维生素K2对腰椎椎体骨质的作用

维生素K2对腰椎椎体骨质的作用 中国骨质疏松杂志2006年8月第12卷第4期ChinJOsteoporos,!竖培t!!!!: 维生素K2对腰椎椎体骨质的作用 辛风曾晖李继云 摘要:目的通过组织化学和形态计测方法对骨质疏松症小鼠模型在体性维生素的 骨代谢作用 进行研究.方法取18只雌性Wistar小鼠被分为3组.A组的小鼠行假性卵巢摘除 术;B组行卵巢 摘除术;c组行卵巢摘除术,并接受维生素l<2的皮下注射,每日10mg/kg.手术后 8周通过脱钙后改 良性四染法来评估小鼠的腰椎骨椎体各骨成分面积.结果B组小鼠的矿化性骨面 积(0.32?0.13 mITI2).类骨及矿化不良骨面积(0.13?0.06mIII2),与A组(分别为0.43?0.10mIIl2 和0.064-0.04mm) 相比较有着明显的差异(P<0.05);C组小鼠的这些指标没有明显的变化.在3组 中,骨的总面积和 骨的总体积没有明显的差异,说明维生素K2具有卵巢摘除术后降低矿化性骨丢 失的作用.结论维 生素有益于维持骨质疏松症性骨微小构造的特性. 关键词:维生素;骨质疏松症;椎体;卵巢摘除术;组织形态计测学 Effect0fvi~minOilvertebralbones0fosteoporoticratsXINFeng,ZENGHui,12Jiyun.Depa rtmentof Orthopedics,PekingUniversSho~nHospital,Shenzhen518036,China Abstract:Objective/nvivoeffectofVitaminonthebonemetabolismwasinvestigatedwith histomorDhometricmethodsonanimalmodelofosteoporosis.MethodsThreeserialsofani malswereusedinthis experiment.Ineachserial,eighteenfemaleWistarratsweredividedintothreegroups.Ratsof GroupAunderwent sham— ovariectomy.GroupBwereovariectomized,andGroupCwereovariectimizedwithVitamin(1Omg/kg/ day)wasinjectionsubeutanously.Theirlongbonesandlumbarvertebralboneswereevaluated8and10weeks aftertlleoperationbymodifiedtetrachrome.biomechanicaltestingandhistochemicalmethod.ResultsAlthough mineralizedboneareas[(0.32? 0.13)mm2],osteoidanddeficitmineralizedboneaI~fl8[(0.13?0.06)mm2] inGroupBwereremarkedly(P<0.05)diffenrencefromthoseofGroupA[(0.43? 0.10)mm2and(0.06? 0.04)mm,respectively],thoseofGroupCwerenotseverelydecreased.Therewasnosignificantdifferenceof totalboneareasandtotalbonevolumesamongthethreegroupswhichsuggestedthattheVitaminhastheeffect ofreducingthemineralizedbonelossaftertheovariectomy.ConclusionVitaminishdphlinmaintainingthe bonemicro-architectureinosteopomsticrats. Keywords:VitaminK2;Osteopomsis;Vertebralbody;Ovariectomy;Histomorphometry 维生素K:(KaytwonN)是一种特殊的营养及辅 助因子,在血液凝固和骨代谢系统中是必不可少的. 