，提示细胞增殖缓慢。结论:TLR7、NF-κB p65 在外阴硬化性苔癣和 外阴鳞癌发生、发展中发挥重要作用。 关键词:外阴鳞癌;外阴硬化性苔藓;TLR7;NF-κB p65;免疫组化 15 中图分类号:R711.72 Expression of TLR7 and NF-κB p65 in Vulvar Lichen Sclerosis and Vulvar Squamous Cell Carcinoma and Its Significance 20 YAO Jin1, JIANG Ying1, ZHAO Yi2, WU Xin1 (1. Department of Gynecology, First Affiliated Hospital of China Medical University, ShenYang 110001; 3. Department of Obstetrics, First Affiliated Hospital of China Medical University, ShenYang 110001) 25 Abstract: Objective: To investigate the expression of TLR7 and NF-κB p65 in vulvar squamous cell carcinoma and vulvar lichen sclerosus and its significance. Method: Immunohistochemic staining was conducted to detect the expression of TLR7 and NF-κB p65 in vulvar lichen sclerosus and vulvar squamous cell carcinoma. Results: TLR7 expression was significantly lower in vulvar lichen sclerosus than in normal vulva tissues(P<0.05). NF-κB p65 expression was 30 significantly higher in in vulva squamous cell carcinoma tissues than in normal vulva tissues (P<0.05).NF-κB p65 expression was significant lower in vulvar lichen sclerosus than in normal vulva tissues(P<0.05). Conclusion:TLR7 participated in the normal vulvar epidermal immune responses.Effection of TLR7 weakened in vulvar lichen sclerosus.High expression of NF-κB p65 in the vulvar squamous cell carcinoma promoted the proliferation of tumor cells.Low expression 35 of NF-κB p65 in vulvar lichen sclerosus suggested the cell proliferation was slow. Keywords: Vulvar Squamous Cell Carcinoma; Vulvar Lichen Sclerosus; TLR7; NF-κB p65; Immunohistochemistry 0 引言 40 外阴硬化性苔癣:是一种外阴及肛门皮肤萎缩变薄、色素减退变白为主要特征的疾病。 目前，研究显示此病可能与自身免疫性疾病有关[1]。外阴鳞癌是最常见的外阴恶性肿瘤，多 见于 60 岁以上妇女，目前病因未完全明确，与发病相关的因素有:性传播疾病、外阴慢性 -1- 皮肤疾病等[2]。 45 T0ll 样受体(toll-like receptors,TLRs)是?型跨膜蛋白受体，能直接识别并结合病原微 生物或宿主凋亡细胞表面的病原相关分子，激活天然免疫，调节适应性免疫，目前研究表明 [3]，尤其是 TLRs 可在各种肿瘤细胞表达，并且在不同的肿瘤中，TLRs 的表达情况也不相同 上皮源性肿瘤细胞表面存在的 TLRs，可被存在于局部的相应配体激活，启动上皮细胞的恶 性转化，分泌细胞因子和刺激肿瘤细胞生长。TLR7 能识别病毒的单链 RNA，在食管鳞癌、 头颈部鳞癌、宫颈癌中均有文献报道 TLR7 呈高表达[4-6]。 50 细胞核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)是几乎存在于所有细胞中的核转录 因子，参与调控细胞的众多生理及病理过程，在机体的生长发育、免疫应答、炎症反应和肿 瘤生长等方面发挥着重要的作用[7]。它是由 P50 和 P65(Rel-A)两个亚单位构成的异源二 聚体，故对 NF-κB P65 的充分研究可以反映 NF-κB 的表达及作用。 55 NF-κB 位于 TLR 下游信号通路的枢纽位置，激活 TRLs/ NF-κB 信号通路，产生多种 下游因子，使机体获得固有免疫和获得性免疫。同时，在癌症的发生、发展过程中，促进肿 [8]。 