猪圆环病毒2型感染性DNA的构建及病毒拯救

猪圆环病毒2型感染性DNA的构建及病毒拯救 猪圆环病毒 2 型感染性 D NA 的构建及病毒拯救 3(杨顺利 ,尹双辉 ,沈小燕 ,尚佑军 ,刘湘涛 中国农业科学院 兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点 )实验室 农业部畜禽病毒学重点开放实验室 国家口蹄疫参考实验室 ,甘肃 兰州 730046 ( ) 摘要 :用 PCR 法扩增猪囿环病毒 ?型 PCV2全长基因组 。将全基因组插入到真核生物表达载体 PcDNA3 . 1 的多 兊隆位点中 ,获得单拷贝重组质粒 P2PCV2 和串连双拷贝重组质粒 p22 PCV2 ,将所得质粒分别转染无 PCV 污染的P K215 细胞系 ,经 7 次连续传代后 ,间接克疫荧光试验显示在细胞中含有病毒抗原 。提取 mRN A 后经 R T2PCR 检 测都有 PCV2 特异性基因转录 。克疫小鼠后 ,对克疫后不同天数小鼠的血清用 EL ISA 检测 ,结果到克疫后 35 d 病 毒几乎都能检测到衣壳蛋白特异性抗体 ,小鼠致死后在其体内也能检测到病毒 DN A 。结果表明 ,所构建的 2 种重组质粒均可表达幵在体外组装出有感染性 PCV2 病毒粒子 。为进行 PCV2 分子特性 、疫苗克疫及致病机理研究打 下了基础 。 关键词 :猪囿环病毒 2 型 ;感染性兊隆 ;病毒拯救 () 文章编号 :100524545 20110220169205 中图分类号 : S852 . 65 文献标识码 : A Construct ion and virus rescue of an inf ect ious cl one of porc ine c ircovirus type ? 3( N at i on al YA N G Sh u n2li , YIN Sh ua ng2h ui , S H EN Xiao2ya n , S H A N G Yo u2j un , L IU Xia ng2t ao Foot a n d M ou t h D ise ase R e f e re nce L abo r at o r y , Ke y L abo r at o r y o f A ni m a l V i rol o g y o f t he M i n2 is t r y o f A g ri c u l t u re , S t at e Ke y L abo r at o r y o f V et e ri n a r y Et i ol o g i c al B i ol o g y , L a n z ho u V et e ri n a2 )r y R ese a rc h I ns t i t u t e , CA A S , L a n z ho u 730046 , C hi n a ( ) Abstract : The f ull2lengt h geno me of po rcine circo vir us t yp e ?PCV2wa s a mplified by polymera se chain reactio n ( ) PCR. The PCV2 molecula r clo ne wa s generated by ligating si ngle cop y and t wo copies of t he co mplete PCV2 ge2 no me in tandem into t he pcDN A3 . 1 + vecto r and wa s sho w n to be inf ectio us i n v i t ro w hen t ransf ect ed into t he PCV f ree P K215 cell s. PCV2 specific nucleo tide f ragment which co ded t he Cap p ro t ei ns were amplified by R T2PCR wit h t he mRN A s f ro m t he bo t h cell cult ure . BALB/ c mice were immunized and sera sample s collected f ro m co nt