维生素K:可使破骨细胞发生细胞凋亡来抑制骨的 吸收?j,同时可限制成骨细胞性前列腺素E的生 成].笔者报告一种组织形态计测学技术来甄别卵 巢摘除性骨质疏松症小鼠动物模型的腰椎椎体不同 骨成份的变化,展示出维生素K所参与的骨代谢性 形态变化的细节. 作者单位:518036深圳,北京大学深圳医院骨科 通讯作者:辛风,Email:xf571012@yahoo.cos.cn 1材料和方法 357 ? 论着? 1.1动物模型 将鼠龄为8周的18只Wistar小鼠分为3组:A 组接受了假性卵巢摘除手术(SHAM),B组行双侧卵 巢摘除术(OVX),C组行双侧卵巢摘除术,同时给与 维生素K:(ovx+VK:).术前小鼠体重为260—300 克,每周测重.所有小鼠笼养在室温为23?的特异 性无病原菌条件下,饲养8周,喂以普通食物和水, 整个研究过程中不给与其他任何药物.在试验期间 根据日本旭川医科大学的动物实验条例饲养这些 动物. 358中国骨质疏松杂志20O6年8月第12卷第4期 ChinJOsteoporos,August2006,Vol12,No.4 1.2卵巢摘除术 所有的小鼠在乙醚麻醉下行手术.SHAM组小 鼠行假性卵巢摘除术,仅显露和确认卵巢,不予以摘 除;OVX组和OVX+VK2组接受了双侧卵巢摘除 术,显露出两侧的卵巢并予以摘除. 1.3给药 维生素K(KaytwoN)由Eisai公司(东京)提供. 该药物用于治疗人类骨质疏松症的剂量为3,30mg ? kg,?d,,口服.基于此数据,对OVX+VK组小 鼠,我们选择了3mg?0.1kg,?d,,皮下注射,连续 8周.该注射从术后第2天开始. 1.4标本采集 在实验第9周的第1天,所有的小鼠经麻醉后 失血性死亡处理,用10%的缓冲福尔马林进行组织 灌注.然后采集腰椎的椎体,并用pH7.4,0.1M磷 酸二氢钠中4%多聚甲醛来固定48h.标本然后用 EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid)进行脱钙处理, 连续8d.所有骨组织再经常规石蜡块包埋处理. 1.5改良四染色法 石蜡组织块被切为14m的薄片,按照Ralis和 Watkins所描述的改良性四染色法进行染色,既主要 为Weigert铁苏木精,0.1%苯胺兰,苦桔和Ponceru 混合物(图I).切片的厚度非常重要,因为过薄会 染成淡蓝色,进而会染成蓝色,出现假性结果.腰3 的椎体以冠状面横切. 1.6组织形态计测法 染色的切片通过显微镜检查(E1000M型,由日 本东京尼康公司制造),然后使用数码相机(E2II 型,尼康公司制造)拍照,最后通过电子计算机来处 理结果.通过NIH影像软件(WayneRasband, Bethasda,MD,USA)来计算骨组织不同成分的面积, 它们被四染色法染成可鉴别的不同颜色.骨髓区 域,矿化骨区域和类骨极其矿化不良骨可以很清晰 地被分辨出来.类骨组织被染成深兰色,正常的骨 组织呈现为红色,而矿化不良骨则表现为浅兰色或 粉色.四种二维的面积被测定出来:骨面积(B. Ar),矿化骨面积(M.Ar),类骨及矿化不良性骨面积 (0.Ar),骨髓面积(Ma.Ar). 1.7统计学处理 所有的数据均以平均值?标准偏差(牙?s)来 表示.3组之间数据的差别通过Tukey法进行分析. P<0.05具有明显的统计学意义. 2结果 表1为通过前述的组织计测学方法所得到的参 数数值.3组之间B.Ar和M.Ar差异无统计学意 义. 表13组动物各种骨成分数值(牙?s,mm2) 组别图片数B.ArM.Ar0.ArMa.ArBwTv(%) 0VX6o0.45?0.1l0.48?0.100.13?0.060.56?0.1l34.8】?8.74 0VX+V6o0.46?0.050.48?0.100.06?0.040.54?0.0535.81?3.59 SHAM6o0.48?0.100.43?0.100.06?0.040.52?0.1037.66?7.67 注:与OVX组相比较P<0.05,为四染法玻片视野数 各组之间的M.Ar和0.Ar差异有统计学意义. OVX组的M.Ar与SHAM组比较有着明显地减少, 而0.Ar有着明显地增加(P<0.05).OVX+VK,组 与SHAM组比较M.Ar有轻微地减少,而0.Ar差异 无统计学意义. 骨组织的不同成分在不同的组别中显示出明显 的差异.3组之间骨成份的主要差异是矿化骨和类 骨.