瘤细胞增殖和抵抗凋亡 目前国内外基于 TLR7 及 NF-κB65 在外阴疾病的研究很少，本研究的目的是探讨 TLR7 及 NF-κB65 在外阴硬化性苔癣与外阴鳞状细胞癌中发生、发展过程中的表达及作用。 60 1 材料与方法 1.1 材料 取自中国医科大学附属第一医院妇科外阴手术或活检，未经放、化疗，术后病理证实的 外阴组织。取 20 例外阴鳞状细胞癌组织、20 例外阴硬化性苔癣组织及 10 例正常外阴组织 做对照，经福尔马林固定，石蜡包埋。 1.2 试剂 65 兔抗人 TLR7 多克隆抗体(工作浓度 1:400)购自北京博奥森生物技术有限公司;兔抗 人 NF-κB p65 单克隆抗体(工作浓度 1:800)购自美国 Santa Cruz 公司;即用型 SP 试剂盒 及 DAB 显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 1.3 实验方法 免疫组化方法检测 TLR7 及 NF-κB p65 的表达 70 1.3.1 石蜡切片常规脱蜡水化。3%H2O2 于室温孵育 20min 灭活内源性过氧化物酶，再进行抗 原修复，羊血清室温 30min，TLR7(1:400)及 NF-κB P65(1:800)于 4?冰箱过夜，生物 素标记山羊抗兔 IgG 室温孵育 15min，辣根酶标记链霉卵白素工作液室温孵育 15min，最后 DAB 显色，苏木素复染封片。以 PBS 代替一抗作为阴性对照片。 结果判定 75 1.3.2 应用 AX70 万能显微照相系统(OLYMPUS，日本)进行图像采集，TLR7 阳性染色定 位于细胞浆，NF-кB 阳性染色定位于细胞核、部分细胞浆，细胞染色强度分为:阴性(—) 为不着色，弱阳性(+)为淡黄色，阳性(++)为棕黄色，强阳性(+++)为深棕黄色。应 用显微图像分析系统 MetaMorph(UIC/OLUS.US/JP)进行积分光密度测定，每张切片选取 5 个不同视野，计算同一张切片的平均光密度值，其代表阳性染色细胞在该组织中的表达水平。 80 -2- 统计学处理 1.3.3 采用 SPSS13.0 软件包，进行 t 检验，P<0.05 有统计学意义。 2 结果 2.1 TLR7 在外阴正常皮肤、外阴硬化性苔藓及外阴鳞癌中的表达 85 TLR7 阳性细胞在正常外阴皮肤表皮全层均有表达(图 1)，强度为++~+++，TLR7 阳 性细胞光密度值为 0.2793?0.0946;在外阴硬化性苔癣组织中全层或下 1/3 层表达(图 2)， 强度为+~++，TLR7 阳性细胞光密度值为 0.25379?0.0784;两者差异有统计学意义(P<0.05)。 在外阴鳞癌中主要在癌巢表达(图 3)，强度为+++，TLR7 阳性细胞光密度值为 0.27034? 0.1391，与外阴正常皮肤相比差异无统计学意义(P>0.05)。在外阴鳞癌中的表达与外阴硬 化性苔藓中的表达相比差异有统计学意义(P<0.05)(表 1)。 90 图 1 TLR7 在外阴正常皮肤中的表达(×200) Fig.1 Expression of TLR7 in normal vulva tissues 95 图 2 TLR7 在外阴硬化性苔藓中的表达(×200) Fig.2 Expression of TLR7 in VLS -3- 图 3 TLR7 在外阴鳞癌中的表达(×200) Fig.3 Expression of TLR7 in VSCC 100 表 1 TLR7 蛋白在外阴疾病中的表达的光密度值 Tab.1 Optical density of TLR7 expression in vulva diseases 分组 病例数 均值 P 外阴正常皮肤 12 0.2793?0.0946 外阴硬化性苔藓 20 0.25379?0.0784 <0.05 外阴鳞癌 20 0.27034?0.1391 >0.05 2.2 NF-κB p65 蛋白在外阴不同组织中的表达情况 105 NF-κB p65 阳性细胞在正常外阴皮肤表皮中表现为近基底细胞和基底细胞阳性(图 4)， 强度为+~+++，NF-κB p65 阳性细胞光密度值为 0.27136?0.0526;在外阴硬化性苔藓中表 现为全层下 1/3 阳性(图 5)，强度为-~+，NF-κB p65 阳性细胞光密度值为 0.2476?0.0687; 两者相比差异有统计学意义(P<0.05)。在外阴鳞癌中主要在癌巢表达(图 6)，强度为++~+++， NF-κB p65 阳性细胞光密度值为 0.327?0.0691，与外阴正常皮肤相比差异有统计学意义 110 (P<0.05)。外阴鳞癌与外阴硬化性苔藓相比差异有统计学意义(P<0.05)(表 2)。 图 4 NF-κB p65 在外阴正常皮肤中的表达(×200) Fig.4 Expression of NF-κB p65 in normal vulva tissues -4- 115 图 5 NF-κB p65 在外阴硬化性苔藓中的表达(×200) Fig.5 Expression of NF-κB p65 in VLS 图 6 NF-κB p65 在外阴鳞癌中的表达(×200) Fig.6 Expression of NF-κB p65 in VSCC 120 表 2 NF-κB p65 蛋白在外阴疾病中的表达的光密度 Tab.2 Optical density of NF-κB p65 expression in vulva diseases 分组 病例数 均值 P 外阴正常皮肤 12 0.27136?0.0526 外阴硬化性苔藓 20 0.2476?0.0687 <0.05 20 0.327?0.0691 <0.05 外阴鳞癌 125 3 讨论 T0ll 样受体(TLR)是一种存在于多种细胞上的模式识别受体，它可以特异地识别病原 微生物进化中的保守的抗原分子，即病原相关分子模式，从而有效地诱发机体免疫应答反应， 是联系天然免疫与获得性免疫的重要分子[9]。