rol a nd ( ) vaccinated animal s at diff erent days po st2inoculatio n dpiwere a ssayed fo r a nti2PCV2 cap sid a ntibo die s by EL ISA , t he re sult s i ndicated t hat t he reco mbinant pla smids induced sp ecific antibo die s against t he p at ho genic PCV2 cap sid a ntigen in al mo st all mice at 35 d ,a nd t he vir us DN A ca n be detected in let hal mice. The result s sho w t hat t wo mo2 lecula r clo ne s were inf ectio us i n v i t ro a nd i n v i v o ,a nd were a ble to generate inf ectio us PCV2 pa rticles. The st udy e s2 tabli she s a platfo r m fo r f urt her re sea rch o n t he molecula r biolo gy ,vacci natio n and pat ho genicit y of PCV2 . Key words :po rci ne circo vi r us t ype ?; inf ectio us clo ne ; vir us re scue 3 Cor res p on d i n g a ut ho r , E2m ai l : hn x i an g t ao @hot m ai l . com ( ) ( 猪囿环病毒 Po rci ne ci rco vi u s , PCV 是德国学Po st wea ni ng multi syst e mic wa sti ng syndro me , [ 1 ] ) PM WS主要病原 , 该病已经给养猪业带来严重的 者 Ti sc he r 等在猪肾传代细胞 P K215 中发现幵命 经济损失 。 名的 。根据 PCV 其抗原型及基因组成不同 ,分为 2 PCV2 基因组长 1 767～1 768 bp 。编码 11 个 种基因型戒血清型 ,即 PCV1 及 PCV2 。其中 PCV2 读码框 ,病毒 DN A 复制中间体 2 条链均指导病毒 具有致病性 ,被认为是断奶仔猪多系统衰竭综合征 蛋白合成 , 有 2 个 主要 读码 框即 O R F1 和 O R F2 。 其中 O R F1 经病毒正向 DN A 转录 ,为 Rep 基因 ,编 收稿日期 :2010202203 码复制酶相兲蛋白 , O R F2 经病毒 DN A 互补链转 ( ) 基金项目 :国家科技支撑 2006BAD06 A012 ; 家畜疫病病 录为 Cap 基因 ,编码主要结构蛋白 。PCV2 通过其 ( )原生物学国家重点实验室课题 S KL V EB2008 ZZ KT041 () 复制中间体 双链复制型 DN A 以滚环复制方式进 ( ) 作者简介 :杨顺利 19812,男 ,硕士 。[ 2 ] 3 通讯作者 , E2mail : hnxia ngt ao @ho t mail . co m 行复制。在 O R F1 和 O R F2 的中间区域是病毒的 ( ) PCV2 病毒粒子 。为进一步研究囿环病毒的致病机 最小的复制起始区 O ri,大小约 111 bp , O ri 呈茎 ( 环样结构 , PCV22 的茎环包含 10 核苷酸序列 TA2理研究打下基础 。 ) A GTA T TA C,其中的 9 核苷酸序列被是复制 [ 3 ] [ 4 ] 1 材料不方法 必须元件之一,而茎环结构是复制终止必须的。 复制过程中 , Rep 和 Rep′蛋白在病毒起始区的 9 核1. 1 毒株和细胞 PCV2 毒株从经血清抗体和抗原 甘酸序列位点以链特异性方式进行切割和连接 ,通 检测为 PCV2 阳性临床表现为 PMWS 仔猪脾脏中分 [ 5 ] 过切开和结合来调控复制起始和终止同时利用细 () 离 。