从3组之间每种骨成份占整个骨组织面积的百 分比可以看出,OVX组类骨面积的百分比几乎是 SHAM组和OVX+VK组的2倍,但是3组之间的骨 髓面积和总骨面积(包括成熟骨与类骨)差异很小. OVX+VK,组的参数与其他2组的比较有统计 学意义.每两组之间不同参数的P值通过Tukey法 加以计算.在OVX+VK2/SHAM比较组中,所有的 参数没有任何的统计学性差异,但在OVX/SHAM比 较组中,所有的参数均显示出统计学性差异(P< 0.05).在OVX+VK/OVX比较组中,M.Ar和0.Ar 显示出统计学性差异(P<0.05),而B.Ar,Ma.Ar和 总组织中骨面积(BV/Tv)均无统计学差异. 3讨论 因雌激素缺乏所致的骨质疏松症是女性绝经后 最为常见的骨质疏松症,是一种椎体强度处于高度 危险的状态.病理所见认为骨量的丢失是骨质疏松 症的特征之一,因为骨的吸收超过骨的形成.因而 最终结果是骨的负平衡得以促进.我们的改良 四染法实验进一步验证了这种观点.该方法可区别 网织骨和板状骨的矿化不良及非矿化骨组织.为了 探查骨基质的详细构造,最好是将骨的钙盐成分去 除,因为水泥和增长线处以及细胞周围骨的微细结 构,往往被矿物质所覆盖而变得不很清晰.如果使 用非脱钙切片,骨组织的微细结构亦常常因使用硬 组织切片机所致的矿物质断裂和粉碎而受到 破坏. 业已,激素缺乏性骨质疏松症不仅仅是因 骨量的净丢失所致,同时也因骨的成分比例发生变 中国骨质疏松杂志2006年8月第12卷第4期 ChinJOsteoperos,August2006,Vol12,No.4 化,如同骨软骨症一样.维生素K'具有影响骨代谢 的作用,促进骨钙素的产生,而骨钙素则是骨矿化过 程的重要因素之一.我们的研究结果显示,维生 素K2的确影响着骨结构的成熟过程,但不能中止骨 代谢负平衡的进程.该发现对维生素K'因通过活 化破骨细胞而致使的骨吸收过程有明显作用的理 论,和维生素K'调节因影响成骨细胞功能而导致的 骨形成过程的理论提出了疑异. OVX组和OVX+VK,组之间的骨及骨髓容积 (B.Ar,Ma.Ar,BV/TV和BS/TV)与OVX组和SHAM 组之间比较无统计学意义.OVX+VK组的B.Ar, Bv/Tv和BS/TV值比OVX组的要高些(表1),其意 味着维生素K'可能通过部分地激活破骨细胞进入 细胞凋亡?',或调整成骨细胞的增殖以刺激碱性磷 酸酶的活性来降低骨的丢失. 可以确信维生素K'是一种辅助因子,它为非羟 基化骨钙素变为7一羟基化骨钙素的后转化过程提 供能量,进而加速钙盐沉积到胶原基质的矿化过程, 即骨的成熟过程.本研究的结果肯定了维生素 K'可以改善各组之间的矿化骨和类骨的比例,从不 正常几乎变为正常,这意味着骨钙素的合成在骨的 矿化过程中起着重要的作用. 有报道指出,妇女的骨质疏松症是一种处于脊 柱骨折的危险状态,特别是绝经期后的妇女'. 骨质疏松症状态下脊柱椎体松质骨的丢失非常明 显,使该骨的生物力学强度降低.即使是进行日常 生活活动,骨质疏松性椎体骨也非常容易因压力作 用而遭受到微小性骨折,而这种骨折对社会而言是 高花费的.这些研究结果提示,维生素K可以作为 预防和治疗椎体骨质疏松性骨折的药物选择之一, 因其可加强骨组织的强度和改善骨成份的比例. 我们的研究显示,维生素K,可以降低和预防脊 --? 卜*--?卜*--?卜-——卜-——卜-——卜-——卜-——卜-——卜-——卜-——卜-— —卜一-'一一——卜一--?卜- 359 柱椎体骨的进行性丢失,但不能中止该过程.另一 方面,维生素K2可通过促进骨钙素的合成来增强骨 的矿化过程,改善实验性骨钙化不全脊椎骨结构特 性,这对维持正常脊柱骨结构功能是非常重要的. 本实验结果仅为小样本的骨质疏松症,还需要进一 步的有关骨质疏松症实验性和临床性方面的研究. 【参考文献】 KamedaT,MiyazawaK,MoriY,eta1.VitaminK2inhibits osteoclasticboneresorptionbyinducingosteoclastapoptosis.Biochem BiophysResCommun,1996.220:515—519. 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