纳米金与牛血清白蛋白作用的毛细管电泳研究

纳米金与牛血清白蛋白作用的毛细管电泳研究 纳米金与牛血清白蛋白作用的毛细管电泳 研究 Vo1.31 2010年11月 高等学校化学学报 CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES No.11 2162,2166 纳米金与牛血清白蛋白作用的 毛细管电泳研究 谢明一,郭振朋,陈义’ (1.中国科学院化学研究所活体化学院重点实验室,北京100190;2.北京分子科学国家实验室,北京100190) 摘要开展了针对微量纳米金与牛血清白蛋白相互作用的毛细管电泳研究,测得二者的结合常数为28.6L/ mol,每个纳米金颗粒吸附约24个牛血清白蛋白分子.结果明,牛血清白蛋白可改善并稳定纳米金的峰 形,二者作用时温育介质的pH以及电泳所用的缓冲溶液浓度对毛细管电泳(CE)效率有重要影响.此法可 推广到其它纳米颗粒的吸附研究中. 关键词毛细管电泳;纳米金;牛血清白蛋白;作用常数 中图分类号0657.8文献标识码A文章编号0251-0790(2010)11-2162-05 随着纳米科技的发展,纳米颗粒的正负生物学效应开始受到关注,其核心是纳米物质与生物活性 分子(如蛋白质)的相互作用.目前,国际上主要采用光学技术?”J,石英晶体微天平(QCM)及电 化学..等方法研究纳米物质与生物活性分子的相互作用,内容包括蛋白构型变化,结合常数及饱和吸 附量等,但研究的体系不多,深入程度不足. 利用毛细管电泳(CE)可以建立针对微量纳米颗粒与蛋白相互作用的快速检测方法,并可通过纳 米金(GNP)和牛血清白蛋白(BSA)为模型展开研究.GNP因其合成容易以及具有特殊的光学性质而得 到广泛应用,而BSA是一种典型的蛋白性质研究模型分子.因此研究BSA-GNP之间的相互作用具有 重要意义.Kenndler等与Liu等曾用CE分离纳米金;Huang等?则用cE研究过结合在GNP上 胰岛素的活性;Wang等?研究磁性氧化铁纳米颗粒上蛋白.抗体的复合物效率.上述研究虽展示了 CE的优势,但均未将其直接用于GNP与BSA相互作用的研究.本文对此开展了较为系统的研究,建 立了所需的CE方法,并测得了GNP—BSA的结合常数和每个纳米金颗粒吸附BSA的分子数. 1实验部分 1.1试剂 柠檬酸三钠,柠檬酸,硼氢化钠,氯金酸,氢氧化钠,碳酸钠及磷酸购于北京试剂公司;磷酸二氢 钾和磷酸氢二钠均购自北京益利精细化学品有限公司;BSA购于美国Amresco公司. 配制19mmol/L磷酸二氢钾和81mmol/L磷酸氢二钠混合溶液,使用前用三次蒸馏水稀释至10 mmol/L,并用3mol/L的磷酸溶液调节至pH=7.4或6.95,即得到PB缓冲液用于电泳分离. 1.2纳米金的制备 取1mL1%(质量分数)HAuC1用三次蒸馏水稀释至100mL,超声1min后,缓慢加入1mL1% 柠檬酸三钠,再超声1min,然后加入1mL0.075%NaBH,超声1min,溶液颜色转变成深红色.经 AFM表征发现溶液中主要含粒径为13nm的金颗粒,在520nm处有较强的吸收峰,测得此时纳米金 浓度为9.2nmol/L.该溶液的pH=4.5,可在4?下保存数月. 收稿日期:2010-04-26. 基金项目:国家自然科学基金(批准号:90717120,20905068),国家”九七三”项目(批准号:2007CB714504)和中国科学院知 识创新重要方向项目(批准号:KJCX2一Yw—H1I)资助. 联系人简介:陈义,男,博士,研究员,博士生导师,主要从事高效高通量生物微分析研究.E-mail:chenyi@iccas.ae.cn 谢明一等:纳米金与牛血清白蛋白作用的毛细管电泳研究2163 1.3BSA与纳米金的相互作用 分别用pH为3,4,5,6,7,8的10mmol/L磷酸缓冲液配制所需浓度的BSA溶液.用1mol/L Na:CO或1mol/L柠檬酸调节GNP溶液pH值与所对应的BSA溶液相同.将两者按1:1体积比混合, 于37?作用一定时问后进行电泳分离;或两者顺序进样,在毛细管中温育或不温育进行电泳分离,测 定电泳峰并进行分析. 1.4电泳操作, 所有电泳实验均在P/ACE2050型电泳仪(美国Beckman公司)上进行.石英毛细管尺寸为47cm (有效长度40cm)×75Ixmi.d.(河北永年光纤厂),用0.1mol/LNaOH,HO和PB溶液依次各冲洗3 min.采用3.45kPa压力进样3s(除非单独说明),于25?和15kV电压下分离.检测波长为200nm, 信号采集频率为5Hz. 2结果与讨论 2.1BSA与GNP相互作用的CE峰变化 实验发现,单纯柠檬酸保护的GNP一般都得不到重现性好的cE结果,其峰较宽且位置不完全确 定,并叠加为棒状峰(图1谱线0).这些问在已 发表的论文中并未明确提及,如Liu等通过添加 SDS来锐化峰形,SDS的确可以锐化纳米金的峰, 但将这一体系用于纳米金与蛋白质分子的相互作用 研究却不合适. 