目前已发现 11 种人 TLRs 基因，分为两型: 即 位于细胞膜表面的 TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6 和 TLR11 以及位于胞内膜组分( 如 130 [10]。位于细胞表面和细胞内部的 胞内体、溶酶体或内质网膜) 的 TLR3、TLR7/8 和 TLR9 TLR，通过识别配体、转导信号、激活特定基因的表达发挥作用[11]。 TLR7 是 TLRs 家族的重要成员之一, 通过识别病毒的 PAMPs 介导抗病毒免疫应答。 TLR7 不仅识别一些人工合成的具有抗病毒和抗肿瘤作用的小分子化合物,如 Imiquimod 等，更为重要的是识别病毒 ssRNA, 通过依赖的髓样分化因子 88(myeloid differentiation factor 88,MyD88) 信号通路活化免疫细胞, 诱导免疫细胞高水平表达 IFN、TNF、IL-12 和其他细 135 胞因子,在机体介导抗病毒免疫应答、抗肿瘤免疫和免疫调节中发挥重要的作用[12]。 本研究发现，在正常外阴皮肤表皮中有 TLR7 表达，说明在表皮的免疫应答反应中可能 -5- 有 TLR7 参与。文献报道 TLR7 主要表达于肺、胎盘、心、脾、骨髓、淋巴结、扁桃体和浆 样树突状细胞(pDC)、巨噬细胞、T 细胞、B 细胞和 NK 细胞等组织和免疫细胞中。此外,TLR7 [13]。而我们的研究也发现 在嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和内皮细胞中也有一定水平的表达140 TLR7 在外阴正常皮肤中有表达。TLR7 具有活化免疫细胞、抗肿瘤的作用，在外阴癌变过 程中表达应下降，但本研究发现:外阴癌中 TLR7 的表达量与正常皮肤相比，差异无统计学 意义(P>0.05)。有研究者认为 TLR7 在肿瘤的发生发展中起到一把双刃剑的作用。它一方 面通过刺激抗原呈递细胞增强宿主免疫，从而起到抗肿瘤作用; 另一方面通过刺激细胞因 子的产生构建肿瘤的微环境，促进肿瘤逃避宿主的免疫监视[14]。这可能是癌与正常无差异 145 的原因。 在外阴硬化性苔癣中 TLR7 表达于表皮全层或全层下 1/3，较正常外阴皮肤的表达量下 降(P<0.05)，目前认为外阴硬化性苔藓是一种免疫相关的疾病，TLR7 具有活化免疫细胞, 诱导免疫细胞高水平表达 IFN、TNF、IL-12 和其他细胞因子的功能，与自身免疫病有关[15]。 细胞外基质，热休克蛋白，HMGB1 染色质 DNA 与凋亡细胞的核蛋白复合物以及内源性核 150 酸的免疫复合物均可刺激 TLR7，导致系统性自身免疫疾病的发生。在系统性红斑狼疮研究 中发现:TLR7 能够被含有自身 RNA 的抗原( 如 Smith 抗原)激活[16]，TLR7 信号通路的 激活能够刺激自身免疫型 B 细胞的增殖，从而加重 SLE 患者的病情[17]。本研究检测 TLR7 在外阴硬化性苔藓中低表达，说明 TLR7 在外阴硬化性苔藓的病变过程中作用减弱。 核因子-кB(nuclear factor-kappa B,NF-кB)几乎存在于所有细胞中，它是一种快反应 155 转录因子，参与调控细胞的众多生理及病理过程，能与调控细胞分化和生长、免疫应答、炎 症反应、细胞粘附和细胞凋亡所必需的许多细胞因子、粘附因子等基因启动子或增强子部位 的кB 位点特异性结合，启动和调节这些基因的转录，在机体的生长发育、免疫应答、炎症 反应和肿瘤产生等方面发挥着重要的作用。NF-κB 在胞浆内呈结合形式的无活性抑制性蛋 白，激活后进入细胞核，形成环形结构与 DNA 接触，并启动抑制有关基因的转录。激活多 160 种与细胞生长或凋亡相关的细胞因子，参与肿瘤的发生和发展。 本研究发现 NF-кB 在正常外阴皮肤表皮仅基底细胞和近基底细胞表达，而在外阴鳞癌 中表达增强。研究表明:TLR7 可使 MyD88 活化，活化后的 MyD88 激活 IRAK，后者与肿 瘤坏死因子受体相关因子 6(TRAF6)相互作用使之活化。TRAF6 和泛素结合酶 13 等形成复 合物，使 TRAF6 发生寡聚化，然后通过接头蛋白 TAB2 与转化生长因子激活激酶 1(TAK1) 165 相互作用，激活 TAK1。活化的 TAK1 使 NF-κB 诱导激酶(NF-κB inducing kinase，NIK) 磷酸化，从而激活下游的 IκB 激酶( inhibitor of NF-κB kinase，IKK)，活化的 IKKα、IKK β 和 IKKγ与磷酸化 NF-κB 抑制蛋白( inhibitor of NF-κB，IκB )形成复合物，通过磷酸 化降解 IκB 蛋白，解除了 NF-κB 途径的抑制，使得 NF-κB 转位进入细胞核内，与 DNA 结合发挥转录调控作用[18-19]，外阴癌中 NF-κB 的高表达可能激活与细胞增殖相关的目的基 170 因，促进肿瘤细胞的增长。