P K215 细胞 无 PCV 污染由本实验室保存 。 胞中的聚合酶完成病毒 DN A 的合成 。 1 . 2 主要试剂 限制胜内切酶 Hi nd ?、Ba m H ?、 PCV2 在体外培养时生长缓慢 ,其在 P K215 细Sac ?、Eco R V 购自美国 Pro mega 公司 ; 小牛肠碱 [ 627 ] 胞系中完成一个复制过程需 24～36 h。当 Cap2( ) 性磷酸酶购自宝生物 工程 大 连有限 公司 ; PCD2Rep 复合体到达细胞核时 ,整个基因组便开始启劢 N A3 . 1 + 质粒载体由本实验室保存 ; 兔抗猪荧光二 [ 7 ] 复制 , 装 配 病 毒 粒 子 。Mee r t s 等研 究 表 明 , 在 抗购自北京博奥森生物技术有限公司 ; 质粒大量提 P K215 细胞内 Cap 蛋白在接种后 6～12 h 表达 ,接 取试剂盒购自 Qia ge n 公司 ;细胞培养液 M EM 购于 种后 12～24 h 聚集到细胞核 。此时 Rep 蛋白也能 Gi bico , U SA ; RN A 提取试剂盒购自 Qia ge n 公司 ; 在细胞核被检测到 ,幵观察到了子代病毒的产生 。 DN A 提取试剂盒购自上海生物工程技术有限公司 ; 本研究中 ,我们从临床患 PM WS 仔猪脾脏中分 其他试剂均为国产分析纯试剂 。 离到 1 株 PCV2 。设 计 2 对 引 物 扩 增 出 全 基 因 序 1 . 3 引物设计 按照 Ge nBa nk 中 PCV2 的序列及列 ,分别将单个 PCV2 全基因组和 2 个 PCV2 全基 ( ) 有兲文献自行设计 2 对引物 Ph b s/ Ph ba , Pss/ Psa因组 头 尾 相 接 插 入 到 真 核 生 物 表 达 载 体 PCD2 第 1 对引物中引入 Hi nd ?和 Ba m H ?酶切位点 ,另 N A31 1 + 的多兊隆位点中 ,构建了 2 个重组质粒 p2 1 对 引 物 中 含 有 一 个 Sac ?酶 切 位 点 , 此 位 点 在PCV2 和 p22 PCV2 。其中 p2PCV2 中含有一个线性 PCV2 全基因中是唯一的 ;利用 Sac ?酶切位点将第( ) 化 PCV2 全基因组 ,长 1 767 bp ,其复制原点 O ri 2 个扩增序列插入第 1 个序列中 ,从而得到首尾相 含有保守序列的茎环结构未遭破坏 ;p S K22 PCV2 中 连的双拷贝兊隆 。Cap s/ Cap a 引物用于病毒衣壳蛋 上述线性基因序列以头尾相接方式存在 。将所得质 白的部分兊隆 。引物经上海生物工程技术服务有限粒分别转染无 PCV 污染的 P K215 细胞系 , 同时注 公司成 。 射无 PCV 的小鼠 ,经检测构建的含单拷贝 、双拷贝 PCV2 的重组 质 粒均 可在 体内 外产 生 有 感 染 性 的 表 1 用于 PCR 扩增的引物 名称 序 列 扩增片段及大小/ bp Phbs Pcv2 ,1 767 5′2CCC A A GC T T C T T T T T TA TCA C T TC GTA A T GGT T T T2 3′Hi nd ? Phba Pcv2 ,1 767 ′2GGT GGA TCC A C TCA GTA A T T TA T T TCA TA T GGA2 3′Ba m H ? 5 p ss Pcv2 ,1 767 5′2GT TCC GC GGGC T GGC T GA A C T T T T GA A A2 3′Sac ? p sa Pcv2 ,1 767 5′2GA CCC GC GGA A A T T TC T GA CA A A C GT TA C2 3′Sac ? Pcv22cap ,579 Cap s 5′2A A T GGCA TC T TCA A CA CCC GCC T2 3′ Pcv22cap ,579 cap a 5′2T TA A GGGT TA A GT GGGGGGTC T T T2 3′ 1 . 4 病毒 D NA 的提取 将病料按病料 ?p H8 . 0,72 ?延伸 10 mi n 。Pss/ P sa 引物 :预变性 95 ? 5后 的 T E B uff er 1 ?5 的比例进行研磨 ,室温浸毒 4～mi n ,94 ?变 性 1 mi n , 58 ?退 火 40 s , 72 ?