本文用蛋白来直接调节GNP的峰形和重现性. 从图1谱线b,d可以看出,随着BSA加入量的增 加,不重现的GNP峰迅速消失,代之以具有正态分 布的重现峰,位置在原GNP峰之前,居BSA之后. 此峰应归属为BSA与GNP的复合物峰,所以位置?gJ 居中.研究表明,其它白蛋白也具有类似作用,但 以BSA最简单实用. 需要注意的是,BSA并不能改善由柠檬酸保护 的GNP本身的CE峰,因而也得不到原GNP的可 靠峰参数.但因为BSA及其与GNP加合物的峰可 以稳定测得,所以用其研究GNP与蛋白的相互作 用是可行的. 2.2BSA与GNP加合反应条件的影响 BSA与GNP的加合反应本身很简单,只要将两者按一定比例混合并温育一定时间即可.但反应介 质的pH值会严重影响分离效果.图2显示,随着温育介质pH值的降低,BSA与GNP加合物的CE分 离峰明显增强,反之,加合物的分离峰随培育介质的pH值升高而减弱.因此就CE分离而言,温育介 质的pH值较低为宜.当pH值低于4时,GNP有沉淀析出,这对定量测定不利.因此选择pH值在5, 8之间进行温育,这样还可以兼顾与生理因素相关的研究. 另外,温育反应物浓度对CE峰也有显着影响.图1谱线b表明,在较低的反应pH值下,当BSA 的浓度小于GNP浓度时,其加合峰改善效果较差,但图1谱线C和d表明,当BSA浓度大于GNP浓度 后,加合峰改善效果明显.一般地,当反应介质的pH值较低时,GNP与BSA加合物峰的改善程度随 BSA浓度的增加而迅速提升,达到饱和之后开始下降;在中性或更高pH值的反应条件下,加合物峰 增强,达到饱和后又会出现较快的加宽变矮现象. 2.3CE条件 与普通CE分离类似,BSA与GNP加合反应产物的CE也受一系列电泳条件影响.其中多数CE条 kl?dd?; ??-兰”h 姒,愉一一,一,一一,一一,,,,一,一.州一 高等学校化学学报VoI.31 Fig.2ImpactofincubatingpHonpeakefficiencyFig.3 andresolutionof4.6nmol/LGNPand50 t~/mLBSAmixtureincubatedfor5min CEat+10kVwith10mmol/Lphosphoratebufferat pH=7.4.OtherconditionsasinFig.1.pH:0.8: b.7;C.6;d.5;e.4;,3. 12345678910111213l4l5l6 t/rain ImpactofrunbufferconcentrationonCEof 4.6nmol/LGNPand50pg/mLBSAmix- tureincubatedfor5min CEat+10kVwithphosphoratebufferatpH=7.4. OtherconditionsasinFig.1.C(Buffer)/(tool? L..):0.10;b.20;C.30;d.40;e.50;60. 件如电压(或电场强度),毛细管尺寸及温度等对峰效率和分析速度的影响与常规实验类似.一般宜采 用75m内径等管径略大一点的毛细管做分离,而不采用50m内径以下的毛细管.另外,电泳缓冲 液的酸度也应根据需要进行选择.蛋白CE一般采用极端pH(2或12)来克服管壁吸附问题,但BSA的 吸附问题并不严重,可以在不同pH值下进行电泳.实验表明,BSA的峰效率随pH值升高而增加,当 pH>7后峰效率可以维持稳定,考虑到pH=7及其附近是生理pH范围,故实验选用pH=7的缓冲液. 实验发现,电泳缓冲液的浓度对分离有负面影响,这与理论预测不同.图3显示,BSA—GNP的CE 分离效率随电泳缓冲液浓度的增加而下降,这可能是缓冲液中高浓度的磷酸根负离子与GNP发生了 某种作用,或对BSA有弱的竞争效应所致.但就分离条件的选择而言,应该考虑采用低浓度的缓冲 液.本实验用10mmol/L的磷酸盐作电泳缓冲液. 2.4BSA与GNP的作用速度,作用常数与饱和吸附量 由CE结果可见,BSA与GNP作用的速度较快,可在3min内完成.将GNP和BSA顺序直接进样 Fig.4FastkineticsofBSAontoGNPmeasured usingconditionsasinFig.1 口.Injectionof3SofGNPfollowedby3SofBSA: b.injectionthesameasincarvenbutin-columnin— cubationfor3min;cinjectionfor3Safterincu— bationfor3,22,42and60rain,respectively. 到毛细管内,然后立刻施加电压分离,即可观察到 BSA与GNP发生作用.比较图4曲线口和图1曲线 n可见,这种作用在相互接触时(不超过3S)即开 始进行,但在管内(25oC)温育3rain,并未使其作 用完成(图4曲线b),这与毛细管内的混合受限有 关.而在自由混合反应条件下,则在3min内反应 即可完成(图4曲线C与图4曲线d,,由此快速 作用的现象可以推断,BSA与纳米金之间的相互作 用主要是静电吸附作用,这与文献[5]的观点一致. 