而在外阴硬化性苔癣中 NF-κB 低表达，与其细胞增殖缓慢相一 致。 [参考文献] (References) [1] 乐杰，主编.妇产科学.第七版.北京:人民卫生出版社，2008:233-234. 175 [2] 乐杰，主编.妇产科学.第七版.北京:人民卫生出版社，2008:257-260. [3] 陈颖，周家德.Toll 样受体免疫性作用在妇科肿瘤中的研究进展[J].现代妇产科进展，2011，20(4):322-324. [4] Pris R，Hogrefe L，Frenzel H，et al.Induction of c-dependent cell proliferation through toll-like receptor 3 in head and neck cancer[J].Int J Mol Med,2008,21(2):209-15. -6- [5] Frenzel H,Hoffmann B,Brocks C et al.Toll-like receptor interference in myeloid dendritic cell through head and 180 neck cancer[J].Anticancer Res,2006,26(6B):4409-13. [6] Hasimu A，Ge L,Li QZ,et al.Expression of Toll-like receptor 3,4,7 and 9 in cervical lesions and their correlation with HPV16 infection in Uighur women[J].Chin J Cancer,2011,30(5):344-50. [7] Xiao W.Advances in NF-κB singnaling transcription and transcription.Cell Mol Immunol,2004,1(6):425-435. [8] 王羽超，周红光，陈海彬，等.Toll 样受体/细胞核因子-κB 信号通路与恶性肿瘤的研究进展[J].辽宁中医 185 杂志社，2011,38(4):785-787. [9] PASARE C,MEDZHITOV R.Toll-like receptors : linking innate and adaptive immunity[J].Microbes Infect,2004,6(15):1382-1387. [10] 张熤，钟波，杨艳，等.TLRs 与 RLRs 介导的细胞抗病毒反应信号转导及其调节机制[J].细胞生物学杂 志，2009,31(4):453-468. 190 [11] 侯学伶.树突状细胞 TLR7/8 信号通路机制的研究进展[J].临床检验杂志，2011,29(9):680-682. [12] 何小兵，房永祥，贾怀杰，等.Toll 样受体 7 介导的抗病毒天然免疫反应研究进展[J].中国兽医科学， 2010,40(6):645-649. [13] CHUANG TH，ULEVITCH RJ.Cloning and charaterizartion of human Toll-like receptors:hTLR7,hTLR8 and hTLR9[J].Eur Cytokine Network,2000,11(3):372-378. 195 [14] Yu L， Chen S.Toll-like receptors expressed in tumor cell: targets for therapy[J].Cancer Immunol 1271-1278. Immunother,2008,57: [15] 魏伟，孙树权.TLR7 在 HCV 感染过程中的免疫激活及胞内区功能研究.第二军医大学硕士学位论文， 2011. [16] Christensen SR,et al.Toll-like receptor 7 and TLR9 dictate autoantibody specificity and have opposing 200 inflammatory roles in a mirine model of lupus.Immunity,2006,25(3):417-28. [17] Leadbetter,E.A.,et al.Chromatin-IgG complexes activates B cells by dual engagement of IgM and Toll-like receptors.Nature,2002,416(6881):603-7. [18] 王景锋，邵军军，常惠芸，等.病毒固有免疫识别受体研究进展[J].细胞与分子免疫学杂志，2009,25(12): 1217-1220. 205 [19] Lee J,Chuang TH,Redecke V,et al.Molecular basis for the immunostimulatory activity of guanine nucleoside analogs:activation of Toll-like receptor7[J].Proc Nat Acad Sci USA,2003,100(11):6646-6651. -7-