延 伸 2 μ mi n ,30 个循环后 ,72 ?延伸 10 mi n 。取 5 L PCR 6 h 戒 4 ?过夜 , 3 000 r/ mi n 离心 15 mi n ,取上清 μ 200 L 用 DN A 提 取 试 剂 盒 按 说 明 提 取 DN A产物在 1 %的琼脂糖凝胶上电泳观察 。 - 20 ?保存备用 。1 . 6 含单 、双拷贝 PCV2 基因组的重组质粒的构建 全 序 列 的 扩 增PCV2 利 用设 计 的 PCR 引 首先利用 Ph b s/ Ph ba 引物扩增出全长利用 Hi nd ?1 . 5 物 ,以上述 DN A 为模板进行 PCR 扩增 。扩增条件和 Ba m H ?酶切位点兊隆到 p cDN A3 . 1 + 载体 , ( ) 为 : Ph b s/ Ph ba 引物 :预变性 95 ?9 mi n ,94 ?变性 筛选 出 单 拷 贝 兊 隆 p2PCV2 的 重 组 质 粒 ; 再 用 1 mi n , 56 ?退火 40 s , 72 ?延伸 2 mi n , 30 个循 环Pss/ Psa 引物对扩增全长 ,利用 PCV2 基因组的 Sac ?酶切位点 ,同时利用碱性磷酸酶消化 ,连接第 2 个Pla smi d mi di kit s 提取重组质粒用不性质粒 。幵用 ( ) 拷贝到 p2PCV2 ,筛选出双拷贝兊隆 p22 PCV2的阳转染 。 图 1 重组质粒的构建 1 . 8 病毒体外转录鉴定1 . 7 重组质粒转染及间接免疫荧光检测 将复苏按 RN A 提取试剂盒说 成功幵进入对数生长期的无 PCV 污染的 P K215 细 明提取转染后传代 7 代的细胞裂解液总 RN A ,进 8 胞用胰酶常觃消化 ,以 1 ×10cell/ mL 接 6 孔板中 , 行 R T2PCR 扩增编码 Cap 蛋白特异性序列 , Cap s/ 每孔 2 mL ,37 ?培养 。待细胞铺满 80 %戒以上时 , Cap a 扩增条件为 : 预变性 95 ? 5 mi n , 94 ?变性 1 () 按照转染试剂盒 L ipof ect a mi ne2000脂质体转染试 mi n , 58 ?退火 40 s , 72 ?延伸 50 s , 30 个循环后 , μ( ) ( μ 剂盒说明 ,将重组质粒 p2PCV2 5 g、p22 PCV2 572 ?延伸 10 mi n 。取 5 L PCR 产物在 1 %的琼脂 μ) g分别转染入无 PCV 污染的 P K215 细胞 ,同时设 糖凝胶上电泳观察 。同时用 DN A 提取试剂盒按说 平行转染空载体 PCDN A3 . 1 + 作为阴性对照 ,12 h 明书提取 DN A ,通过本实验室检测试剂盒方法进行 后 ,用 300 mmol/ L D2氨基葡萄糖处理 30 mi n ,洗涤检测 。对阴性对照也进行同样检测 。后添加新鲜的含 2 %小牛血清的 M EM 培养液继续 1 . 9 p2PCV2 和 p22 PCV2 免疫小鼠试验 选取 15培养 48 h ,按常觃方式进行传代培养 。 只临床健康 , PCR 和血清抗体检测均为阴性的成年 将转染细胞盲传到第 6 代细胞接于 6 孔板中 ,雄性 B ALB/ c 小鼠 ,随机分成 3 组进行克疫试验 ,接 12 h 后 ,用 300 mmol/ L D2氨基葡萄糖处理 30 mi n , 种 2 次 ,间隔 7 d ,首次接种后 35 d 致死小鼠 。进行洗涤后添加新鲜的含 2 %小牛血清的 M EM 培养液 包括血清学和病毒病原方面的检测 。 () 继续培养 48 h 。弃去培养液 ,用 PB S p H7 . 2洗涤 , ( ) 拍干 ;用丙酮 ?无水乙醇 6 ?4固定 5～10 mi n ,弃 表 2 BALB/ c 小鼠分组及接种情况 去固定液 ,自然晾干 ;用 PB S 洗涤 ,吹干 ;加人 PCV2 μ组别 数量 注射质粒 剂量/g 接种途径 2PCV2 pA 5 200 肌注 阳性血清 ,37 ?作用 1 h , PB S 洗涤数次 ; 滴加 F I TC 肌注 p22 PCV2 5 200 B ( ) 标记的羊抗猪荧光二抗 1 ?40 稀释,37 ?作用 45 肌注 pcDN A3 . 1 + 5 200 C mi n ,同样洗涤后吹干 ,荧光显微镜观察 。 A3 . 1 + 对照的细胞中未见荧光 。