利用CE的定量优势,结合使用Scatchard方程 来测得GNP与BSA相互作用的强度及饱和吸附 量.Scatchard方程如下: r/cI=nK—Kr(1) 式中,是BSA与GNP的结合常数,是BSA在 GNP上的饱和吸附分子数目,r为BSA在纳米金表面上结合的实际比率,Cf是自由BSA浓 度(mol/L), 可分别由以下CE定量方程测得: r=[BSA.GNP]/[GNP] = (ABsA—GNP一1.052×10)/(3.433×10×66000×4.6×10一) = (ABsA—GNP一1.052×10)/(1.042×10)(2) 谢明一等:纳米金与牛血清白蛋白作用的毛细管电泳研究 c,=(ABsA+2391)/(66000×9.956×10) 式中,ABsA和ABA_G分别表示BSA及其与GNP复 合物的CE峰的面积(单位为mAU?S).图5是在 pH=5的反应介质中,经相互作用后求得的结果, 由此可直接读出其结合常数K:28.6L/Ixmol,再由s-d 截距计算出每个GNP上最多结合的BSA分子数为 = 24个(694/28.6). 测定饱和吸附分子数的另外一种办法是:固定 GNP浓度(本实验为4.6nmol/L),逐渐增加BSA 的浓度,温育后做CE,测定BSA—GNP加合物峰面Fig.5 积随BSA浓度的变化曲线,可得到1条向上的渐进 曲线.该曲线上升斜线的切线与水平渐进线的交点 在0.0074mg/mL处,此即为饱和吸附量.以牛血 清白蛋白分子量66000计算,得到的每个GNP吸附 BSA的量如下: (3) r ScatchardplotmeasuredwithGNPof4.6 nmol/Lincubated,vith0.01,0.02,0.03 and0.04m【g/mLBSA,respectively,at 37?for60rain OtherconditionsasinFig.1. c0.0074 一 CGNP66000x4.6×10一 24(4) 计算结果与上述测定结果相同.考虑到13nm的金颗粒为球形,可算得其表面积为5.31×10cm, 由此可求得按面积计算的饱和吸附量为4.5×10个分子/cm(24/5.31×10). 由于目前文献中未见与本研究完全相同的结果,因此所测结果的可靠性还有待于进一步证 实.文 献[5]采用QCM法研究了柠檬酸保护的纳米金,但文中只提及测得的关于GNP的电势,其中 BSA与 金的作用参数则测定的是石英晶体表面上的金膜,得到的结合常数是(1.0?0.3)L/l~mol,比本 文数 据小.这可能是因为BSA与沉积在石英晶体表面的平坦的金膜靠近,其阻力必定大于本文这 种自由悬 浮着的颗粒.悬浮且表面外凸的GNP,不仅允许BSA以最有利的方式接近纳米金,而且其比 表面原子 剩余作用力大于宏观平展的金表面,所以GNP对BSA的结合力应该比平展表面更大一些. 该文献方 法的BSA结合量(3.7×10个分子/cm)也小于本文测定数据. 利用CE不仅可以研究自由悬浮GNP与分子的相互作用,而且分析速度快(多在10min内, 包括 数分钟的作用时间),利用管内温育技术,可以研究十分微量的作用体系(从数微升甚至到 1IxL的样 品),非常适合于珍稀样品的研究. 参考文献 [1]ShangL.,WangY.,JiangJ.,DongS..Langmuir[J],2007,23:2714_2721 [2]LuntE.A.M.,PitterM.c.,OSheaP..Langmuir[J],2009,25:10100--10106 [3]LaeerdaS.H.D.,ParkJ.J.,MeuseC.,PristinskiD.,BeckerM.L.,KarimA.,DouglasJ.F..ACSNano[J] ,2010,4:365— 379 [4]WANGLei(王磊),DANGYong—Qiang(党永强),ZHANGMin(张敏),SUNJian(孙 健),wUYu.Qing(吴玉清).Chem.J.Chinese Universities(高等学校化学学报)[J],2009,30(1):135—139 [5]BrewerS.H.,GlommW.R.,JohnsonM.C.,KnagM.K.,FranzenS..Langmuir[J],2005,21:9303---93 07 [6]KaufmanE.D.,BelyeaJ.,JohnsonM.C.,NicholsonZ.M.,RicksJ.L.,ShahP.K.,BaylessM.,Pettersso nT.,Feldotoz.. 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KeywordsCapillaryelectrophoresis;Goldnanoparticle;Bovineserumalbumin;Interactionconstant (Ed.:A,G)