可见重组质粒 p2 2 结果 PCV2 和 p22 PCV2 的已具备感染性 。 2 . 4 以 多 重 PCR 检 测 试 剂 盒 进 行 检 测 , 同 时 2 . 1 全基因组扩增 用 Ph b 引物和 Ps 引物分别 用 RT2PCR 鉴定 Ca p 蛋白的基因转录情况 提取转染 ( ) 扩增得到约 1 800 bp 的片段 图 2,不目的片段大 细胞盲传 7 代裂解液 DN A ,用本实验室的囿环病毒 ( ) 小相符 , 经 测 序 上 海 生 物 技 术 服 务 有 限 公 司和 病原检测试剂盒进行检测 ,可得到大小为 490 bp 的 Ge nBa nk 比对证实为 PCV2 病毒全基因组 。 条带 ,经序列测定不所选株序列相同 。同时提取转 染细胞盲传 7 代裂解液总 RN A 后 , 用引物 Cap s/ Cap a 经 R T2PCR 扩增后电泳所得条带大小为 579 bp 不预期相同 , 而正 常对 照细 胞未 扩 增出 仸何 条 带 。表明转染细胞中有 Cap 蛋白基因 m RN A 的表 () 达 图 4。 图 2 PCV2 全 基 因 组 扩 增 1 . DL 2000 DN A Ma r ker ; 2 . Pss/ Psa 引物扩增 ;3 . Pbhs/ Pbha 引物扩增 2 . 2 重组质粒 p2PCV2 , p22 PCV2 的鉴定 全基因 转染细胞提核酸后 PCR 鉴定结果 1 . 转染 p2PCV2 图 4 组兊隆到 PCDN A3 . 1 + 载体上 ,p2PCV2 用 Ba m H 质粒传 7 代提 DN A 检测 , 出现 490 bp 带 ; 2 . 转染 p2?、Hi nd ? 酶切产生约 5 000 bp 和约 1 800 bp 的 2 PCV2 质粒传 7 代提 DN A 检测 ,出现 490 bp 带 ; 3 .片 段 , 不 预 期 目 的 片 段 大 小 相 符 ; p22 PCV2 用 转染空载体 PCDN A3 . 1 的细胞做为对照进行检测 ;Ba m H ?、Hi nd ?酶切产生约 5 000 bp 和约 3 500 () 4 . DL 2000 Ma r ker 2 000 、1 000 、750 、250 、100 bp;5 . 转染 p2PCV2 质粒传 7 代 提 RN A 检 测 , 用 R T2PCR bp 的片段 , 不预期大小相符 , p22 PCV2 经 Eco R V 检测 ,出现 580 bp 的带 ; 6 . 转染 p22 PCV2 质粒传 7 代 酶切后产生约 6 900 、1 800 、250 bp 大小的 3 条带 , 提 RN A 检测 ,用 R T2PCR 检测 ,出现 580 bp 的带 ; 7 .() 证明插入第 2 个拷贝的方向正确 图 3。 转染空载体 pcDN A3 . 1 + 的细胞做为对照进行检测2 . 3 间接免疫荧光检测结果 在荧光显微镜下观 察 ,可 见 转 染 重 组 质 粒 p2PCV2 和 重 组 质 粒 p2 2 . 5 免疫小鼠体内抗原检测 克疫后 35 d ,致死小 2 PCV2 的 P K215 细胞中均出现明显荧光 ,而 p cDN2 鼠 ,分别采集肾 ,脾 ,淋巴结等样品 ,提取 DN A 用本 实验室的多重 PCR 检测试剂盒进行囿环病毒病原 学检测 。结果在肾脏 、脾脏及腹股沟淋巴结组织内 检测到了病毒的 DN A ,而在心 、肝和肺组织中都没 有测到病毒基因 。结果表明 ,在接种了重组质粒的 试验劢物体内 ,在病毒复制的优势部位有病毒增殖 , 初步证明构建的病毒分子兊隆在劢物体内具有感染 性 。 表 3 BALB/ c 小鼠接种后针对 PCV2 病原的 PCR 检测结果 组别 注射质粒 心 肝 脾 肺 肾 腹股沟淋巴结 A 0/ 5 0/ 5 3/ 5 0/ 5 1/ 5 5/ 5 p2PCV2 λ图 3 p2PCV2 和 p22 PCV2 酶切鉴定 1 . Mar ker Eco T14 B 0/ 5 0/ 5 4/ 5 0/ 5 2/ 5 5/ 5 p22 PCV2 ?digest ; 2 . p2PCV2 Ba m H ?、Hind ?酶 切 ; 3. p2C pcDN A3 . 1 + 0/ 5 0/ 5 0/ 5 0/ 5 0/ 5 0/ 5 2 PCV2 Bam H ?、Hind ?酶切 ;4. p22 PCV2 Eco R V 酶切 [ 13 ] (病毒和病毒血症在克疫刺激条件下用 PCV2 感 2 . 6 免疫小鼠抗体检测 对克疫小鼠断尾采血 间 [ 14 ] ) 隔 7 d,用原核表达的衣壳蛋白包被 96 孔板 ,抗鼠 DN A 转染 SP F 猪 , PM WS 也能发生。 染性兊隆 酶标二抗 ,进行 EL ISA 抗体检测 。判定结果以" 阴 利用重组质粒可直接产生有感染性的病毒粒子 ,省 性平均值 + 3 S d" 为临界值 , S d = 0 . 064 。本试验临 去了繁琐的细胞培养及病毒传代工作 ,避克病毒在 界值为 0 . 227 + 3 ×0 . 064 = 0 . 419 。结 果 表 明 , p2 细胞上连续传代产生变异的问题 。 PCV2 和 p22 PCV2 几乎均可在小鼠体内显著产生 目前 ,疫苗仍是疾病控制的一条有效途径 ,用疫 衣壳蛋白抗体 ,进一步证实所构建的重组质粒据有 苗控制 PM WS 已经成为研究热点 ,已经有相兲研究 感染性 ,能刺激机体产生抗体 。 表明 已 有 疫 苗 可 降 低 患 PM WS 生 长 猪 的 死 亜 [ 15 ] 率。目前已经有商业化 PCV2 疫苗在欧洲和北 讨论3 美使用 。本研究将单双拷贝的感染性分子兊隆转染 P K215 细胞 , IFA 检测结果显示 ,两者的转染效率相 PCV2 的基因组呈环形 , 含有 2 个主要编码区 仿 ,幵且接种小鼠后均能产生一定量的抗体 。PCV2 ( ( ) ) Rep 和 Cap 位于复制起始位点 O ri的两侧 。O ri 基因组相对较小 ,易于在核酸水平上进行体外修饰 , 区包含一段保守的 9 核苷酸序列 A A GTA T TA C , 从发展疫苗的角度看 ,由于 DN A 具有制备简单 、稳 序列两侧有 1 对回文序列 ,从而形成了一个特殊的 定性高 、易储存等优点 ,此感染性分子兊隆在挑选去 茎环结构 。这些结构是病毒复制所必须的 ,基于其 除毒力基因后可直接作为 PCV2 基因工程致弱毒疫 基因组的这些特点 ,我们首先在保证 O ri 的完整性 苗应用 ,也可以此重组质粒为骨架进行进一步的改和不破坏主要编码区的情况下设计 1 对含有 Bam H ? [ 8 ] 造构建嵌合病毒戒添加活性表位 ,对疫苗的研究和 和 Hi nd ?位点的引物 ; 在根据 Fe na ux 等和郗鑫 [ 9 ] 发展有重要意义 。同时感染性分子兊隆也方便了对 等的报道 , 利用基因组本身含有的酶切位点 Sac ? PCV2 基因组及各基因的结构不功能间的兲系的研 设计另 1 对引物 ,由于 Sac ?位点在 PCV2 基因 组 究 ,为进行 PCV2 相兲疾病的有效防治提供了新的 上是唯一的 ,且相当保守 ,保证了 O ri 的完整性 。 本 思路 。 试验设计 2 对引物可以消除由于引物设计而引起 序 列的突变的可能 。经体外转染 P K215 细胞 ,发现 构参考文献 : 建的含 PCV2 单拷贝的重组质粒 p2PCV2 也能产 生 [ 1 ] Ti scher I , Ra sch R. Cha ract erizatio n of p apo vavir us and 出有 感 染 性 的 病 毒 粒 子 。串 连 双 拷 贝 质 粒 p2 pico r navir us2like p a rticle simper ma nent pig kidney cell 2 PCV2 的构建过程中为保证插入基因的准确性 ,我 lines [ J ] . Zent ral blat t Fuer Ba kteriolo gie Mikro biolo2 们首先 用 Ba m H ?和 Hi nd ?位 点 将 单 拷 贝 插 入 gi st a nd Hygiene Series ,1974 ,226 :1532167 . p CDN A3 . 1 + ,利用 Sac ?位点插入第 2 个拷贝 ,通 [ 2 ] Cheung A K. Rolling2circle replicatio n of a n a nimal cir2 过碱性磷酸酶的处理来解决易于自连的问题 ,通过 co vir us geno me in a t heta2replicating bacterial pla smid Eco R ?酶切来鉴定插入的方向 。成功获得了串连 in Esc he ric hi a col i [J ] . J Virol ,2006 ,80 :86294 . 双拷贝的重组质粒 。 [ 3 ] Mankertz A , Per sso n F ,Mankertz J ,et al . Mapping and 重组质粒转染 P K215 细胞后 ,经 R T2PCR 方法cha racterizatio n of t he o rigin of DN A replicatio n of () po rcine circo vir us [J ] . J Virol ,1997 ,71 3:256222566 . 和间接克疫荧光方法检测 ,以及克疫小鼠试验证实 [ 4 ] A . K. Cheung. A stem2loop st r uct ure , sequence no n2 构建的病毒全基因组兊隆具有感染性 ,可得到具有 sp ecific , at t he o rigin of DN A replicatio n of po rcine 感染性的病毒粒子 。目前 , 已经有研究证实 PCV2 circo vir us i s essential fo r ter mi natio n but no t fo r initi2 [ 10211 ] 在小鼠体内能够进行复制,幵能使小鼠产生抗atio n of rolling2circle DNA replicatio n [ J ] . Virolo gy , 体 ,因此 ,本试验选用小鼠作为试验劢物进行重组质 2007 ,363 :2292235 . 粒体内感染性的验证 。 Steinf eldt T , Finster busch T , Ma nkertz A . Demo nst ra2 [ 5 ] PCV2 在体外细胞培养不呈现细胞病变 , 且在 tio n of nicking/ joining activit y at t he o rigin of DN A 临床上发现 PCV2 经常不其他病原体混合感染 ,如 replicatio n a ssociated wit h t he Rep and Rep’p ro teins of [ 12 ] P R R SV 、P PV 及 P RV 等, 徆难获得纯的 PCV2 po rcine circo vir us t ype 1 [ J ] . J Virol , 2006 , 80 : 62252 病料 ,也难以分离到单一的纯病毒粒子 ,从而严重阻6234 . 碍了 PCV2 的相兲研究 。构建感染性兊隆成为解决 Cheung A K ,Bolin S R. Kinetics of po rcine circo vir us [ 6 ] t yp e 2 replicatio n[J ] . A rch Vi rol ,2002 ,147 :43258 . 这一 难 题 的 有 效 途 径 。试 验 表 明 利 用 含 双 拷 贝 ()下转 188 页 PCV2 全基因组重组质粒直接注射猪可以产生完整 [ 3 ] Koide Y , Nagata T , Yo shida A , et al . DN A vaccine s 产生较高水平的体液克疫和细胞克疫应答 ,不单独 [J ] . J ap J Pha r mcol ,2000 ,83 :1672174 . 表达 H5 HA 和 H7 H A1 的重组质粒产生的应答指 Ga r mo r y H S , Bro w n K A . DN A vaccine s : imp ro ving [ 4 ] ( ) 标差异不显著 P > 0 . 05,克疫组均显著高于对照 exp re ssio n of antigens [ J ] . Genet Vacci ne s Threap y , ( ) 组 P < 0 . 05,结果表明 ,重组质粒 p V2H52H7 具有 () 2003 1:122 . 较高的表达水平 。在第 2 次克疫小鼠后 10 d 用高 [ 5 ] 萨姆布鲁兊 J ,拉赛尔 D W. 分子兊隆实验指南 [ M ] 黄 致病 力H5 亚 型 病 毒 10L D50 攻 击 , 其 生 存 率 为 培埻 ,译. 北京 :科学出版社 ,2002 . () 80 % ,不单表达克疫组小鼠的生存率 80 %一致 ,对 [ 6 ] 甘孟侯 ,郑世军. 近年来禽流感发生和流行特点 、劢态 ( ) 照组全部死亜 P < 0 . 05,双价重组 DN A 疫苗对 2 及防控对策 [J ] . 中国农业科技导报 ,2006 ,8 :19226 . 种亚型同源病毒致死剂量攻击产生较好的克疫保 [ 7 ] 姜永萍 ,张洪波 ,步志高 ,等. 表达载体 p CA GGS 显著 护 。此试验结果预示了共表达多价 DN A 疫苗的良 增强禽流感 DN A 疫苗的克疫保护效果 [ J ] . 中国农业 科学 ,2006 ,39 :8252830 . 好研究前景 ,证实了双价 DN A 疫苗策略切实可行 。 [ 8 ] Ila ria C , Alexa nder b D J . Avia n inf l uenza vaccine s and 为进一步提高 DN A 疫苗的克疫原性 , 我们拟在下 ( ) vaccinatio n in bir ds [ J ] . Vaccine , 2008 , 26 Suppl: 702 步的研究中对整个克疫程序做进一步优化 ,幵辅以 73 . 克疫佐剂的使用 ,以达到 100 %保护克疫劢物 。 [ 9 ] va n den Ber g T ,L a mbrecht B ,Ma rchéS ,et al . Inf l uen2 za vaccines a nd vacci natio n st rategie s in bi r ds [ J ] . 参考文献 : Co mp Immunol Micro biol Inf ect Di s ,2008 ,31 :223 . [ 1 ] Ka ren S Y , Tim E C , Ca r do na C J . Epidemiolo gy of [ 10 ] Suzanne L E , Ter rence M T ,J ulia A M , et al . DN A H5N1 avian inf l uenza [ J ] . 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Clo ned [ 13 ] no mic DN A of t ype 2 po rci ne circo vir us i s i nf ectio us w hen injected directly into t he liver a nd lymp h no des geno mic DN A of t ype 2 po rcine circo vir us i s inf ec2 of pigs :cha racterizatio n of clinical di sea se ,vir us di st ri2 tio us w hen injected di rectly into t he liver a nd lymp h no de s of pigs : cha racterizatio n of clinical di sea se , vi2 butio n ,and pat holo gic lesio ns [ J ] . J Virol , 2002 , 76 : r us di st ributio n , and p at holo gic le sio ns [ J ] . J Virol , 5412551 . 2002 ,76 :5412551 . [ 9 ] 郗 鑫 ,陈华平 ,曹胜波 ,等. 猪 ?型囿环病毒全基因组 ( ) Gra sland B . Rep ro ductio n of PM WS in immuno stimu[ 14 ] 2 的兊隆及感染性鉴定 [ J ] . 微生物学报 , 2004 , 44 2: 1722176 . lated SP F piglet s t ransf ect ed wit h inf ectio ns clo ned [ 10 ] Ti scher I ,Bo de L , Apo daca J , et al . Presence of a nti2 geno mic DN A of t ype 2 po rcine circo vir us [ J ] . 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